刺五加HPLC／UV／MS指纹图谱研究.pdf

1 48 中国药科大学学报 J o u r n a l o f C h i n a P h a r m a c e u t i c a l U n i v e r s i t y 2 0 0 3 ， 3 4 ( 2 ) ： 1 4 8 1 5 0 刺五加 HP L C U V MS指纹图谱研究 余静， 李 茜， 沈文斌， 张尊建 ( 中国药科大学分析测试中心 ， 南京 2 1 0 0 0 9 ) 【 摘要】 目的 ： 采用 H P I E U V M S法分别对刺五加药材水溶性和脂溶性成分进行指纹图谱研 究， 并对其 主要成分进行定性。方法： 采用岛津 O D SC n s ( 4 6 n l l n 1 5 0 n l l n ， 5 m ) 柱和 A s i l e mZ O R B A X S B - C l 8 柱( 2 5 o n l l n 4 6 n l l n ， 5 p a n ) ， 分别用0 5 冰醋酸 乙腈、 0 5 冰醋酸、 乙腈、 0 1 甲酸为流动相梯度洗脱， 流速 ： 1 m l m i n 。结果 ： 得 到分离度和重现性均较好的刺五加药材 I - IP I E U V及 I - I P I E M S指纹图谱， 并分别对水溶性成分指纹图谱 中5个 色谱峰和脂溶性成分指纹图谱 中8个色谱峰进行 了初步定性。结论： 本方法可用于刺五加药材的指纹图谱测 定 ， 并为其质量控制提供参考。 【 关键词】 刺五加； 指纹图谱； 成分研 究； H P I E U V M S ； 质量控制 【 中图分类号】 R 9 4 4 9 ； R 9 4 5 ； R 9 7 9 5 【 文献标识码】 A 【 文章编号】 1 0 0 0 - _5 0 4 8 ( 2 0 0 3 ff 2 4 ) 1 4 8 4 B 刺 五加 为 五加 科 植 物 刺 五 加 A c a r a h o p a z x s e a t o s u s ( R u p r e t Ma x i m ) H a r m s的 干燥 根 及 根 茎 1， 具有益气健脾、 补 肾安神、 益精壮骨之功 效 2 。其主要成分为胡萝 卜 苷( 刺五加苷 A ) 、 丁香 苷( 刺五加苷 B ) 、 异秦皮啶葡萄糖苷( 刺五加苷 B ) 、 乙基 一半乳糖苷( 刺五加苷 C ) 、 紫丁香树脂酚 的葡萄糖苷的两种不同构型( 刺五加苷 D和 E ) 、 阿 魏酸葡萄糖苷、 咖啡酸、 芥子醛和异秦皮啶等l J 。 中药指纹图谱已是牵动行业全面进步的关键技术 之一， 对推动中药现代化、 产业化、 国际化具有重大 作用l 5 J5。本文采用 H P L C U V MS方法对刺五加药 材的乙醇提取物和乙酸乙酯提取液进行分离分析 ， 得到了分离度、 重现性均较好的药材指纹图谱， 并 对色谱峰进行了归属， 为全面评价刺五加药材的质 量提供 了参考。 1 仪器与试剂 岛津 L C 一 1 0 A T V P高效液相色谱仪， 岛津 S P D 一 1 0 A V P检测 器， 浙 江大 学 N 2 0 0 0色谱 工作 站； A g i l e n t 1 1 0 0 L C D A D MS系 统 ， 含 在 线 真 空脱 气 机 、 高压二元梯度泵 、 恒温 自动进样器 、 柱温箱 、 光 电二极管阵列检测器( ) 、 电喷雾 ( E S ) 接 口， H P C h e m s t a t i o n R e v A 0 8 0 3 色谱工作站。 乙腈 ( 色谱纯 ) ； 冰醋酸、 乙醇、 乙酸乙酯 ( 均为 分析纯 ) ； 重蒸水 ； 刺五加 药材产 自黑龙 江伊春南 岔 ， 经中国药科大学中药学院王强教授鉴定为刺五 加 A c a n t h o p a n a x s e n t c o s u s ( R u p r e t M a x i m ) H a i 1 8 ； 绿原酸、 丁香苷和异秦皮啶对照品购于中国药品生 物制品检定所。 2 方法与结果 2 1 供 试 品 的制备 2 1 1 水溶性 成分刺 五加药材 粉末 ( 过 4 0目 筛 ) 5 0 g ， 加 6 5 乙醇 3 0 I I ll ， 冷浸 1 2 h ， 加热 回流 2 h ， 趁热过滤， 过 0 4 5 t a n 微孔滤膜 ， 作为刺五加药 材水溶性成分供试品。 2 1 2 脂溶性 成分刺 五加药 材粉末 ( 过 4 0目 筛) 5 0 g ， 加 乙酸乙酯 4 0 I I ll ， 加热 回流 4 h ， 趁热过 滤 ， 挥干， 5 0 甲醇 3 I I l l 溶解 ， 过 0 4 5 a n微 孔滤 膜 ， 作为刺五加药材脂溶性成分供试品。 2 2 液相 色谱条件及分析方法 2 2 1 水溶性成分色谱柱： 岛津 O D S C l 8 柱( 1 5 0 m l n 4 6 m l n ， 5 a n ) ； 流动相 ： A： 0 5 冰醋酸 ， B： 含 0 5 冰醋酸 的乙腈 ； 梯度洗脱 ： 0 m i n ： B ( 1 0 ) ， 1 0 m i n ： B ( 1 0 ) ， 4 0 m a n _ B ( 4 0 ) ； 流速 1 m l m i n ； 柱 温 ： 2 5 o C； 检测波长 ： 2 7 0 n m； 柱后分 流 0 4 m l m i n 进质谱仪； M S 同时记录总离子流( ) 色谱图。检 测方式 ： E s I ( + - ) ； 扫描范 围： 8 01 0 0 0 ； 干燥气 流 速 ： 1 0 L m i n ； 雾 化室压 ： 4 0 P a ； 毛细管 电压 ： 4 0 0 0 V； 裂解 电压 ： 7 0 e V； 进样量 ： 2 0 。 【 收稿日期】 2 0 O 2 1 0 -0 9 【 通讯作者】 T e l ： 0 2 5 3 2 7 l 4 5 4 E - m a i l ： z j z h a n g 9 9 m , a o 0 I 维普资讯 2期 余静等： 刺五加 H P I U V M S指纹图谱研究 1 4 9 2 2 1 脂溶性成分色谱柱 A g i l e n t Z O R B A X S B C l8 柱( 2 5 0 m m 4 6 m m， 5 a n ) ； 流动相： A ： 0 1 甲 酸， B ： 乙腈 ； 梯 度洗脱 0 m i n ： B( 1 0 ) ， 1 5 I I l i n ： B ( 1 5 ) ， 2 5 m i n I B ( 2 O ) ， 3 2 ra i n ：B ( 2 O ) ， 4 5 m i n ： B ( 3 5 ) ， 6 5 m i n i B ( 9 0 ) ， 7 0 m i n ： B ( 9 0 ) ； 流速 1 m l m i n ； 柱温 ： 2 5 ； 检测波长 ： 3 2 6 n m； 质谱 分析条 件同水溶性成分； 进样量： 2 0 。 2 3 试 验 结果 刺五加药 材水溶性成 分和脂溶性 成分 的 H P L C U V及 H P L C M S 指纹图谱分别见图 1 6 。 0 5 1 0 1 5 20 2 5 3 0 3 5 4 0 t mi n F i g1 HP L C UVfi n g e J n t 0 fwo t - s o l u bl e目l b s I 硼c e t rai n r i g2 H P L C M Sfi n g e xi n t o f w a t e rsol u b l e曩 l b s I硼o e ， E S I ( +) 4 0 F i g 3 H P I IV l Sfi n g e r p r i n t o f w a l e r sol ubl e目 s I c e ， E S I (一) 0 2 0 4 0 60 t ra i n F i g4 HP L C UV fi n g e r p r i n t 0 fl i p o s a l ub l e g x n 3 讨论 3 1 药材提 取 方 法 为全面考察刺五加的化学成分， 分别测定了刺 五加水溶性成分和脂溶性成分的指纹图谱。通过 对甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯等不同溶剂以及提取浓度、 不同提取方法的考察， 分别确定了水溶性成分和脂 溶性成分的提取方法 。 0 20 4 0 60 mi n r i g 5 H P L C M Sf mg e ti a in t 0 f l i p o s a l ubl e目 l b s I c e ， E S I (一) 0 2 0 4 0 6 0 t rai n r i g 6 I -I P I M Sf ing e r p r in t 0 f l i p o s a l ubl e l k 棚 c e 。 E S I () 3 2 同一 产地 眦 U v指 纹 图谱 根据测定的同一产地 ( 黑龙江伊春南岔) 1 0 批 药材的指纹图谱 ， 建立了水溶性成分的指纹图谱及 其技术参数L 6 J 。在脂溶性成分指纹图谱 中， 其中 1 0 个峰是各批供试品所共有的， 且峰面积较为稳 定， 定为共有指纹峰( 图 4 ) 。以 t R 1 0 8 m i n的色谱 峰为参照峰， 计算平均相对保留时间分别为 1 ( 1 ) ， 2 ( 1 1 8 3 ) ， 3 ( 1 3 8 9 ) ， 4 ( 1 5 1 8 ) ， 5 ( 1 7 8 1 ) ， 6 ( 2 4 8 O ) ， 7 ( 3 O 9 6 ) ， 8 ( 3 1 5 4 ) ， 9 ( 3 5 5 1 ) ， 1 0 ( 4 4 7 6 ) ； 平均相 对峰 面积 分 别 为 ： 1 ( 1 ) ， 2( 0 0 9 8 ) ， 3( 0 2 8 0) ， 4 ( 0 2 1 1 ) ， 5 ( O 1 7 5 ) ， 6 ( O 1 4 5 ) ， 7 ( 1 4 1 5 ) ， 8 ( O 6 O 8 ) ， 9 ( 0 2 6 1 ) ， l O ( O 1 4 3 ) 。 3 3 M S指纹图谱 根据化合物的质荷比、 提取离子色谱( E I C ) 以及 相关文献【 J ， 对图中主要色谱峰进行了初步归属。 在刺五加水溶性成分指纹图谱中， H P L C U V 对照品试验表明 t R 8 2 m i n 化合物为丁香苷， 分子 量为3 7 2 ， 与 M S 谱相应保留时间处 m z 3 9 5 M+ 、 m z 4 1 1 M+K 峰一致； 刺五加药材 L C M S 色谱图中， t R 9 4 m in 化合物在 M S 谱图中表现 为 m z 3 5 5 M+H 、 m z 3 7 7 M+ 、 m z 3 9 3 M+K 、 m z 3 5 3 M H 一 ， 为绿原酸， 分子 量为 3 5 4 ， 且推测 m z 1 6 3为咖啡酰碎 片峰 ， 与对 照品试验一致； t R 1 9 3 m in和 1 9 8 va i n 化合物， 其 M S 谱图中都表现为 m z 7 6 5 M+N a 、 m z 7 8 1 M+ K ， 可能分别为刺五加苷 D或 E ， 这两个化 合物是同分异构体， 分子量均为7 4 2 ； t R 2 2 9 m i n 化 合物则表现为 m z 4 9 9 M+H H 2 O 、 m z 5 3 9 维普资讯 1 5 O 中 国 药 科 大 学 学 报 ( J C h i n P h a r m U n i v ) 3 -4 卷 M+ 、 m z 5 5 5 M+K ， 推测为异绿原酸， 分子量为5 1 6 。 在刺五加脂溶性成分 L C M S指纹图谱中， t R 9 8 m i n 化合物在 MS 谱 图中表现为 m z 3 9 5 M+ N a 、 m z 4 1 1 M+K 峰， 为丁香苷， 与对照品 试验一致 ； t R l 1 1 m i n化合物则表现为 m z 3 5 5 M +H 、 m z 3 7 7 M+N a 、 m z 3 5 3 M H 以及 伴有 m z 1 6 3 碎片峰( 结构同前) ， 为绿原酸， 分子 量为 3 5 4 ， 与对照品试验一致； t R 1 3 1 m i n 化合物在 M S 谱 图中表现为 m z 4 0 7 M+ ， m z 2 2 3碎 片峰推测为苷元异秦皮啶产生的离子峰 ， 该化合物 可能为刺五加苷 B 1 ， 分子量为3 8 4 ； t R 1 5 3 m i n 化合 物在 MS 谱 图中表 现为 m z 1 6 3 M +H H 2 0 、 m z 1 8 1 M+H 以及 m z 1 7 9 M H 一 ， 可能为 咖啡酸， 分子量为 1 8 0 ； t R 1 6 7 n fi n 化合物表现为 m z 1 9 1 M+H H 2 0 j 、 m z 2 0 9【 M+Hj 、 m z 2 0 7 M H 一 ， 推测为芥子醛， 分子量为 2 0 8 ； t R 2 7 1 m i n 化合物 表现为 M+H 为 2 2 3 ， 与异秦皮 啶对 照品试验一致， 分子量为 2 2 2 ； t R 3 3 8 m i n 化合物则 表现 为 m z 4 9 9 M +H H 2 0 、 m z 5 1 7 M + H 、 m z 5 1 5 M H 一 ， 推测为异绿原酸 ， 分子量 为 5 1 6 ； t R 4 8 7 n fi n 化合物表现为 m z 3 3 9 M+H - n 2 0 、m z 3 5 7【 M +H J 、m z 3 3 7 【 M H H 2 O 一 ， 可能为阿魏酸葡萄糖苷 ， 分子量为 3 5 6 。 从以上分析结果可见， 刺五加乙醇提取液所含 化合物主要为苷类及部分有机酸， 乙酸乙酯提取液 中主要成分为苷元、 有机酸类 和少量苷类 。两张指 纹图谱相互补充， 为刺五加药材的相关研究提供了 较全面的参考。同时表明， 质谱检测器对于 u V检 测器是较好的补充 ， 可以提供更 多的化 合物 的信 息 ， 从而为刺五加药材及其制剂的鉴别提供更加全 面、 可靠的依据。 参 考 文 献 1 中华 人 民共和 国药典 ( 一 部 ) S 广 州 ： 广 东科 技 出版 社 ， 2 0 O 0 2 曹先兰( C a 0 X L ) ， 李珠莲 ( I j ) 刺 五加 国外实验研究 ( 综述 ) J 中草药( C h n T r a d t H e r b ) ， 1 9 8 0 ， 1 1 ( 6 ) ： 2 7 7 - 2 8 1 3 吴立军( wlu L 1 ) ， 郑健( z h s J ) ， 姜宝虹 ( J a n g B H ) 等 刺五 加茎叶化学成分 J 药学学报( A a a P h a r m S n ) ， 1 9 9 9 ， 3 4 ( 4 ) ： 2 9 4 2 9 6 4 潘海峰( P 肌 H F ) ， 盂艳彬( M 目 l g Y B ) ， 缪红( M i a o H ) 刺五加 的研 究概况 J 承德 医学院 学报 ( J o u r n d o f 删 M e d c d 8 ) ， 2 0 0 2 ， l 9 ( 2 ) ： 1 5 7 1 5 9 5 屠鹏 飞( T u P F ) 中药指纹 图谱指定的方法 学探讨 C 现代化 中药产业关键技术系列研讨会( 一) ： 国际色谱指纹图谱评价 中药质量研讨会 广州 ， 2 0 0 1 6 张尊建( z h s Z J ) ， 余静( Y u J ) ， 李茜 ( L i Q ) 刺五加 H P I U V指纹图谱的研究 J 中国野生植物资源( O d n e s e 阢 P a n t R e s o u r c e s ) ， 2 0 0 2 Z I ( 4 ) ： 4 3 45 S t u d y on t h e F i n g e r p r i n t s o f Ac a n t h o p a n a x s e n t i c o s u s Cr u d e Dr u g s b y H PL C UV MS Y U J i n g ， L I Q i a n ， S H E N We n - B i n ，Z I- I A N G Z t m J i a n C e n t e r f o r I n s t n u n e n t a l A n a l y s is ，C h i n a P h a r m a c e u t i c a l U n i v e r s i t y，N a n j i n g 2 1 0 0 0 9 ，Chi na 【 A B mA C T 】 A IM： T o d e v e lo p a m e t h o d f o r s tu d n g o n th e u V M s fi n g e rp ri n t s o f A c a n t h o p a n a x s e n t i c o s u s c r u d e d r u g s a n d e l u c i d a t i n g the ma i n c o mp o n e n ts c o n t a i n e d i n i t M 日r H OD： S e p a r a t i o n W a S p e rf o r me d o n S h i m- p a c k V P - O D S ( 1 5 0 1 1 3 1 1 1 X 4 6 1 1 3 1 1 1 ， 5 t a n ) a n a l y t i c a l col u m n and A g i l e n t z 0 R B A x S B C 1 8 ( z s 0 n l l nx4 6 n l l n ， 5 舯 ) a n a l y t i c a l c o l u mn 1 1 l e mo b i l e p h a s e con s i s t e d of 0 5 a c e ti c aci d and 0 5 a c e t i c aci d a c e t