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贵州农 业科学2 0 1 1 , 3 9 ( 7 ) : 1 8 4 -1 8 7 Gui z h ou Agr i c ul t ur a l S c i e nc e s 文章编号 1 O O l 一 3 6 0 1 ( 2 0 1 1 ) 0 7 0 4 5 6 0 1 8 4 0 4 二甲基亚砜法提取海洋红酵母 I;一 胡萝 卜 素的最佳工艺 周鲜娇 ,吴雪梅 ( 湛 江师范学院 生命科学与技术学 院,广东 湛江 , 5 2 4 0 4 8 ) 摘 要为 了进一步探 明二 甲基 亚砜 法( D MS O法) 提取海洋红酵母 中 J3 一 胡萝 卜 素的最佳工艺, 进而为 海洋红酵母 中 B 一 胡萝 卜素的工业化生产提供可靠的理论依据 , 采用 D MS O法研 究了温度 、 时间和料液比等 因素对酵母 菌株 HN 一 3中 p 一 胡萝 卜 素提取的影响。结果表明, 用 D MS O法提取海洋红酵母 中 p 一 胡萝 卜素的 最佳条件为: 料液比 1: 2 5 , 提取 时间 6 0 mi n , 提取温度 3 O 。在此条件下提取的 色素量高达3 4 5 7 p - g g , 比 单因素条件下提取的( 3 0 7 9 g g g ) 高 1 O 9 3 。试验建立了海洋红酵母 I3 一 胡萝 卜素提取的最佳工艺, 为海洋 红酵母 G 一 胡萝 卜素的高效提取奠定了基础。 关键词海洋红酵母 ; J3 一 胡萝 卜 素 ;二甲基亚砜 法 中图分类号$ 9 1 7 1 文献标识码A T h e 0p t i mu m E x t r a c t i o n T e c h n o l o g y o f B c a r o t e n e f r o m JRh o d ot or u l a be nt h i c ( b y DMS0 Me t h od Z H OU X i a n j i a o , W U X u e me i ( S c h o o l o f Li fe S c i e n c e s a n d T e c h n o l o g y,Z h a n j i a n g No r ma l U n i v e r s i t y,Z h a n j i a n g,Gu a n g d o n g 5 2 4 0 4 8,C h i n a) Ab s t r a c t :Ef f e c t s o f t e mp e r a t u r e ,t i me a n d s o l i d l i q u i d r a t i o o n t h e e x t r a c t i o n o f 7 - c a r o t e n e f r o m Rh o d o t o r u l a b e n t h i c a ( HN一 3) we r e s t u d i e d b y DMS O me t h o d t o f i n d o u t t h e o p t i mu m e x t r a c t i o n t e c h n o l o g y a n d p r o v i d e a r e l i a b l e t h e o r e t i c a l b a s i s f o r i n d u s t r i a l p r o d u c t i o n o f G c a r o t e n e f r o m Rh o do t o r u l a b e n t h i c a Th e r e s u l t s s h o we d t h a t t h e o p t i mu m c o n d i t i o n s i n c l u d e d s o l i d l i q u i d r a t i o 1:2 5 ,e x t r a c t i o n t i me 6 0 mi n a n d e x t r a c t i o n t e mp e r a t u r e 3 0 , t h e a mo u n t o f 8 一 c a r o t e n e c o u l d b e u p t o 3 4 5 7 g g ,1 0 9 3 Y 00 h i g h e r t h a n t h a t e x t r a c t e d u n d e r s i n g l e f a c t o r c o n d i t i o n ( 3 0 7 9 , g g ) T h e o p t mi u m e x t r a c t i o n t e c h n o l o g y l a i d t h e f o und a t i on f or e f f i c i e nt e x t r a c t i on o f e c a r o t e ne f r o m Rho do t o r u l a b e n t hi c a Ke y wo r d s :Rh o do t o r ul a b e n t h i c a;8 一 c a r ot e ne ;DM SO me t ho d 8 一 胡萝 卜素是一种橘黄色脂溶性化合物, 它是 类胡萝 卜素之一 , 是动物的 V 前体 , 具有抗氧化_ 1 、 促进机体生 长和增强机体免疫力l_ 2 的功能, 被 广泛 应用于食品工业 、 医药、 保健品、 化妆品和饲料 添加 剂等方面 。目前 , B 一 胡萝 卜 素 的获得有 2种方式 : 一 种是化学合成 , 一种是天然萃取。化学合成 8 一 胡萝 卜 素在安全性方面受到多方面的质疑, 相 比化 学合 成 一 胡萝 卜 素 , 天然萃取 一 胡萝 卜 素具有无毒 、 安全 系数高等优点而备受人们的青 睐。I3 一 胡萝 卜 素天然 萃取法有天然植物萃取法l 3 、 盐藻养殖 提取 4 和微 生物发酵法等。前 2者受时间、 地理位置、 生长环境 的限制 , 原材料的获得受到一定的限制 , 提取的成本 偏高, 而微生物发酵法不 受时 间、 地点和空 间的 限 制 , 具有生长周期短 , 容易培养 , 菌体无毒 , 易于形成 工业化生产等优点。微生物发酵法一般采用的微生 物有三孢布拉霉菌 和红酵母 6 。海洋红酵母是海 洋环境 中的重要微生物资源 , 其细胞 内存有丰富的 B 一 胡萝 卜素。因此, 研究海洋红酵母 j3 一 胡萝 卜 素 提 取条件对海洋红酵母的开发和利用具有很重要 的实 用价值。对于红酵母色素 的提取 , 前人采用各种不 同的方法l_ 7 。 妇 如酸热法 、 机械法、 细胞 自溶法 、 微波 法和 DMS O法等进行研究 , 但对于二 甲基亚砜法提 取条件的研 究未见有报道 。二 甲基亚砜法 操作简 单 , 提取率相 比其他方法要高, 可 以省去很多繁琐的 破壁环节 , 适合于工业化大规模生产 。因此, 作者以 海 洋红酵 母 为试验 材 料 , 研 究 DMS O 法 对海 洋 红酵 母中 J3 一 胡萝 卜 素的提取效果 , 找出最佳提取工艺 , 旨 在为海洋红酵母中色素的开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1 1 材 料 与试剂 红酵母 , 湛江东海岛海泥中分离, 由本试验室纯 化并保存 , 命名 为 HN 一 3红酵母 ; 8 一 胡萝 卜素标 准 品, 分析纯 , 购买 于 F l u c k公 司; 二 甲基 亚砜 , 葡萄 糖 , 酵母粉 , 蛋 白胨等均为分析纯 , 购买于湛江东泰 试剂公司; 海水 , 购 自东方水产品批发市场 。 1 2 仪器 与设 备 可见分光光度计 7 2 3 N, 上海精密科学仪器有限 公司; 低速大容量多管离心机 L X J - I I B, 上海安亭科 学仪器厂; 恒温振荡器 CHZ 一 8 Z A, 广州广一科学仪 收稿 日期 2 0 1 0 1 2 - 2 2 ;2 0 1 1 0 4 2 2修回 基金项 目 湛江师范学院 自然科 学研究项 目“ 酵母菌处理水产养殖水质 的应用研究” ( QL 0 6 0 4 ) ; 湛江市科技攻关计划“ 海洋红 酵母 色素的 研究” 湛科( 2 0 0 9 ) 6 4 3 作者简介 NNN( 1 9 7 6 -) , 女 , 硕士研究生 , 实验师 , 研 究方 向 : 酶 与发酵 工程 。E - ma i l : z h o u x i a n j i a o 1 6 3 c o rn 第 7 期 罗克 明 等二 甲基亚砜法 提取 海洋红酵母 口 _ 胡萝 卜 素的最佳工艺 器有限公司 ; 洁净工作 台 S W C J C, 上海博迅实业 有限公 司医疗设备厂; 仪表恒温水浴锅 S L型 , 上海 树立仪器有限公司; 快速混匀器 S K一 1 , 常州澳华仪 器有限公司; 立式压力蒸汽灭菌器 Y XQ L S 一 7 5 S I I , 上 海博 迅实 业有 限公 司 医疗设 备厂 。 1 3 试 验方 法 1 3 1 菌体 的培 养 1 ) 酵 母 浸 出 粉 胨 葡 萄 糖 液 体 培 养 基 ( Y P D 口 ) : 葡 萄 糖 2 0 g , 蛋 白胨 2 0 g , 酵 母 粉 1 0 g , 陈海水 1 0 0 mL, 1 1 5 下灭菌 3 0 rai n 。 2 )菌体的获得: 从保种斜面培养基上挑 2环菌 体接入装有 3 0 mL YP D液体培养基的 3 0 0 mL三角 瓶中, 置于 1 3 0 r rai n 、 3 0 的恒 温摇 床 中振荡培养 4 8 h获得红酵母母液 , 在同样条件下, 将 0 5 mL新 鲜红酵母母液转接到装有 1 0 0 mL YP D液体培养基 的 5 0 0 n i L三角瓶 中进行扩大发酵培养 。将培养好 的发 酵 液 于 4 8 0 0 r rai n下 离 心 1 0 rai n , 弃 上 清 液 , 获得湿菌体 。 1 3 2 海洋红酵母 色素的鉴定取色素提取液于 7 2 3 N可见分光光度计下进行扫描 , 测出其最大吸收 波长, 同时与 8 一 胡萝 卜素标准 品( F l u c k公 司生产) 扫描曲线进行对 比。 1 _ 3 3 8 一 胡萝 卜素标准品的标准 曲线制作 用二 甲基亚砜溶解 胡萝 卜素标准品 ( F l u c k公 司) , 用 分 光光 度 计 在 4 7 5 n r n进 行 测 定 , 并 以 浓 度 ( mg mL ) 为横坐标 , 吸光度 A为纵坐标 , 绘制 出相应的 胡萝 卜 素标准品吸光度曲线。 1 3 4 单 因素试 验 采用二 甲基亚砜法提取海 洋红 酵母色素。研究温度、 时间和料液比对酵母菌株 HN - 3 中 胡萝 卜 素提取的影响, 确定最佳单因素条件。 1 3 5 B 一 胡萝 卜素提取量的测定将 由各个因素 提取的类胡萝 卜素在 4 7 5 H I T I 下 所测 的 OD值利用 p 一 胡萝 卜 素标准曲线 回归方程计算出 p 一 胡萝 卜 素的 产量 。 1 3 6 正交试验根据本试验 中温度、 时 问和料 液 比最 佳 值 的确定 , 进 行 3因素 3水 平 正交 试 验 ( 表 1 ) 。 表 1 红酵 母色素研究因子及水平 Ta b l e 1 Th e f a c t o r s a n d l e v e l s i n t h e t e s t 2 结果与分析 2 1 样品中色素和标准品 p 一 胡萝 卜素的吸收光谱 经测定样 品中的主要色素在 4 7 5 n m处有最大 吸收峰( 图 1 ) , 这与 J3 一 胡萝 卜 素标准品在 4 7 5 n m处 波 长 Wa v e le n g t h 图 1 胡萝 卜素标准品和样品 中类胡萝 卜素的吸收光谱 F i g 1 Th e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f 13 - e a r o t e n e i n s t a n d a r d s u b s t a n c e a n d c a r o t e n o i d i n s a mp l e 有最大吸收峰相吻合。因此, 可初步确定该主要色 素为 J3 一 胡萝 卜 素 , 同时确定 4 7 5 n m为本试验 的样品 色素的最佳检测波长。 2 2 f | _ 胡萝 卜 素标准品的标准 曲线 在一定范 围 内( j3 一 胡萝 卜素 的浓 度在 0 0 3 mg L ) , 在 4 7 5 n m处 , J3 一 胡萝 卜素 的浓度与其 吸光 度呈线性关系 ( 图 2 ) , 经拟合获得 以二 甲基亚砜为 溶剂时的 回归 方程 : y=3 1 4 1 7 z+0 0 0 9 3 , R。 一 0 9 8 6 2 。同时还可以通 过色素溶液 吸光度测定值 确定溶液中 p 一 胡萝 卜素的浓度 , 进而计算 出 B 一 胡萝 卜 素的含量 。 O 5 粤 。 4 g 0 0 3 O2 0 1 O 0 0 o o 2 0 0 0 4 0 0 o 6 0 0 0 8 0 O 1 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 色素浓度 ( m g m L ) C o n c e n t r a t i o n 图 2 胡萝 卜 素标 准曲线 F i g 2 Th e s t a n d a r d c a r v e o f - c a r o t e n e 2 3 提取 温 度 、 时 间 、 最佳 料 液 比的确 定 2 3 1 温度 当温度从 2 5 升 高到 4 5 时 ( 图 3 ) , 海洋红酵母 中 8 _ 胡萝 卜素的提取量呈先上升后 下降的趋势 , 提取温度为 3 O 时, 从 海洋红酵母 中 提取的色素量最大 。这主要是由于高温对色素的稳 定具 有一 定 的破坏 作 用 , 低 温 对 酵母 的破 壁 效 果 不 佳 , 色 素 提取不 完全 。 2 3 2 时 间 当 提 取 时 间在 3 O 6 0 rai n时 , 色 素 提取量相差不大( 图 3 ) 。超过 6 0 rai n时 , 色素提取 量呈下 降趋势 , 其 中主要是 由于色素可能在 3 O 6 O rai n完全提取 , 时间越长, 对于提取出的色素的稳 定性不利 , 色 素易 氧化变 性。本 试验 提取 时间 为 4 5 rai n时类胡萝 卜 素产量最高。 2 3 3 料液比 料液 比在提取工艺 中是一个非常 关键 的参数 , 在工业化生产中, 料液比的大小决定着 提取原料的合理应用 。这对于工业化生产成本最低 化 和 利润 最大 化起 到非 常关 键 的作用 。 由图 3 可 贵州 农 业科 学 3 UU 八 一、 、 25O 一、 2oo 150 1 00 。 5 O I l l l 1 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 温度 , Te mp er a t u r e 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1: 2 0 1:2 7 1:3 4 1: 4 1 时间 m i n 料液比, ( g g ) T i me S o l i d - l i q u i d r a t i o 图 3 温度、 时间和 料液 比对 色素的提取效果 Fi g 3 Ef f e c t o f t e mp e r a t u r e ,t i me a n d s o l i d l i q u i d r a t i o o n e x t r a c t i o n o f 0 - c a r o t e n e 知 , 当料液比为 1 : 3 0时, 提取效果最佳 。提取溶剂 取量 最 高 的 一 组 ( 3 0 7 9 F g g ) 的试 验结 果 还 高 的增加不利于生产成本 , 同时也有可能会提取 出更 1 O 9 3 9 6 , 此试验结果与正交优化试验结果相符。 多别的胞内产物, 使色素提取纯度下降 , 色素含量相 对 减少 。 2 4 最 佳提 取工 艺 的正 交试验 按照 1 3 6的设计 , 对红酵母色素 的提取做正 交试验 , 以获得最佳提取条件 。由表 2看出, 影响因 子大小为温度料液r E 时间。红酵母色素提取的 最优方案组合是 C 。 A , 即: 温度 3 0 。C, 料液 比为 1 : 2 5 , 提取时间为 6 0 mi n 。但此最优条件搭 配不在 正交试验 9个试验 中, 是 否真正为最优还需要 实际 验 证 。 表 2 红酵母色素提取的正 交试验结 果 Ta b l e 2 Th e o r t h o g o n a l t e s t r e s u l t s o f e x t r a c t i o n o f c a r ot e n e f r o m Rho do t o r ul a b e nt hi c a 表 3 红酵母色素最佳提取条件的验证结果 Ta b l e 3 Ve r i f i c a t i o n r e s u l t s o f t h e o p t i mu m e x t r a c t i o n c o n d i t io n s g g g 根据正交试 验所确定 的最佳提取方案, 进行 3 个平行试验 , 对正交结 果进行 验证 , 结果 ( 表 3 ) 看 出, 验证的试验结果 比正交试验 中的红酵母色素提 3 结论 红酵母色素提取 的各因素影响按 大小次序为: 温度一料液比一提取时间; 提取的最佳条件是: 料液 比 1: 2 5 , 提 取 时 间 6 0 mi n , 提 取 温 度 3 O ; 在 此 优 化条件下提取 的色素量高达 3 4 5 7 g g , 比单 因素 条件 ( 3 0 7 9 g g g ) 提取量高 出 1 O 9 3 。 目前对于 红酵母中色素 的提取方法很多, 由于 DMS O具有很 强的细胞通透性 , 相比其他方法来讲 , 可以省去提取 过程 中的破壁 环节 , 该 方法 比较 简单便 捷 , 而且试 验 结果 的重现性好 、 准确度高、 提取率也 高, 具有一定 的实用价值 。 参 考 文 献 1 冯俊 , 邓斐月 , 余 燕玲 , 等 微 囊化 胡萝 素对 妊 娠母猪繁殖 、 免疫和抗氧化功能的影响 J 浙江 大学 学报 : 农业与生命科学版 , 2 0 0 9 , 3 5 ( 6 ) : 6 6 5 6 6 9 2 白东清 , 闫珊珊 , 吴旋 , 等 B 一 胡萝 卜 素 对红 白锦 鲤 生长 、 体色及代 谢 的初步研 究 J 天津 农学 院学 报 , 2 0 1 0 , 3 ( 1 7 ) : 1 - 5 3 陈业 高 天然植物食用色素 的研究概况 J 生物学杂 志 , 1 9 9 5 , 6 3 ( 1 ) : 3 2 3 4 4 牟 春 琳 , 郝 晓华 , 刘 鑫 , 等 类 胡 萝 卜素 细 胞 工 厂杜 氏 藻 养 殖 研 究 进 展 J 海 洋 科 学 进 展 , 2 O 1 O, 2 8 ( 4 ) : 5 5 4 - 5 6 2 5 潘鹏 , 杨斯 , 蔡俊 三孢 布拉 霉菌产 8 一 胡萝 卜素 发酵条件的研究 J 食 品与发 酵科技 , 2 0 1 0 , 4 6 ( 4 ) : 3 6 4 O 6 涂俊铭 , 徐平 红酵母 RY - 2 0 0 1 产类 胡 萝 卜素 的研 究 J 湖北师范学院学报, 2 0 0 4 , 2 4 ( 1 ) : 6 5 6 8 7 王岁楼, 张鑫, 张平之 红酵母类胡萝 卜 素提取方法 研究 J 食 品机械 , 2 0 0 0 ( 6 ) : 3 0 3 1 8 徐海 , 钱卫, 高 东, 等 红酵母产生类胡萝 卜素 的研究 E J 工业微生物 , 1 9 9 7 , 2 7 ( 3 ) : 2 4 3 1 9 张亮 红酵母 色素的提 取 、 分离及 其抗 氧化功 能 的 研究E D - I 天津科技 大学 , 2 0 0 7 E l O 周鲜娇 , 马家丽 , 吴雪梅 海洋 红酵母 色素不同提取方 瑚 o j0善口0H 芑 一 i ) 删 第 7 期 罗克明 等二 甲基亚砜法提取海洋红酵母 G 一 胡 萝 卜素的最佳工艺 1 8 7 法 的比较E J 食 品工业科技 , 2 0 0 9 , 3 ( 3 O ) : 2 8 4 2 8 7 3 5 3 1 1 1 B h o s a l e P , G a d r e R V Ma n i p u l a t i o n o f t e mp e r a t u r e E 1 2 周德庆 微生物学实验手册 I- M 上 海 : 上海科 学技术 a n d i l l u mi n a t i o n c o n d i t i o n s f o r e n h a n c e d b e t a c a r o 一 出版社 , 1 9 8 6 t e n e p r o d u c t i o n b y mu t a n t 3 2 o f R h o d o t o r u l a g l u t i n i ( 责任编辑 :王 海 ) L t t e r i n J Ap p l i e d Mi c r o b i o l o g y , 2 0 0 2 , 3 4 ( 5 ) : 3 4 9 一 七 女 七 女 七 弋 七 七 七 七 七 七 七 七 七 七 七 七 电 ( 上接 第 1 8 3页 ) 山茶科( 3 5 2 3 9 3种) , 也有 种数 比较少 的科 , 如美 人蕉科( 9 种) 。温带分布科 1 8科 , 以北温带分布最 多, 占 1 2科, 如柏科 、 百合科、 悬铃 木科、 金 丝桃科 等; 北温带和南温带间断分布 7科 , 欧亚和南美洲温 带间断分布 1 科 即小蘖科。中国特有分布 1科, 即 银杏科 。 3 结论与讨论 通过对玉溪聂耳公园种子植物的调查及科的分 布区类型统计 , 玉溪聂耳公 园种子植物区系特征为: 1 )区系组成丰富。公园内共有种子植物 7 7科 , 1 3 3 属 , 1 8 3种。其 中, 裸子植物 8科 1 7属 2 3种 ; 被子 植物 6 9科 1 1 6属 1 6 0种 , 其 中双子叶植物 占大多 数 , 且以木本植物为主, 优势种明显 。2 )优势科

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