甘草酸的粗提工艺研究.doc

甘草酸的粗提工艺研究余 华1 陈 芳2*（1.四川出入境检验检疫局，四川成都 610041；2. 西南大学药学院，重庆 400715）2*为通讯作者。摘 要：甘草酸的提取是甘草开发和甘草应用的关键技术之一。试验以甘草的饮片为原料,乙醇作溶剂,用超声波辅助提取法提取甘草酸,研究了在超声波条件下影响提取率的几个因素：包括溶剂用量、溶剂浓度、超声时间、浸泡时间，粒度等几个方面,得到了一条操作简便、省时、提取率高、纯度较高、选择性好的工艺。最佳提取工艺为：以浓度为70%的乙醇为提取溶剂,超声作用时间60min,浸泡2h，粒度为50目。通过此工艺, 提取时间较传统提取工艺缩短，甘草酸的得率有所提高。 关键词：甘草酸；正交实验设计；超声波；提取工艺。Study on the Primary Process of GlycyrrhizicAcid Extracting from GlycyrrhizaYu hua1 Chen Fang2*(1.Sichuan Entry-Exit Inspection and Quaranting Bureau of P.R. China, Sichuan Chengdu, 610041；2. School of Pharmaceutical sciences , Southwest University, Chong qing, 400715,China )Abstract：Glycyrrhizin extraction of Radix Glycyrrhiza is one of the key technologies of the development and application of Radix Glycyrrhiza. This paper used Radix Glycyrrhiza as the raw materials, ethanol as solvents, and used ultrasound-assisted extraction from glycyrrhiza, then did research on a few factors in the impact of ultrasound under the conditions of the extraction rate including the amount of solvent, solvent concentration, ultra-dose time, soaking time, size and other factors. At last, it got a simple, time-saving, high-yield, high purity and good selective process. The best extraction process is as follows: it uses the concentration of 70 percent ethanol as the best solvent extraction；the role of ultrasound time is 60 minute；the time of soaking is 2 hours；the head size was 50. Through this process, extracting time is shorter than the traditional extraction process, and the yield of glycyrrhizin has increased.Key words: Glycyrrhizic Acid；Orthogonal experimental design ;Supersonic wave；Extraction process； 1. 前言 图1 甘草酸的结构示意图Figure 1 glycyrrhizic acid structure schematic drawing 甘草为豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎，具有清热解毒、止咳祛痰、补脾和胃、调和诸药的功效，历代草本皆视为重要药物。甘草酸作为其主要有效成分, 随产地不同含量亦不同,一般在(414)%之内，它属于三萜皂苷，甘草根及根茎含甘草甜素，为甘草酸的钾、钙盐。据现有资料报道，国内外已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物，60多种三萜类化合物以及香豆素类，多种生物碱等。在甘草酸的提取过程中要求提取快速、完全,杂质较少1。中药有效成分的提取，无论采用何种技术，提取溶剂的选择都很重要。在甘草酸的提取溶剂选中，候长军2通过数理模型，得出采用单一溶媒提取时60%乙醇的提取均值最大。谢果3也证实采用乙醇比丙酮氨水效果好，王巧娥4发现乙醇氨（乙醇10%，氨水0.5%）提取率最高。崔杏雨5等研究结果表明,乙醇10%和40%的乙醇氨溶液的提取效果明显提高，提取率比传统水提高8%，且提取率稳定。从甘草中提取甘草酸的方法很多,但很多方法成高、收率低、工艺步骤繁琐、工业化较困难。传统方法包括室温冷浸法、渗漉法、煎煮和热回流法以及索氏提取法。室温冷浸法其提取的效率较低,时间相对较长；渗漉法提取效率较冷浸法高,提取时间较长,溶剂消耗量较大；煎煮和热回流法是通过加热处理,增加甘草酸的溶解度和加快溶出速度,热回流法避免了乙醇等低沸点溶剂的挥发损失,提取效率较高；索氏提取法提取效率较高,节省溶剂,但时间相对较长6。近几年发展起来的提取方法主要有超声波提取方法，微波萃取技术，超临界流体提取法萃取技术提取甘草酸等。超声波提取方法通过对施加超声的功率,温度,浸渍时间,pH值,以及搅拌速率等参数进行了研究,认为与未施加超声场的传统方法相比,超声辅助提取可显著缩短提取时间,并获得较高的提取率。而且超声破碎过程是一个物理过程,被浸提的甘草酸在一定时间内保持不变。且超声法所用仪器简单成本较低,自动化程度高,且无环境污染,利于大规模生产。7微波其穿透力强,选择性高,加热效率高,操作简便,快速节能。潘学军8研究了微波辅助提取甘草酸的条件,发现当微波提取45min,乙醇含量为50%60% ,氨水含量为1%2%,液固比为10:1(ml/g)时,甘草酸的回收率与热回流法、索氏提取法、室温提取法等传统提取方法相当,但比传统方法更节约时间和溶剂,效率更高。超临界流体提取法萃取技术提取甘草酸，提取的效率较高,提取液的杂质少,不需要加热就能将溶质和溶剂分开,无毒、高效、并具有灭菌功能。李巧玲等9研究结果表明该法的萃取率高于冷浸法、热提法、超声波法,而萃取周期大大缩短,并且节省提取溶剂。 通过以上方法得到甘草酸的初品后，由于含有很多其他的成分，所以还需要对其进行纯化，一般的技术有反复结晶法，超滤法、结晶法、树脂法、聚酰胺法等10，这些方法均较繁琐。随着研究的不断深入，甘草酸提取纯化技术不断进步，新的技术和手段不断出现并应用，并显示了良好的发展前景。 膜分离技术是发展较快的分离技术11，该方法操作简单、无相变、能耗低,不需消耗过多的各种试剂和溶剂,提高甘草酸的提取率。大孔吸附树脂选择性好、吸附容量大、吸附速度快、机械强度高、再生处理方便、解析容易，且这种高分子聚合物不溶于任何溶剂，在常温下十分稳定，生产过程中的杂质可在使用前彻底清洗出来。冯福盛12、崔杏雨 13、刘倩14等对甘草酸的吸附容量为考核树脂吸附性能的指标进行了研究。高速逆流色谱纯化技术原理是根据样品中各组分在两相中分配能力不同，在管中移动速度也不同，因而能在溶剂间反复分配进行分离，回收率高，运行成本低。甘草酸甜素能与多种生物碱、抗生素、氨基酸等生成复盐或复方制剂，具有协同、增溶、增加药物稳定性，提高生物利用度及降低毒副作用的功效。 甘草酸的许多金属盐，人体可适当吸收，不易造成元素的积蓄中毒，常用来配制健脾开胃、止咳化痰、顺气止喘、降低血脂的良药15。甘草酸药理作用主要有以下几方面16：对消化系统的作用由组胺及幽门结扎形成的大鼠实验性溃疡无抑制作用，但除去甘草甜素的甘草浸膏对大鼠实验性溃疡有疗效； 肾上腺皮质激素样作用：对健康人及多种动物都有促进钠、水潴留的作用，长期应用可致水肿及血压升高，但亦可利用此作用治疗轻度的阿狄森氏病；解毒作用：对某些药物中毒，食物中毒，体内代谢产物中毒都有一定的解毒能力，解毒作用的有效成分为甘草甜素；抗炎症及抗过敏作用：抗炎是甘草酸类最主要的药理作用，多数报道认为，抗炎机理与抑制前列腺素等介质的作用有关；抗肝损伤；抗促癌：对病变过程中DNA损伤修复有明显的保护作用，使DNA修复功能接近正常水平，从而降低了DNA的致癌性；降低血中胆固醇：对实验性高胆固醇血症及胆固醇升高的高血压病人均有一定的降低血中胆固醇的作用； 抗艾滋病病毒作用； 免疫调节作用：甘草酸类具有非特异性免疫调节作用，其主要是增强细胞免疫作用。2.实验部分 2.1实验材料2.1.1 药品与试剂未炮制甘草切片：市售一级品北碚文戈化工产品经营部 无水乙醇：重庆川东化工有限公司（分析纯） 氨水： 重庆川东化工有限公司（分析纯）蒸馏水： 西南大学药学院实验室自制2.1.2主要 仪器与设备上海棱光755S紫外分光光度计 数显恒温水浴锅 HH-6 国华电器有限公司电子天平 JA2003A 北京赛多利斯仪器系统有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9240A 上海精宏实验设备有限公司超声波清洗器 KQ5200E 宁波新兴科器研究所 循环水式多用真空泵 SHB-S旋转蒸发器 R201D- 万能粉碎机 玻璃仪器气流烘干器 万用电炉 试管 蒸发皿 移液管 布氏漏斗锥形瓶 烧杯 容量瓶 2.1.3 原料的处理将部分甘草切片粉碎(过14目筛，50目筛) 2.2 实验方法.2.2.1供试品的制备：10.00g甘草粉溶于50ml 70%乙醇溶液,超声波处理30min后将甘草提取液置水浴蒸发挥干,然后用相应的溶剂溶解,定容到50ml，稀释约250倍，即得供试品。以相应的溶剂作参比溶液。甘草粉溶解超声波挥干定容2.2.2测定波长的选择: 将供试品在波长400200nm扫描,得吸收光谱见图1.结果表明:在200到265nm处有两处吸收峰。由于本实验仅仅是甘草中初提产物工艺的研究，在200nm处甘草中还有其他成分可能有吸收，而且溶剂本身在此波长附近也有吸收，故在参阅了大量文献的基础上得出，供试品在265nm有最大吸收，所在的谱图中第二个峰为甘草酸的吸收峰。 图2 吸收图谱Figure 2 : Absorption spectra2.3 预实验2.3.1最佳提取溶剂的选择: 表1 甘草酸不同提取溶剂所得含量的比较Table1: Content comparison of Glycyrrhizic acid in different extraction solvents溶剂干浸膏得率(%)最大吸光度(A)蒸馏水11.350.215770乙醇11.750.50630. 5氨水11.600.49130. 5稀氨水和70乙醇12.230.4743由上表结果可知,以浓度为70%乙醇溶液为提取溶液，所得的干浸膏得率和紫外最大吸收度的值最高，但氨对环境有污染，综合考虑乙醇较优，故在甘草酸的提取中,选用乙醇作提取溶剂。2.3.2提取方法的选择:以70乙醇作为提取溶剂,对以下4种提取方法进行了考察：室温静置提取法：取10.00g甘草切片,加入70乙醇100ml,静置1h，减压过滤，滤渣继续静置0.5h,过滤，合并两次滤液并定容到250 ml。 超声波辅助提取法：取10.00g甘草,加100ml70乙醇浸泡1 h,超声提取30min, 减压过滤，滤渣继续合并滤液超声提取30min, 合并两次滤液定容到250ml。醇热回流法：取10.00g甘草，加入70乙醇100ml，90。C热回流提取2次,第一次1h, 减压过滤，滤渣继续热回流0.5h,合并两次滤液定容到250ml。0.5稀氨水和70乙醇混合回流法：取10.00g甘草，加入混合溶剂100ml（按1:1比例），90。C热回流提取1h, 减压过滤，滤渣继续热回流0.5h,合并两次滤液定容到250ml。四种滤液均用相应溶剂稀释200倍在265nm测定吸收值，结果见表2表 2甘草酸不同提取方法所得含量的比较Table2: Content comparison of Glycyrrhizic acid in different extraction methods最大吸收度提取方法 测值1测值2测值3平均值室温静置浸提0.3640.3640.3670.3650超声波提取0.4980.4970.4980.497770醇热回流0.4710.4720.4720.47170.5稀氨水和 70乙醇回流0.4740.4750.4750.4747由上表结果表明超声波提取法所得的含量略高,而且，减少污染，省时、操作方便。故在甘草酸的提取中,选用超声波作为提取方法。2.4 正交试验方法:在对溶剂和提取方法初步选择后,选定浸泡时间、乙醇浓度、甘草粒度、超声时间作为考察的4个因素,每个因素各取三个水平(见表3) 进行正交试验。以紫外测定提取液中甘草酸的含量作为考查指标,所有实验均在50。C超声条件下进行，结果如下（见表3）表3 L9(34)试验因素水平Table3: L9(34)Experimental factor level因素水平A(浸泡时间，h)B(乙醇浓度，%)C(粒度，)D(超声时间，min)1150切片20227014目筛40339050目筛 602.4 .1实验步骤：分别称取10.00g甘草，浸泡后超声波辅助提取，抽滤，提取液定容到250ml，提取液取0.5ml用对应的溶液定容到25ml备用；取定容后溶液2ml用对应的溶液二次定容到8ml，即共稀释200倍，测定溶液吸光度，按照正交表重复上述操作（见表4）。2.4.2直观分析从表4中可看出，根据R值，极差越大，该因子对实验结果影响越大，各因素的影响顺序是C BAD,即粒度溶剂浓度浸泡时间超声时间。根据最大K值，对应的水平，得到最佳的提取工艺条件是A2B2C3D3。即浸泡时间2h，乙醇浓度70%，粒度为50目粉，超声时间60min。2.4. 3方差分析表4 L9（34）实验安排及实验结果Table4: L9（34）The experiment arranges and tests the result实验号因素 A值ABCD11.00001.00001.00001.00000.2032 1.00002.00002.00002.00000.3603 1.00003.00003.00002.00000.50734 2.00001.00002.00003.00000.34375 2.00002.00003.00001.00000.7096 2.00003.00001.00002.00000.20977 3.00001.00003.00002.00000.4988 3.00002.00001.00003.00000.32793.00003.00002.00001.00000.212K11.07031.04470.73971.1240 K21.26241.39600.91571.0677K31.03700.92901.71431.1780R0.22540.46700.97460.1103SS0.00990.03940.17980.0020KMAS1.26241.39601.71431.1780KMIN1.03700.92900.73971.0677yi3.36973.36973.36973.3697 表5 方差分析表Table5:Variance analytical tableSSfSFPA0.0099 2.0000 0.0049 4.8662 P0.05B0.0394 2.0000 0.0197 19.4440 P0.05C0.1798 2.0000 0.0899 88.6808 P0.05SMIN0.0010 8.0000P0.01P0.05从方差分析表5中可看出，因素B，C对结果有显著性影响，因素A和D没有显著影响。因此，在生产中必须控制好溶剂浓度和粒度两个因素。2.5结果分析讨论2.5.1提取溶剂 17 1.水提法溶剂的成本相对较低,对环境安全,操作较为简单,但该方法由于提取液富含糖及蛋白质等杂质,易被细菌或真菌污染而发霉,而且浓缩费时间,收率比较低。提取溶剂若采用稀氨水,则可与甘草酸形成铵盐而增加其水溶性,使提取效率提高,但提取过程中会有氨气逸出,易造成环境污染。2.结合氨水提取和稀醇提取的特点,采用氨性醇提取甘草酸的效果最佳,收率最高,比水提法收率高,从而节约资源、降低成本,并且避免了糖类、淀粉等水溶性杂质的混入,便于精制,适于实验室研究的定量测定。但由于其存在氨气污染等缺点,在实际工艺中需要改进加以完善。3.稀醇(乙醇50%70%) 溶液对甘草酸的溶解性较好,对植物细胞组织的穿透性也较强,多糖、蛋白质等在醇溶液中易产生沉淀,因此提取液的杂质较少,提取效率较高,不易发霉,但成本相对较高。4. 浓度为70%乙醇溶液为提取溶液,所得的干浸膏得率和最大吸收波长的值最高,由于氨气对环境有污染，综合考虑乙醇作溶剂较优，故在甘草酸的提取中,选用乙醇作提取溶剂。2.5.2提取方法. 17在甘草粗提的众多方法中,浸提法不需要加热，但提取时间长，效率低， 比较适合工业生产,乙醇回流，稀氨水乙醇混合回流提取效率虽高，但比超声波费时间，而且溶剂需要量大，步骤也较繁琐。传统方法普遍存在工艺复杂,提取精制过程周期长，产品收率低与纯度低等缺点。而超声波与其它方法相比具有高效，快速，提取效率高节约时间溶剂，能源等优点，故是比静提和回流等更好的方法。2.5.3最佳提取工艺 根据正交实验得出甘草酸提取的最佳工艺为A2B2C3D3，即浸泡时间2小时，乙醇浓度为50%，粒度50目，提取时间60min。2.5.4 结论 通过上述试验，本文得出结论如下:乙醇是甘草提取的最佳溶剂，当浓度为70，甘草粒度为50目时效果最好；药材粉碎粒度，溶剂浓度是影响提取率高低的最主要因素；综上所述，本实验的最佳工艺为：浸泡时间2h，乙醇浓度70，粒度为50目，超声提取60min。参考文献1 王照兰，杜建材，于林清等.甘草的利用价值、研究现状及存在的问题J.中国草地，2002， 24（1): 73.2