紫外-可见光谱与荧光光谱.ppt

紫外-可见光谱与荧光光谱分析方法,郭轶 2009-4-3,主要内容,光谱产生的原理 光谱仪的基本构造 光谱分析的应用 光谱仪的操作方法,光谱的产生：辐射跃迁光吸收和光发射,分子的电子光谱：通过光与分子的相互作用，基态分子吸收光跃迁到电子激发态和电子激发态发射光跃迁到基态的光物理过程,吸收光谱,发射光谱,（紫外可见吸收光谱）,（荧光光谱、磷光光谱）,分子的电子吸收光谱和电子发射光谱为电子激发态的结构、能学和动态学的研究提供了重要的信息,（1）光谱的产生,光是什么？ 分子为什么会/能吸收光？,光谱产生的原理,图：电磁波（一个小的有机分子的“尺寸”比一个波长要小得多）,作为电磁波：可对带电粒子（例如电子与核）和磁偶极子（如电子自旋和核自旋）施加电力和磁力,光是一种电磁波，可以看成是由在光传播方向上互相垂直的两个平面上相互作用的交变电场与交变磁场组成的。,偶极子,理解光与分子相互作用的关键概念是： 光的振荡电场可以使电子运动，也就是被激发的电子表现得象是一个振荡的偶极子。,在分子的电子云中任一给定点，光波引起的电场强度变化将是时间的函数 即：零 （吸引）最大值 零 （产生一个相反的场） （排斥）最大值 零,重合 （正、负电中心） 分开,图： 电场诱导产生偶极矩,i,i,净效应：瞬时偶极矩,偶极矩,光与分子之间的相互作用取决于共振能量： E E h=hc/ 光子能量：E=hv h:普朗克常数 6.62617610-34焦耳秒 v: 频率 c:光速 : 波长,电子能级的一个基本特点：能级量子化,电子的跃迁能级差约为1 20 eV，比分子振动能级差要大几十倍 kT = 25 meV 体系热能的标度,电子跃迁所处的波长范围（能量）,电子跃迁类型： （1）* 跃迁 指处于成键轨道上的电子吸收光子后被激发跃迁到*反键轨道 （2）n* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的n电子吸收能量后向*反键轨道的跃迁 （3）* 跃迁 指不饱和键中的电子吸收光波能量后跃迁到*反键轨道。 （4）n* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的n电子吸收能量后向*反键轨道的跃迁。,（2）光吸收与光发射光谱相关的一些基本概念,你做过吸收和发射光谱吗？ 你为什么要做吸收和发射光谱？ 你理解的吸收和发射光谱是什么？,吸收光谱与测试,一个基态分子M吸收能量为h的一个光子，使占据轨道的一个电子跃迁到空轨道而处于电子激发态M*，这种光激发过程可表示为 MhM*,通过吸收光谱的测定，可以确定与跃迁相关的两个轨道的能级间隔。,吸收光谱以被吸收的光子的能量(波长、波数和能量eV)为横坐标，吸光度D或、log为纵坐标，给出分子对具有不同能量光子的吸收特性。被吸收的光子能量等于激发态的能量。,吸光度,被吸收的光子的能量(波长、波数和能量eV), : 摩尔消光系数。是评价物质吸收光的能力的重要物理量,I0:入射光强度 I: 透射光强度,是分子的一个基本性质，与物质的种类和入射光的波长有关, 不依赖于浓度和光程长度。其大小与跃迁是否满足选择定则密切相关.,Lambert定律指出：被透明介质所吸收的入射光的百分数与入射光的强度无关。（激光光源除外） Beer定律指出：被吸收的光的量正比于光程中吸光分子的浓度。,LambertBeer定律,（稀溶液）,A：吸光值,(2) 能量 吸收光谱通常用吸收光的波长(nm)、波数 (cm1)或光子能量(eV)表示激发态能量。波长通常用峰值波长max(nm)，有时也可采用带边波长edge(nm)表示。,波长、波数和eV之间能量换算关系如下： (cm1) = 1/(cm) = 1107/(nm) E(eV) = 1240/(nm),OD = log(I0/I),(1) 吸光度(absorbance)或光密度(optical density),OD = 2 = 0.01,1% transmitance or 99% absorbance 98% transmitance or 2% absorbance,吸收光谱用峰值的值或者用谱带的积分强度表示吸收强度。用于表示这种积分强度的物理量是振子强度 (oscillator strength)： = 4.32 109d 4.32109max 1/2 式中max为峰值摩尔消光系数，1/2为半峰宽。 积分吸收强度与描述电子跃迁的基本理论单位振动强度有关，最大允许的跃迁强度的数值为1。应用这个方程式可以计算任何一个吸收带的振动强度，并且可以将这个计算至与1比较，来判断产生这一能带的电子跃迁是允许的还是禁阻的。,一些基本概念,（1）发色团（Chromophoric group）： 分子中能吸收紫外光或可见光的结构系统叫做发色团或色基。象C=C、C=O、CC等都是发色团。发色团的结构不同，电子跃迁类型也不同。 （2）助色团（Auxochromic group）： 有些原子或基团，本身不能吸收光波，但它与一定的发色团相连时，则可使发色团所产生的吸收峰移动，这样的原子或基团叫做助色团。如：-OH、-NH2、-SH及一些卤素等。,红移和蓝移,有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长max和吸收强度发生变化: max向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移 (或紫移)。吸收强度即摩尔吸光系数增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如图所示。,吸收光谱的测定装置示意图: 光源发射的多波长连续光经过单色仪分光，按波长顺序进入样品池，透过样品池的透射光用光电倍增管和光子计数器测定强度，用计算机控制操作并处理数据。,在双光路系统中，一个光路上为溶剂池，另一个光路上为样品池，经过单色仪的单色光交替透过两个吸收池测得log (I0 /I )随波长的变化。,吸收光谱仪,双光路分光光度计的光学系统,机械转动P使单色光以从长波到短波波长顺序连续通过出射狭缝(S2),光电倍增管（PbS光电池 长波）,实验操作相关,吸收池有石英池和光学玻璃池，石英池在紫外-可见区和近红外区的透过率很高，可测紫外-可见吸收光谱和近红外吸收光谱，光学玻璃在紫外区有吸收，不能用来测定紫外区吸收光谱。 （区分吸收池）,各种有机溶剂在紫外区有吸收，吸收端波长(nm)如下：乙腈(190)、水(191)、戊烷(190)、己烷(195)、异辛烷(197)、环己烷(198)、甲醇(203)、乙醇(204)、乙醚(215)、二氯甲烷(230)、四氢呋喃(235)、氯仿(245)、乙酸(251)、乙酸乙酯(254)、四氯化碳(266)、DMF(270)、苯(278)、甲苯(285)、四氯乙烯(290)、吡啶(305)、二硫化碳(380)和CH3NO2(380)。这些吸收带的长波区是溶剂透过光的可利用的光谱区。溶剂的极性对于吸收带的位置产生影响。 （纯化溶剂）,光致电子激发态是很活泼的,可以经过分子内辐射与无辐射跃迁回到基态，还可以与猝灭剂进行分子间能量转移、电子转移和化学反应而猝灭。,？,发射光谱与测试,荧光光谱法基本原理,分子的激发与失活 分子的多重态 单重态： 一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。 三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。,Jablonski diagram,发射光谱,磷光光谱,荧光光谱,无辐射跃迁 振动弛豫： 内转换： 系间窜越： 外转换：,荧光,磷光,荧光光谱有荧光发射谱和荧光激发谱 测定荧光发射谱时，利用激发单色仪固定激发光的波长ex， 这时只有具有ex波长的光子进入样品池，使基态分子M处于 M*。M*发射的光用发射单色仪分光，给出发射光的强度随 波长变化曲线。 测定荧光激发谱时，选择发射谱中的某个发射波长em作为观测波长, 测定不同波长的激发光对发射观测波长的贡献。,发射光,荧光光谱仪,激发光谱和荧光光谱,荧光光谱的特点： 斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处； 荧光光谱与激发波长无关。无论用=250和350nm作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同； 吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。,Em： ex202 ex20 Ex： em/220 em 20,（3）吸收光谱和发射光谱的形状,Abs,Em,A 原子,B 具有分立的支态的分子,C 具有不可分辨的支态的分子,锐线光谱,带振动结构,宽带光谱,低压气相 原子,低压气相 刚性分子,溶剂 分子,典型例子,紫外吸收光谱的应用,物质的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特征，而不是整个分子的特征。如果物质组成的变化不影响生色团和助色团，就不会显著地影响其吸收光谱，如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光谱。另外，外界因素如溶剂的改变也会影响吸收光谱，在极性溶剂中某些化合物吸收光谱的精细结构会消失，成为一个宽带。所以，只根据紫外光谱是不能完全确定物质的分子结构，还必须与红外吸收光谱、核磁共振波谱、质谱以及其他化学、物理方法共同配合才能得出可靠的结论。,1 化合物的初步鉴定,利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系，如CCCC、CCCO、苯环等。利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有效，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强。利用紫外光谱可以用来检验一些具有大的共轭体系或发色官能团的化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。,如果一个化合物在紫外区是透明的，则说明分子中不存在共轭体系，不含有醛基、酮基或溴和碘。可能是脂肪族碳氢化合物、胺、腈、醇等不含双键或环状共轭体系的化合物。 如果在210250nm有强吸收，则可能含有两个双键的共轭体系，如共轭二烯或，-不饱和酮等。同样在260，300，330nm处有高强度吸收带，在表示有三个、四个和五个共轭体系存在。 如果在260300nm有中强吸收（2001 000），则表示体系中可能有苯环存在。如果苯环上有共轭的生色基团存在时，则可以大于10 000。 如果在250300nm有弱吸收带则可能含有简单的非共轭并含有n电子的生色基团，如羰基等。,2 纯度检测,如果有机化合物在紫外可见光区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸收，则可利用紫外光谱检验化合物的纯度。如果有机化合物在紫外可见光区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸收，则可利用紫外光谱检验化合物的纯度。,在相同条件下配制样品溶液和标准溶液， 在最佳波长最佳处测得二者的吸光度A样和A标，进行比较，按式计算样品溶液中被测组分的浓度。,2.1 比较法,2.2 标准曲线,配制一系列不同浓度的标准溶液，在最佳处分别测定标准溶液的吸光度A，然后以浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标绘制出标准曲线，在完全相同的条件下测定试液的吸光度，并从标准曲线上求得试液的浓度。该法适用于大批量样品的测定。,3 定量分析,朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律是紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的理论基础，它的数学表达式为: A = l c,4 氢键强度的测定,溶剂分子与溶质分子缔合生成氢键时，对溶质分子的UV光谱有较大的影响。对于羰基化合物，根据在极性溶剂和非极性溶剂中吸收带的差别，可以近似测定氢键的强度。溶剂分子与溶质分子缔合生成氢键时，对溶质分子的UV光谱有较大的影响。对于羰基化合物，根据在极性溶剂和非极性溶剂中吸收带的差别，可以近似测定氢键的强度。,紫外/可见光谱在蛋白质研究中的应用,浓度测定 构象变化研究 相互作用研究,蛋白质主链的紫外吸收,肽键在250 nm的远紫外区有较大吸收,蛋白质浓度测定,190nm 10000 l/mol.cm 190nm比280nm大100倍 但溶剂吸收也较大,溶剂的吸收,蛋白质中氨基酸的紫外吸收光谱,1mM,0.1mM,0.1mM,二硫键在250 nm附近有弱吸收,色氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸,确定蛋白质的消光系数,可以根据蛋白质序列预测蛋白质的消光系数 ProtParam:/tools/protparam.html,Tyr的吸收谱与pH有关,pH titration can be used to determine - whether Tyr is internal or external - polarity of environment,max at pH 6: 274 nm max at pH 13: 295 nm,蛋白质构象变化研究,Absorption spectra of Poly-L-Lys HCl: random coil at pH 6.0, 25C(bold); -Helix at pH 10.8, 25C(dotted); -strand at pH 10.8, 52C(dashed).,蛋白质折叠/变性研究,核糖核酸酶,荧光法的应用 荧光法灵敏度高，检测限比吸收光谱法低13个数量级，可用于痕量分析。 选择性好，由于能发生荧光的化学体系不多。 线性范围宽。 应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。,Environmental Sensitivity,Fluorophores can be affected by a large number of environmental factors including such parameters as pH, ionic strength, non-covalent interactions, light intensity, temperature and so on. Both the excitation and emission wavelengths and the quantum yield can all be changed by environmental factors.,温度,荧光一般随温度上升而减弱 荧光实验需要恒温,Protein intrinsic fluorescence,Trp fluorescence can be selectively excited at 295-305 nm. (to avoid excitation of Tyr),Trp fluorescence is very sensitive to its local environment,It is possible to see changes in emission spectra in response to conformational changes, subunit association, substrate binding, denaturation, and anything that affects the local environment surronding the indole ring. Also, Trp appears to be uniquely sensitive to collisional quenching, either by externally added quenchers, or by nearby groups in the protein.,Fluorescence of tryptophan depends upon the dipolar nature of the solvent,Ca-parvalbumin: tryptophan is buried, 305 nm,Ca-free parvalbumin: tryptophan is exposed to solvent,Tryptophan in various solvents: hexane, trehalose glass, glycerol, water,Fluorescence spectral shifts can be very large,仪器的操作方法,一、开机前准备 1实验室温度应保持在1530之间，相对湿度应保持在45%80%之间。 2确认样品室内无样品。 二、开机 1开启总电源及UV-2550电源。 2开启计算机电源，双击桌面上的UVProbe图标进入操作系统。 3在UVProbe界面上点击Connect键，联机并初始化。整个过程需花45分钟。（电源再次打开时，需隔10分钟或更长的时间。）,SHIMADZU UV-2550型紫外可见分光光度仪操作规程,三、操作过程 1在主菜单上选择测定的方式： （1）点击Kinetics键进入动力学测定方式：一般测定吸收值随时间的变化，通常用于酶反应随时间的变化。 （2）点击Spectrum键进入光谱测定方式：可进行紫外可见近红外区的光谱测定。 （3）点击Photometric键进入光度测定（定量）方式：可进行多波长、单波长、峰高定量。校准曲线可使用多点、单点、K因子等方法。,2参数的设定：点击菜单栏上的M键，点击Measurement标签，根据提示在对话框中选择波长测定范围、扫描速度、采样间隔等参数；点击Instrument Parameters标签，选择测定种类（吸收值、透射能量、反射率）及通带（狭缝）等条件。 3基线校正：所有参数设置完成后，两个样品架均不放置样品或两个均放上同样的空白溶液，点击“Baseline”，开始进行基线校正，仪器扫描完成后，点击“ Go To WL”将波长转到800nm，点击“Auto Zero”把800nm的波长设为0。点击“Start”再次扫描，若得出曲线值均小于0.001，则认为基线平坦，若数值较大，则将800nm吸光度设为0重新进行基线扫描。 4样品测定：样品放入样品室后，点击Start键即开始测定。完成后，取一个文件名并保存。,四、报告输出 点击菜单栏上的Report键，根据需要选择报告格式。点击菜单栏上的Print preview键预览，点击菜单栏上的Print键，输出报告。 五、关机 1在UVProbe界面上点击Disconnect键，退出操作系统，并取出样品池。 2关闭UV-2550主机，关闭计算机、打印机、总电源。 3在记录本上记录本次使用情况。 六、注意事项 样品池内溶液不要超过池容积的4/5，样品池放入样品室前外部用软纸擦干。,注意事项,1.光度计灯源寿命有限，若长时间不测量，应通过UVProbe软件断开连接（点击“Disconnect”），然后关闭光度计电源。 2.使用分光光度计时要保证样品室绝对干净，小心放入样品，放入比色皿前一定要先用滤纸和擦镜纸将比色皿外表面擦干净，不要污染样品池和光度计外表面。 3.仪器自检和扫描的过程中，不要打开样品室盖。 4.软件不会自动保存数据，所有的数据要保存都必须点击“Save”或者“Save As”进行另存。否则数据会丢失。,光谱 1.打开计算机和RF-5301PC荧光分光光度计开关。 Windows启动后，双击RF-530XPC，自检。 2.从“Acquire Mode”菜单中选择Spectrum进入Spectrum模式。 (1) 从另外的数据获取模式中进入Spectrum，会自动显示光谱参数对话框。 (2) 如果当前模式已经是Spectrum模式，从“Configure”菜单中选择Parameters,可显示Spectrum Parameters对话框。（如图1）,RF-5301PC型荧光分光光度计使用方法,Spectrum Parameters Spectrum Type: Excitation Emission Synchronous Ex Wavelength: 350 nm EM Wavelength Range: Start 370 End 680 Recording Range: Low 0.000 High 50.000 Scanning Speed: Medium Sampling lnterval (nm): 0.2 Slit width(nm): EX 5 EM 5 Sensitivity: High Low Response Time sec: Auto Repeat Scan Auto File OK Cancel,图 1,3.确定所有参数后点击OK。 4.将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击开始扫描。 5.扫描结束后，会出现File Name 对话框，这时输入文件名。将光标移至Comment文本框，输入注释。点击，将数据保存。 6.点击鼠标右键，会出现一个菜单，选择Radar，从副菜单中选择Both Axes，自动建立新的图形限制。 7.如果想扩大光谱上某一特定区域，用鼠标点此区域的左上角，并拖动鼠标至我们想要扩大的区域范围。或者从含有Rader的相同菜单中选择Limit（点击鼠标右键），设定新的图形限制，在出现的对话框中输入上限及下限。 8.点击鼠标右键，读取鼠标所指位置的波长及荧光强度。之后选择Cross HairDisplay。 9.移动鼠标所指区至想要的位置。 10.选择Display删除鼠标所指区域。 11.在File菜单中选择Save，储存获得的数据。,定量分析 1.从“Acquire Mode”菜单中选择Quantitative，进入Quantitative模式，会自动显示Quantitative参数对话框。 2.按图2所示确定获得参数 当在method 下方选择“Multi Point Working Curve”时，会出现Multi Point Curve对话框。按图3所示进行选择。,Quantitative Peramelers Method: Concentration Multi point Working Curve Units: ppb EX Wavelength: 350.0 Range: 0.000 to 100.00 EM Wavelength: 450.0 Recording Range Slit Width nm: EX 5 EM 5 Low 0.000 High 1000.00 Sensitivity: High Low Response Time: Auto Auto Scan Mode Repetitions: 1 OK Cancel,图 2,Multipoint Working Curve Order of Curve Ist 2nd 3rd Zero lnterception yes No OK Cancel,图 3,3.确定所有参数后点击键。 4.将装有空白样品的样品池放入池槽中，点击设定零点。 5.将第一个标准样装入池槽中并点击，会出现Standard Sample Data Edit对话框。输入标准标准样的浓度值并点击键。 6.重复第五步继续处理第二个标准样。一旦获得了足够多的标准样数据，在屏幕上便会自动出现工作曲线。点击鼠标右键，在出现的菜单中选择RaderBoth Axes，便可自动绘图。 7.在工作曲线绘制完成后，可定量确定未知样的浓度。点击键，出现Unknown Avquisition 屏幕。 8.将装有未知样品的池放入池槽中，点击开始浓度的定量测定。 9.在File菜单中选择Save，储存获得的数据。 10.在出现的对话框中输入标准样和未知样的文件名，点击键。,时间程序 1.从“Acquire Mode”菜单中选择Time Course，进入Time Course 数据获取模式，会自动显示Time Course 参数对话框。 2.按图4所示确定获得参数。 3.确定所有参数后点击键。 4.将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击设定零点。以下步骤是基于时间进程数据是在菡馏水的Raman峰的基础上获得的假设。 5.点击Start键开始收集数据。在数据收集完之后，出现File Name对话框，输入获得的数据的文件名。移动光标至文本框，输入注释。当所有输入完成后，点击保存数据，若点击，所有输入的数据将丢失。 6.从File菜单重选择，储存获得的数据。,Time Cour