DB312010-2012食品安全地方标准火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定.pdf

DBDBDBDB 上上海海市市地地方方标标准准 DB 31/20102012 食品安全地方标准 火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因 和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法 2012-10-26 发布2012-10-26 实施 DB 31/20102012 上 海 市 食 品 药 品 监 督 管 理 局上 海 市 食 品 药 品 监 督 管 理 局发 布 DB 31/20102012 前言 本标准的附录 A、附录 B 为资料性附录。 DB 31/20102012 1 食品安全地方标准 火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于火锅酱料、汤料、调味油和固体类调味粉等火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待 因、蒂巴因的测定。 2原理 样品用水或盐酸溶液分散均匀、乙腈提取后，经盐析分层，乙腈提取液用键合硅固相萃取吸附 剂净化，离心，液相色谱串联质谱仪检测，罂粟碱、那可丁和蒂巴因采用外标法定量，吗啡和可 待因采用内标法定量。 3试剂与材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 3.1甲醇（CH3OH） ：色谱纯。 3.2乙腈（CH3CN） ：色谱纯。 3.3甲酸（HCOOH） ：色谱纯。 3.4盐酸（HCl） 。 3.5甲酸铵（HCOONH4） 。 3.6氢氧化钠（NaOH） 。 3.7无水硫酸镁（MgSO4） ：研磨后在 500 马弗炉内烘 5 h，200 时取出装瓶，贮于干燥器中，冷 却后备用。 3.8无水醋酸钠（CH3COONa） 。 3.9乙二胺-N- 丙基硅烷（PSA）填料：粒度 4070 m。 3.10C18 填料：粒度 4050 m。 3.11盐酸溶液（0.1 mol/L） ：量取盐酸（3.4）9 mL，加水至 1 L ，摇匀备用。 3.12甲酸铵溶液（10 mmol/L） ：准确称取 1.26 g 甲酸铵（3.5）溶解于适量水中，定容至 2 L，混匀 后备用。 3.13甲酸甲醇溶液（0.5 ） ：量取甲酸（3.3）1 mL，置于 200 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至 刻度，摇匀备用。 3.14氢氧化钠溶液（1 mol/L） ：准确称取 40 g 氢氧化钠（3.6）溶解于适量水中，定容至 1 L，混匀 后备用。 3.15盐酸罂粟碱、吗啡、那可丁、磷酸可待因和蒂巴因标准品：纯度不少于 98。 3.16内标物质：吗啡-D3，可待因-D3。 DB 31/20102012 2 3.17标准储备液（1.0 mg/mL） ：精密称取盐酸罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和磷酸可待因标准品适 量，用甲酸甲醇溶液（3.13）配制成罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的浓度均为 1.0 mg/mL 的溶液，作为标准储备液。4避光保存，有效期三个月。 3.18混合标准品溶液：精密吸取浓度为 1.0 mg/mL 的罂粟碱、那可丁、蒂巴因储备液各 1.0 mL 和浓 度为 1.0 mg/mL 的吗啡、可待因储备溶液各 5 mL 于 20 mL 容量瓶中，用乙腈（3.2）定容至刻度，摇 匀，即得含罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为 50 g/mL 和吗啡、可待因浓度为 250 g/mL 的混合标准品 溶液。4避光保存，有效期三个月。 3.19同位素内标工作溶液（5.0 g/mL） ：分别精密吸取内标物质（3.16）适量，用甲醇（3.1）配制 成吗啡-D3，可待因-D3 的浓度均为 5.0 g/mL 的溶液。4避光保存，有效期三个月。 3.20标准工作溶液的配制： 分别精密吸取上述混合标准品溶液 （3.18） 和同位素内标工作溶液 （3.19） 适量， 用乙腈 （3.2） 稀释成罂粟碱、 那可丁、 蒂巴因浓度为 1.0 ng/mL、 2.0 ng/mL、 5.0 ng/mL、 10.0 ng/mL、 20.0 ng/mL、 50.0 ng/mL， 吗啡、 可待因浓度为 5.0 ng/mL、 10.0 ng/mL、 25.0 ng/mL、 50.0 ng/mL、 100 ng/mL、 250 ng/mL 的系列标准工作溶液，内标溶液浓度均为 50.0 ng/mL。临用新配。 3.21甲酸乙腈溶液（0.1 ） ：量取甲酸（3.3）1 mL，加乙腈（3.2）稀释至 1 L，摇匀，过滤。 3.22甲酸甲酸铵溶液（0.1 ） ：量取甲酸（3.3）1 mL，加甲酸铵溶液（3.12）稀释至 1 L，摇匀， 过滤。 3.23滤膜：0.22 m（尼龙） 。 3.24pH 试纸：pH 114。 4仪器和设备 4.1液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源（ESI） 。 4.2分析天平：感量为 0.00001 g 和 0.01 g。 4.3离心机：10 000 转/分钟。 4.4超声波清洗器。 4.5涡旋混合器。 5分析步骤 5.1提取 5.1.1火锅酱料、汤料、调味油 称取 2 g 试样（精确至 0.01 g）于 50 mL 聚四氟乙烯具塞离心管中，加入 150 L 同位素内标工作 液 （3.19） ， 再加入 5 mL 水， 振摇使分散均匀 （酱类样品必要时可加 10 mL 水） ， 加入 15 mL 乙腈 （3.2）， 涡旋振荡 1 min，加入 6 g 无水硫酸镁（3.7）和 1.5 g 无水醋酸钠（3.8）的混合粉末（或以相当的市售 商品代替） ，迅速振摇，涡旋振荡 1 min，以 4000 转/分钟离心 5 min，取上清液待净化。 5.1.2固体类调味粉 称取 2 g 试样（精确至 0.01 g）于 50 mL 聚四氟乙烯具塞离心管中，加入 150 L 同位素内标工作 液（3.19） ，再加入 5 mL 盐酸溶液（3.11）溶液，超声处理 30 分钟，用氢氧化钠溶液调节 pH 值呈中 性，加入 15 mL 乙腈（3.2） ，涡旋振荡 1 min，加入 6 g 无水硫酸镁（3.7）和 1.5 g 无水醋酸钠（3.8） 的混合粉末（或以相当的市售商品代替） ，迅速振摇，涡旋振荡 1 min，以 4000 转/分钟离心 5 min， 取 上清液待净化。 DB 31/20102012 3 5.2净化 称取 50 mg（5 mg）PSA（3.9） ，100 mg（5 mg）无水硫酸镁（3.7） ，100 mg（5 mg）C18 粉 末（3.10）置于 2 mL 聚四氟乙烯具塞离心管中(或以相当的市售商品代替） ，移取 1.5 mL 上清液（5.1） 至此离心管中，涡旋混合 1 min，以 10 000 转/分钟离心 2 min，移取上清液，0.22 m 滤膜（3.23）过 滤，取滤液待测。 6测定 6.1参考液相色谱条件 a) 色谱柱：BEH HILIC（粒径1.7m，2.1100mm），或相当者； b) 进样量：5 L； c) 柱温：40 ； d) 流速：0.3 mL/min； e）流动相：A 相（3.21）：含 0.1%甲酸的乙腈，B 相（3.22）：含 0.1 %甲酸的 10 mmol/L 甲酸 铵溶液，按表 1 进行梯度洗脱。 表 1梯度洗脱程序 时间/minA 相/%B 相/% 0.009010 0.309010 1.008020 2.508020 3.009010 6.009010 6.2参考质谱条件 a) 离子化方式：电喷雾电离； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM） ； 雾化气、 气帘气、 辅助气、 碰撞气均为高纯氮气； 使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求， 参考条件见附录 A。 6.3定性测定 在相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液， 如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液 中的某种组分色谱峰的保留时间一致， 样品溶液的定性离子相对丰度比与浓度相当标准溶液的定性离子 相对丰度比进行比较时，相对偏差不超过表 2 规定的范围，则可判定样品中存在该组分。 表 2定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/%502050102010 允许的相对偏差/%20253050 6.4定量测定 DB 31/20102012 4 在仪器最佳状态下，对标准工作液进样，以罂粟碱、那可丁和蒂巴因的色谱峰面积为纵坐标，罂粟 碱、那可丁和蒂巴因的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，外标法定量；以吗啡和可待因的峰面积与相应 内标物峰面积的比值为纵坐标，吗啡和可待因的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，内标法定量。 在上述色谱和质谱条件下，7 种化合物的标准物质提取离子（定量）质谱图参见附录 B。 6.5空白试验 除不称取样品外，按 5.1、5.2 步骤进行后测定。 7分析结果的表述 样品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴的含量按下式计算： (1) 式中： X 试样中各待测物的含量，单位为微克每千克（g/kg） ； c 从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为微克每升（g/L） ； V 样液的提取体积，此处为 15，单位为毫升（mL） ； m 试样的质量，单位为克（g） 。 计算结果保留三位有效数字。 8方法精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20 。 9方法检出限和定量限 本标准罂粟碱、 吗啡、 那可丁、 可待因和蒂巴因的检出限分别为 8 g/kg、 40 g/kg、 8 g/kg、 40 g/kg、 8 g/kg。定量限分别为 25 g/kg、125 g/kg、25 g/kg、125 g/kg、25 g/kg。 10方法准确度 罂粟碱、那可丁和蒂巴因添加浓度范围为 25 g/kg250 g/kg，吗啡、可待因添加浓度范围为 125 g/kg1250 g/kg 时，回收率为 70 110 。 DB 31/20102012 5 附录A (资料性附录) 质谱/质谱测定参考条件 5 种生物碱及 2 个内标化合物的定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）及碰撞气能量（CE） 见表 A.1。 表 A.17 种化合物的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量 组分名称 定性离子对 （m/z） 定量离子对 （m/z） 去簇电压 （DP） /V 碰撞气能量 （CE）/eV 罂粟碱 340.4/202.2 340.4/202.292 38 340.4/171.149 吗啡 286.0/181.3 286.0/181.397 50 286.0/165.350 那可丁 414.4/220.5 414.4/220.595 30 414.4/353.334 可待因 300.4/215.2 300.4/215.290 34 300.4/165.455 蒂巴因 312.3/58.3 312.3/58.352 38 312.3/249.122 吗啡-D3 289.4/185.2 289.4/185.295 40 289.4/165.253 可待因-D3 303.5/215.3 303.5/215.380 35 303.5/165.260 DB 31/20102012 6 附录B (资料性附录) 7 种化合物标准物质的提取离子（定量）质谱图 罂粟碱m/z 340.4/202.2 吗啡 m/z 286.0/181.3 那可丁 m/z 414.4/220.5 可待因 m/z 300.4/21