氨基酸组成分析.ppt

第三章 氨基酸组成分析,氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75 200Da之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体 内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出 现D型氨基酸。 氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早 将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪，用 化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数 月的繁琐的工作。 色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。 1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰 化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、 Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年， Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析 仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是 经典的方法。,第一节 氨基酸组成分析的目的,现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给 定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液 在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白 质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分 析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。 另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况， 一种可能是蛋白质的N端封闭， 另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质 物质， 解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品 的成分。 除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学 上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。,第二节 蛋白质的水解方法,氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解，常规方法是采用 5.7mol/L盐酸在真空状况下于110水解24h，也有在150下快速水 解90min。 Waters公司有商品化仪器(水解工作台)出售。将100500mol的 蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中加入 5.7mol/L盐酸200l，含2苯酚(m/V)，将指管置于反应器中，抽真 空并充氮气反复三次(图3.1c，真空控制也是实验重复性的一项重要因 素)110保温22h。其中，苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸 (Cys)和甲硫氨酸(Met)的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键，如 ValVal，IleLeu等，水解时间可适当延长至72h，但长时间水解会 部分破坏含羟基的氨基酸丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，酪氨酸(Tyr)。,影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。 水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中 通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cyt c)、核糖核酸 酶(RNase)或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色 谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价 方法的适用性。 但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨 基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的 氨基酸含量只有12个，这影响到氨基酸的回收。生物应 用公司（ABI）曾设计过一种“测试肽”，即人工合成18种不 同氨基酸的肽(除Gln、Asn外)，这样每种氨基酸出现的频 率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以 采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情 况。,第三节 特殊氨基酸的保护和定量,不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同，但色氨酸均遭 破坏，通常解决方法有以下5种。 1.水解酸中加添加剂 这些添加剂包括琉基乙酸和-琉基乙醇，我们通过实验 认为液相水解时加入巯基乙醇对色氨酸保护效果较好，色氨 酸的回收可达80。有报道Perkin-Elmer公司针对其产品 ABI420A的特点，推出试剂十二烷基硫醇，专门保护色氨 酸，据称回收率达97。 2.有机酸 3mol/L 巯基乙磺酸(mercaptoethanesulfonic acid) 或4mol/L甲磺酸(methane-sul-fonie acid)在水解时对色 氨酸有一定的保护作用。,3碱 用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。 4酶 蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨 酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法 校正。 5光谱法 分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白 质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其 在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含 量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为0.21时的情况。酪 氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。 Hewlett Packard公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件， 能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。 虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵 敏的，但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难，解决这个问题的途径有两 种，一种是还原烷化法，另一种是氧化法。,(1)还原烷化法 产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括4乙烯 吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点，为了确保试剂接近巯 基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性 剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的 损失，特别是对于小肽和微量样品，而且烷化反应如果不仔 细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。 (2)氧化法 氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸，过 甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸 会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。为克服这一 缺点，必 须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一 次则提供其他氨基酸的组成数据。,第四节 氨基酸组成原位分析,如果蛋白质样品采用电泳法(如SDS-PAGE)分离，则很难从凝胶中洗 脱下来，可采用电印迹法把样品转移到PVDF膜上，然后在PVDF膜上直 接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位(in situ)分析。因为通常 所用聚丙烯酰胺凝胶分离系统中含大量甘氨酸和Tris盐，易干扰氨基酸 原位分析，故改用CAPS缓冲系统以减少影响。另外，在膜上做氨基酸 组成分析时可以做一个空白对照，具体操作时将含蛋白条带的PVDF膜 割下，另取一条相同面积的转移膜作为空白，分别置于水解指管中,加入 70l含7(m/V)巯基乙酸的6mol/L盐酸以防止抽真空时膜片的漂 出，将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入200l含7巯基 乙酸的6mol/L盐酸，110真空水解24h，水解结束后用200l含30 甲醇的0.1mol/L盐酸反复三次将氨基酸从PVDF膜中抽提出来，以便 进行下一步的分析。,第五节 衍生方法及原理,从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后反应法和柱前衍生法两大 类。前一种方法是将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再与显 色剂(茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛)作用，这种方法比较稳定，对样品 预处理要求低，容易定量和自动化操作，不足之处在于检测灵敏度不高 (100pmol以上)，分析时间长(蛋白质水解液需1h而某些生理样品则需 4h以上)。另一种方法是将氨基酸和化学耦联试剂先反应生成氨基酸的 衍生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接检测衍生物的光吸收 或荧光发射，此法可检测OPA-、PTC、PTH、DABS、Dansyl- 和DABTH-氨基酸，分析灵敏度高，可利用HPLC进行氨基酸分析，缺 点是有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨基酸检测。 以下是几种常见的氨基酸分析方法。,(1)茚三酮法 Spackman等人最早将茚三酮试剂运用到氨基酸组成分 析上。离子交换层析后，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色 化合物，最大光吸收在570nm，摩尔消光系数2X104，茚 三酮和二级胺(脯氨酸和羟脯氨酸)形成黄色产物，在 440nm检出，摩尔消光系数3X103。目前此法的灵敏度可 达100pmol，但茚三酮试剂易氧化，必须隔绝空气避光保 存，试剂本身黏性大，需要有个柱后混合器才能与氨基酸充 分反应，对仪器要求较高。,(2)柱后荧光胺法 20世纪70年代合成了荧光胺，它能在室温下迅速和一级 胺发生反应，其荧光产物的激发波长Ex390nm，发射波长 Em475nm。次级胺可以用N-Chlorosuccinimide(NCS) 氧化生成相应的初级胺后再与荧光胺反应而检出。,(3)邻苯二甲醛(OPA)法 OPA最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐渐应用于柱前反 应中。 OPA能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很强荧光的异 吲哚衍生物，反应迅速，在室温下1min即可完成，反应络合物的 Ex340360nm，Em455nm，灵敏度比茚三酮法高，在 OPA中加入 SDS或表面活性剂Brij35，不但能提高赖氨酸和羟赖氨酸的稳定性， 而且能提高它们的荧光度。缺点是不能检测次级氨基酸，但可用稀的 Na-hypochlorite在碱性条件下氧化成相应的一级胺，然后再与OPA反 应。 0PA/FMOC作为柱前衍生剂能同时与一级胺和二级胺反应，室温下只 需几分钟，Hewlett Packard公司改用巯基丙酸(3-MPA)引代替巯基乙 醇。由于3-MPA的加入，异吲哚衍生物疏水性降低，使出峰时间提前， 过量的FMOC及其分解产物的出峰时间在最后，被洗脱出的次级氨基酸 之后，不干扰分析结果。,(4)PTC-AA分析法 属柱前衍生法，源于Edman降解法测定蛋白质的一级结 构。异硫氰酸苯酯(PITC)能在碱性条件下和氨基酸反应， 生成PTC-AA，此法分析灵敏度和荧光胺、OPA的荧光法 相同，优点是能同时检出初级和次级氨基酸，在254nm检 出，缺点是操作繁琐，水和盐的副反应敏感，要求较高的操 作技术。,(5)Dansyl-Cl法 能与所有氨基酸柱前反应形成高稳定性的荧光产物，但反 应耗时。 (6)Dabsyl-Cl法 灵敏度是Dansyl-Cl法1/5，但由于反应产生有色衍生 物，能方便地在254nm和425nm处用紫外检测。有报道用 DABITC代替Dabsyl-Cl，反应产生DABTH-AA，在酸性 环境中显红色，易在254nm，269nm和436nm检测。,第七节 结 语 影响氨基酸分析准确性和重复性的因素有三个： 一是样品的水解。水解时间、水解温度、真空度、样品是否被氧化等，都影响实验的结果； 二是氨基酸的有