Biolog微生物自动分析系统在乳杆菌鉴定中的应用.pdf

收稿日期: 2008 - 03 - 25 基金项目:江西省重点科技计划资助项目(赣科发计字(2006) 53号) 作者简介:曾哲灵(1965 - ) ,男,博士,教授 1 文章编号: 1006 - 0464(2008) 04 - 0385 - 04 Bi olog微生物自动分析系统在乳杆菌鉴定中的应用 曾哲灵,罗 敏,梁丽军 (南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047) 摘 要:利用Biolog微生物自动分析系统,对3种乳杆菌进行鉴定分析。 结果表明:Biolog微生物自动分析系统可快 速测定出供试乳杆菌菌株的特性参数(PROB、SI M、D IST)和供试乳杆菌菌株对95种碳源的利用情况,并可直接根 据供试乳杆菌菌株的特性参数将供试乳杆菌菌株准确鉴定到乳杆菌属水平、 部分供试乳杆菌菌株准确鉴定到种水 平。 根据供试乳杆菌菌株的特性参数,结合供试乳杆菌菌株对95种碳源的利用情况,可将所有供试乳杆菌菌株准确 鉴定到种水平。 可作为乳杆菌制品质量控制及快速鉴定的有效手段。 关键词:Biolog微生物自动分析系统;乳杆菌;鉴定 中图分类号:Q93 - 331 文献标识码:A 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、 类干酪乳杆 菌(Lactobacillusparacasei)及 鼠 李 糖 乳 杆 菌 (Lactobacillus rham nosus)均为乳杆菌属细菌,是常 见的益生菌,其种的分类学地位是随着分类学技术 的发展而变迁的 1- 3 。 随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应 用,微生物菌种鉴定已进入基于仪器自动化分析阶 段 4 。 B iolog微生物自动分析系统是近20年才推出 的商品化微生物自动鉴定系统,该系统主要是根据 细菌对95种碳源的利用情况及其数据库内信息,经 计算机分析比较,实现对待测菌的鉴定,已成为国际 上细菌分类鉴定的常用技术手段 5- 6 。 本实验采用 Biolog微生物自动分析系统对已知干酪乳杆菌、 类 干酪乳杆菌类干酪亚种及鼠李糖乳杆菌进行复核鉴 定,分析该系统在这3种乳杆菌鉴定中的应用效果。 1 材料与方法 111 供试菌株 供试乳杆菌菌株为干酪乳杆菌ATCC 393 T、 ATCC 15008、JCM 8129,类干酪乳杆菌类干酪亚种 JCM 1053、JCM 1111,鼠李糖乳杆菌NBRC 3425 T、 ATCC8530、ATCC10863、ATCC11981、ATCC 53103。 112 MRS培养基 蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,酵母浸膏5 g,乙酸钠 5 g,柠檬酸氢二铵2 g,牛肉膏10 g, Tween - 80 1 mL, K2HPO42 g,MnSO44H2O 0. 25 g,蒸馏水 1 000 mL, pH 7. 2。 113 BUA + B培养基 按制备1 000 mL培养基计,称取51. 7 gBUA培 养基, 950 mL纯净水、 蒸馏水或去离子水置于容器 中,轻微煮沸,搅拌以溶解琼脂和其它组份;冷却后 调整pH值至7. 20. 1 (25) ; 121灭菌15 min; 冷却至4550,加50 mL新鲜的脱纤羊血,摇匀, 倒平板。 114 仪器设备 B iolog微生物自动分析系统(Biolog读数仪和 4. 2版B iologM icrostation系统 ) , 浊度计, 8头电动 移液器,厌氧手套箱,超净工作台,恒温培养箱,厌氧 培养罐,厌氧菌鉴定微平板,厌氧菌浊度标准管,厌 氧菌接种液试管等。 115 数据测定 1. 5. 1 菌株复活 在厌氧手套箱中,从供试乳杆 菌菌株,在MRS液体培养基中活化两代,然后在 BUA + B平板上划线, 37厌氧条件下培养48 h。 1. 5. 3 菌悬液制备 在超净工作台中,使用无菌 棉签从在BUA + B平板表面蘸取菌体,转入厌氧菌 接种液试管内,翻转厌氧菌接种液试管,令菌体扩散 到厌氧菌接种液中,并插入浊度计读数,若读数 (67 1) % ,则继续加入菌体,若读数 0.5,且ID1与ID2的D IST值相差2.0以上时, ID1准 确可信,采纳系统默认鉴定结果;当ID1的S I M值接 近0.5,或者ID1与ID2的D IST值相差不到2.0时, 不采纳系统默认鉴定结果, ID1和ID2均作为参考结 果。 根据表1和表2可知:菌株ATCC393 T、 JCM 8129、JCM1053、NBRC3425 T、 ATCC8530、ATCC 10863、ATCC11981可参考结果中ID均准确可信,且 B iolog系统默认鉴定结果与菌株原名称相符;菌株 ATCC15008、JCM1111、ATCC53103D IST 2.0, 不能准确鉴定到种, ID1和ID2均作为参考结果,且 683南昌大学学报(理科版)2008年 B iolog系统默认鉴定结果与菌株原名称不相符。 212 供试乳杆菌菌株的碳源利用分析及进一步区 分鉴定 B iolog厌氧菌鉴定微平板有96个微孔,编号为 A1- H12,其中A1为水, A2- H12分别为48种糖、 醇 类及其衍生物,22种有机酸,19种氨基酸和6种核苷 酸,共95种碳源。 10株供试乳杆菌菌株对B iolog厌氧菌鉴定微 平板95种碳源的利用情况列于表3中。 表3 10株供试乳杆菌菌株对95种碳源的利用 96微孔及名称1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A1水- A2N -乙酰- D -半乳糖胺+ -+ bb+ + + + + A3N -乙酰- D -葡糖胺+ + + + + + + + + + A4N -乙酰- D甘露糖+ + + b + + + -+ + A5戊五醇- A6苦杏仁苷+ b+ -+ + + + + + A7D -阿糖醇- A8熊果苷+ + + + + + + + + + A9D -纤维二糖+ + + + + + + + + + A10-环糊精- A11-环糊精- A12糊精b + b+ + + + + + + B1甜醇- B2i -赤藻糖醇B Bb-+ -+ b B3D -果糖+ + + + + + + + + + B4L -海藻糖- B5D -半乳糖+ + + + + + + + + + B6D -半乳糖醛酸+ b+ -+ + -+ + B7龙胆二糖+ b + -+ + + -+ + B8D -葡萄糖酸+ + + + + + + + + + B9D -葡糖胺酸- B10- D -葡萄糖+ + + + + + + + + + B11- D -葡萄糖-1-磷酸- B12D -葡萄糖-6-磷酸+ bb-bb-bb C1甘油b -b-+ -+ + + C2D, L -磷酸甘油b -b-b-b- C3m -肌醇- C4- D -乳糖+ + + + -+ + b+ - C5乳果糖+ + + + -+ + -+ - C6麦芽糖+ + + + + + + + + + C7麦芽三糖+ + + bb-+ -+ - C8D -甘露醇+ + + + + + + + + + C9D -甘露糖+ + + + + + + + + + C10D -松三糖+ + + -+ + + + - C11D -蜜二糖-b+ -bb C12 3-甲基- D -葡萄糖bbb-+ + -+ + D1-甲基- D -半乳糖苷bbb-b-b- 续表3 10株供试乳杆菌菌株对95种碳源的利用 96微孔及名称1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 D2-甲基- D -半乳糖苷+ + + -+ + + + + D3-甲基- D -葡萄糖苷bbb-+ + -+ b D4-甲基- D -葡萄糖苷+ + + -+ + + + + D5异麦芽酮糖+ + + + + + + + + + D6D -棉子糖+ + + bbb+ -b- D7鼠李糖-+ + + + + D8水杨苷+ + + + + + + + + + D9D -山梨醇+ + + + + + + + + + D10水苏糖- D11蔗糖+ + + + + + + + + + D12D -海藻糖+ + + + + + + + + + E1松二糖+ + + + + + + + + + E2乙酸- E3甲酸- E4反丁烯二酸- E5乙醛酸- E6-羟丁酸+ + + + + + + + + + E7-羟丁酸- E8衣康酸- E9-丁酮酸+ + + + + + + + + + E10-戊酮酸- E11D, L -乳酸+ + + -+ + -+ + E12L -乳酸+ + + + + + + + + + F1D -乳酸甲基酯+ + + -+ b-+ F2D -苹果酸- F3L -苹果酸-+ + + -+ + F4丙酸- - - - F5丙酮酸+ + + + + + + + + + F6丙酮酸甲基酯+ + + + + + + + + + F7D -葡萄糖二酸- F8琥珀酰胺酸- F9琥珀酸- F10琥珀酸单甲基酯- F11m -酒石酸- F12尿刊酸- G1丙胺酰胺- G2L -丙氨酸- G3L -丙氨酰- L -谷胺酰胺- G4L -丙氨酰- L -组氨酸- G5L -丙氨酰- L -苏氨酸- G6L -天门冬酰胺- G7L -谷氨酸- G8L -谷氨酰胺- G9甘氨酰- L -天门冬氨酸- G10甘氨酰- L -谷氨酰胺- G11甘氨酰- L -甲硫胺酸- G12甘氨酰- L -脯氨酸- 783第4期 曾哲灵等:Biolog微生物自动分析系统在乳杆菌鉴定中的应用 续表3 10株供试乳杆菌菌株对95种碳源的利用 96微孔及名称1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H1L -蛋氨酸- H2L -苯丙氨酸- H3L -丝氨酸- H4L -苏氨酸- H5L -缬氨酸- H6L -缬氨酸L -天门冬氨酸- H7 2-脱氧腺苷+ + + + + + + + + + H8肌苷bbb-+ + -bb H9胸苷+ + + + + + + + + + H10尿苷+ + + -+ + -+ + H11 5-单磷酸胸苷bbb-+ -+ - H12 5-单磷酸尿苷- 注: +,利用阳性;- ,利用阴性; b,弱利用。 菌株编号对应数 字序号同表2。 由表3分析10株供试乳杆菌菌株对上述95种 碳源利用情况,均可利用N -乙酰- D -葡糖胺等 23种碳源、 均不可利用戊五醇等44种碳源, 10株供 试乳杆菌菌株对95种碳源利用特性反应出乳杆菌 属水平碳源利用特征,而各菌株对某些碳源利用程 度的不同,反应出乳杆菌属中不同种间以及不同株 间的碳源利用特征,是进一步区别乳杆菌属中不同 种及不同株的重要参考因素。 能够利用鼠李糖是鼠李糖乳杆菌的碳源利用 特征,不能利用-甲基- D -葡萄糖苷是类干酪 乳杆菌类干酪亚种不同于其他两个种的碳源利用 特征 3, 8 - 10 。 由表3可知,菌株ATCC 15008不利用 鼠李糖,碳源利用特征与菌株ATCC 393 T 和JCM 8129近似,符合干酪乳杆菌特征,为干酪乳杆菌; 菌株JCM 1111不利用鼠李糖和-甲基- D -葡 萄糖苷,碳源利用特征与菌株JCM 1053近似,符合 类干酪乳杆菌类干酪亚种特征,为类干酪乳杆菌 类干酪亚种;菌株ATCC 53103利用鼠李糖,碳源 利用特征与菌株NBRC 3425 T、 ATCC 8530、ATCC 10863、ATCC 11981近似,符合鼠李糖乳杆菌特 征,为鼠李糖乳杆菌。 根据供试乳杆菌菌株对95种 碳源的利用情况,将菌株ATCC 15008、JCM 1111 和ATCC 53103进一步鉴定到种,鉴定结果与菌株 原名称相符。 3 结 论 B iolog微生物自动分析系统可快速测定出供试 乳杆菌菌株的特性参数(PROB、SI M、D IST)和供试 乳杆菌菌株对95种碳源的利用情况,并可直接根据 供试乳杆菌菌株的特性参数将供试乳杆菌菌株准确 鉴定到属水平、 部分乳杆菌菌株准确鉴定到菌种水 平。 根据供试乳杆菌菌株的特性参数,结合供试乳杆 菌菌株对95种碳源的利用情况,可将所有供试乳杆 菌菌株准确鉴定到菌种水平。 可作为乳杆菌制品质 量控制及快速鉴定的有效手段。 参考文献: 1 Hansen P A,Lessel E F. Lactobacillus Casei(Orla - Jensen) comb. NovJ .Int J Syst Bacteriol, 1971, 21: 69 - 71. 2 Skerman V B D,McGowan V, Sneath P H A et al . Approved Lists ofBacterialNamesM . AS M, 1989. 3 Collins,M D, Phillips B A, Zanoni P. Deoxyribonucleic AcidHomologyStudiesofLactobacillusCasei, Lactobacillus Paracaseisp. nov, Subsp.Paracaseiand Subsp.Tolerans, andLactobacillus Rham nosusSp nov, Comb novJ . IntJ SystBacteriol, 1989, 39: 105 - 108. 4 StagerCE,DavisJR. AutomatedSystemsfor IdentificationofM icroorganismsJ . Clinical M icrobiology Reviews, 1992, 5: 302 - 327. 5 谢家仪,王永力. B I OLOG细菌自动鉴定系统的应用与 研究J .微生物学通报, 1996, 23 (5) : 264 - 267. 6 李 运,盛 慧,赵荣华. Biolog微生物鉴定系统在菌 种鉴定中的应用J .酿酒科技, 2005, 113(7) : 84 - 85. 7 M icrolog System, Release 4. 2 User Guide. 8 RE.布坎南,N. 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A new spectrofluorimetric method for the determination of Cys has been developed with good linear calibration of Cys concentration ranging from 7. 46 10 - 7 to 2. 2010 - 5 mol/L - 1 and the detection limit as 7. 4610 - 8 mol/L - 1. The proposed assay was easy operation, high selective and sensitive. Itwas applied to determine Cys in synthetic amino acid samples and the recoverywas 94. 0 - 100. 7%. Key words:Tiron - Cu( II) complex;L - Cysteine; fluorescence enhancement (上接第384页) Application of Kinetic SpectrophotometricM ethod to Determ ination ofWarfarin in Pharmaceutical Preparation Samples XI AO Wei2qiang,N I Yong2nian (Department of Chemistry,NanchangUniversity,Nanchang 330031,China) Abstract:A simple and sensitive kinetic spectrophotometric method was proposed for the determination of warfarin in pharmaceutical preparation samples . The method was based on the reduction of violet potassium permanganate bywarfarin in the alkalinemedium at70to form green potassium manganate peaked at 608 nm. Itwas found that the absorbance at 608 nm linearly increased in the linear range of 0. 5 to 6. 0g/mL,with the limit of detection of 0. 16g/mL. The proposed method was appliedtodetermination of warfarinin pharmaceutical preparation sampleswith satisfactory results,which compared wellwith those obtained by HPLC method, aswell as the claimed values . Key words:warfarin; spectrophotometric determination; kinetic analysis; pharmaceutical preparation (上接第388页