茶树菇多糖提取工艺研究.pdf

茶树菇多糖提取工艺研究 王宗君 1, 廖丹葵2, 张良军1 ( 1广西工业职业技术学院 石油与化学工程系, 广西 ? 南宁?530001 ; 2广西大学 化学与化工学院, 广西? 南宁 ? 530007) 摘 ? 要:分别采用热水浸提法、 微波辅助法、 超声波辅助法、 酶法提取茶树菇多糖的提取工艺进行了研究。确定了热水浸提法 的最适条件: 提取温度 90? , 液固比为 20? 1, 提取 3次, 每次 4h, 醇析中加入 3倍体积的无水乙醇, 茶树菇多糖提取率为 42 . 51% ; 微 波、 超声波和酶解作用均有利于多糖的提取。 关键词:茶树菇; 多糖; 提取 The ExtractionM ethods of Polysaccharides From Agrocybe Aegerita WANG Zong- jun 1, LIAO Dan- kui2, ZHANG Liang- jun1 ( 1 Depart ment of Petroleu m and Chem ical engineering GuangxiVocational and Technical Institute of Industry , GuangxiNanning 530001 ; 2 College of Chem istry and chem ical engineering , GuanxiUniversity , GuangxiNanning 530007 ,China) Abstract : The extraction methods ofAgrocybe Aegerita Polysaccharid including hot water extraction , M icrowave- assised , U ltrasonic- assised,and cellulase m ethod were investigated. The opti mal extracting conditions for hot water ex? traction technology of extracting Agrocybe aegerita Polysaccharid by hot water :te mperature 90? ,ratio of solid- liquid 1? 20 ,the duration of ti me 4h and the extraction of ti mes3 ti me . The extracting rate was 42 . 51 % . M icrowave- assised , U ltrasonic- assised,and enzymolysis role could increase extraction. Key words : agrocybe aegerita ;polysaeeharide ;extraction . ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 作者简介: 王宗君 ( 1972- ), 男, 硕士, 研究方向: 天然物提取与分析。 多糖又称多聚糖 ( polysaccharides, PS), 由多个相同或不相 同的单糖基以糖苷键相连而成的聚合度超过 10的极性复杂大 分子, 分子量一般为数万, 数十万到数百万, 也有报道甚至达上 千万, 多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物, 几乎存在于所 有的生物中。是构成生命活动的四大基本物质之一 1, 并与维 持生命所需的多种生理功能密切相关。研究发现: 糖类化合物 特别是糖复合物上的糖链参与了各种生命现象的调节, 如细胞 识别、 粘连与融合、 信号传达、 免疫与应答、 细胞转化和分化都离 不开糖链的参与。在细胞的生命活动中起到重要的作用。它能 激活免疫细胞, 提高机体的免疫功能, 能够与病毒形成复合物, 干扰其与细胞受体的结合, 而对正常细胞没有副作用 2 3。 茶树菇, 学名茶薪菇, 享有? 中华神菇? 神仙菇 ?之称, 民间 常用于多种常见病、 多发病的防治, 晒干后可治疗头晕、 头痛、 呕 吐及小儿低烧、 老人气喘等症。现代医学研究证明, 其可滋阴壮 阳, 对肾虚、 尿频、 水肿、 癌症、 高血压、 早衰及小儿低热、 尿床等 都有较理想的辅助治疗功能。其多糖含量明显高于蘑菇、 香菇、 草菇、 平菇等其他食用菌, 药用价值极高, 是一种集高蛋白、 低脂 肪、 营养、 保健、 理疗于一身的绿色食品 4。由此, 我们探讨了其 多糖的提取方法, 旨在发掘茶树菇多糖在医学临床或人类保健 事业上潜在的应用。 1? 材料与方法 1 . 1? 原料与试剂 茶树菇干品 (购于超市 ), 烘干后粉碎成 80目粉末。盐酸、 烧碱、 无水乙醇、 硫酸、 苯酚 (重新蒸馏过 )、 纤维素酶、 邻苯三酚、 三羟甲基氨基甲烷 ( Tris)、 维生素 E、 硫代巴比妥酸、 三氯乙酸、 双氧水, 七水合硫酸亚铁均为分析纯。 1 . 2? 主要仪器设备 高速万能粉碎机 ( Fw100, 天津市泰斯特仪器有限公司 ); 微 波炉 (wD8oocsIJ23- K4, 格兰仕 ); 超声波清洗机 ( SK3300LH, 上 海科导超声仪器有限公司 ); 离心机 ( LXJ- 64- 01, 北京医疗仪 器修理厂 ); 电子分析天平 ( BS110S, 北京赛多利斯电子天平 ); 紫 外可见分光光度计 ( uv2102PC, 上海 UN I CO); 旋转蒸发器 (RE- 52AA, 上海亚荣生化仪器厂 )等。 1 . 3? 实验方法 1. 3. 1? 茶树菇多糖的提取方法 称取茶树菇粉适量, 放人三口烧瓶中, 加水后置于恒温水浴 槽, 加热回流提取一定时间。提取液过滤, 滤渣反复提取 3次, ?91?2009年 37卷第 7期广州化工 将 3次提取液合并, 用旋转蒸发器浓缩至一定体积, 加入一定体 积无水乙醇密封, 静置过夜, 溶液经离心后得多糖沉淀, 干燥至 恒重得多糖粗产品。 1. 3 . 2? 茶树菇多糖提取条件研究 研究在不同浸提温度、 固液比、 浸提时间和外加条件等因素 对多糖提取率的影响, 得出最佳提取条件。 ( 1)采用三因素四水平 L16( 43)正交实验设计得出热水浸提 最佳条件; ( 2)采用微波、 超声波为外场强化处理后提取多糖, 得出最 佳的处理条件; ( 3)通过纤维素酶的酶解作用, 单因素法考察料液比、 酶解 温度、 用酶量对多糖提取率的影响, 得出在不同条件下, 最佳的 提取条件; ( 4) 多糖粗品经活性炭脱色和 Sevag法脱蛋白得多糖样品。 1. 3 . 3? 茶树菇多糖含量测定。 采用苯酚 -硫酸法 5- 6, 以葡萄糖为标准品, 称取一定质量 多糖样品 W mg , 加热水准确稀释至 100mL , 取 2mL按标准曲线 项测定吸光度 A 值, (配制多糖的浓度, 使其吸光度 A 恰好在 0?3 0?5之间 ), 以标准曲线即可计算样品中多糖含量。 样品含量的计算公式如下: 曲线回归方程计算浓度 (C) = (A490- 0. 0095) /0 . 0123 式中: A490? ? 样品在 490nm处吸光度 A 值 多糖提取率 (% ) = (C ? v/2) /W ? 1000 式中: C? ? 曲线回归方程计算浓度 V? ? 样品溶液体积 W? ? 样品质量 2? 结果与讨论 2. 1? 标准曲线的绘制及样品含量测定 精密称取有萄糖 (105? 干燥 4h) 50mg , 定容至 100mL, 配成 浓度为 50 ug/mL的葡萄搪溶液, 取上述溶液 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0 . 8, 1 . 0和 1 . 2mL分别加于 7支试管中, 加蒸馏水至 2mL, 加入 1mL 5% 苯酚溶液, 摇匀后迅速加入 5mL浓硫酸, 摇匀后静置 10m in, 置沸水浴中加热 15min , 于 490nm处比色测定 A 值。以蒸 馏水的反应液体作空白, 测得各浓度吸光度, 以吸光度为纵坐标 对应的各浓度多糖作横坐标作标准曲线。将所测得实验各浓度 吸光度 A为纵坐标, 所对应的各浓度多糖作横坐标作标准曲线见 图 1, 在所取的浓度范围内其浓度和吸光度呈良好线性关系。 图 1? 硫酸 - 苯酚法测定葡萄糖的标准曲线 2 . 2? 热水浸提正交实验结果及分析 影响热水浸提茶树菇多糖提取率的因素很多, 本实验采用 三因素四水平 L16( 43)正交实验设计。考察了提取温度、 固液 比、 提取时间对多糖提取率的影响, 各实验条件和结果如表 1所 示。 表 1? L16( 43)正交实验设计与极差分析结果 实验号料液比 A温度 B /?浸提时间 C /h 多糖提取率 /% 11? 1060219. 07 21? 1070327. 82 31? 1080423. 45 41? 1090516. 68 51? 2060313. 26 61? 2070227. 14 71? 2080530. 62 81? 2090442. 45 91? 3060413. 88 101? 3070513. 33 111? 3080225. 56 121? 3090326. 25 131? 4060517. 22 141? 4070436. 98 151? 4080324. 20 161? 4090223. 17 K187 . 0263 . 4394. 94 K2113 . 47105 . 2791. 53 K379 . 02103 . 83116. 76 K4 101 . 57108 . 5577. 85 ? K1 21 . 7615 . 8623. 74 ? K2 28 . 3726 . 3222. 88 ? K3 19 . 7625 . 9629. 19 ? K4 25 . 3927 . 1419. 46 极差 R8. 6111 . 284 . 28 由表 1可以得出热水浸提最佳提取条件是 A2B4C3, 即温度为 90? , 固液比为 1? 20 , 浸提时间为 4h , 多糖提取率为 42 . 45% 。在 此条件下进行实验, 多糖提取率为 42. 57%, 因此取平均值茶树菇 多糖提取率为 42 . 51% 。 2 . 3? 微波外场强化提取茶树菇多糖结果分析 采用水提法最佳条件, 将茶树菇水提液在提取多糖前用微 波进行外场强化处理, 分别考察强化处理时间和处理功率对多 糖提取率的影响。实验结果如下图 2、 图 3所示。 由图 2和图 3可知微波辅助热水浸提法最佳的提取工艺条 件为: 微波功率 320W, 处理时间 6. 0m in, 浸提温度 90? , 固液比 1? 20, 时间 4h( 2次 ), 茶树菇多糖提取率为 58 . 65% 。在浸提次 数减少一次, 所用时间缩短 1/3, 溶剂的用量减少 1/3的条件下, 多糖提取率比热水浸提法提高了 16. 21 % 。 ?92?广州化工2009年 37卷第 7期 2. 4? 超声波辅助浸提茶树菇多糖结果分析 超声波辅助浸提法是以热水浸提的最佳工艺条件为前提考 察超声波频率和处理时间对多糖提取率的影响, 目的是进一步 优化提取的工艺条件, 提高多糖提取率。超声波频率分别为 40 kHz、 50kHz 、 60 kHz 、70k H z , 超声波处理时间为 20m in时多糖的 提取率结果实验结果见图 4; 在最佳频率下考察不同时间对提取 率的影响, 实验结果见图 5。 图 4? 超声波频率与多糖提取率的关系 图 5? 多糖提取率与超声波处理时间的关系 从图 4可知超声波频率小于 40 kHz时, 超声波对茶树菇多 糖提取率的提高不大, 无超声时的多糖提取率为 42. 51 % , 可见 在频率小于 40kHz时超声波经 20min强化处理后超声波对茶树 菇的破壁作用相对较微弱。但超声波频率为 59kHz时超声效果 明显, 在超声波频率 59kHz, 随着超声波处理时间的增大, 多糖得 率出现先增大后减小的变化趋势。 2 . 5? 酶法浸提茶树菇多糖结果分析 酶法提取是在热水提取的基础上以纤维素酶水解细胞壁的 纤维素成分 (促使细胞壁破裂从而释放细胞内的多糖 )为辅助条 件, 单因素条件下研究对多糖提取率的影响。 ( 1)酶用量对提取茶树菇多糖提取的影响 采用 1? 20的料液比、45? 的酶解温度, 改变酶用量, 酶解 4h后提取茶树菇多糖, 实验结果如图 6所示。 ( 2)酶解时间对茶树菇多糖提取的影响 采用 1? 20的料液比、 45? 的酶解温度, 用酶量 0. 08% , 分 别进行酶解 1h、 2h、 3h、 4h提取多糖, 实验结果如图 7所示。 ( 3)酶解温度对茶树菇多糖提取的影响 采用 1? 20的料液比、 分别以 35? 、40? 、45? 、50? 、 55? 为酶解温度, 加酶量 0. 08% , 酶解时间 4小时, 进行酶解提取, 实 验结果如图 8所示。 ( 4)底物浓度对茶树菇多糖提取的影响 采用 1? 10 、 1? 15 、1? 20 、1? 25 、1? 30的料液比、 45? 的酶 解温度, 加酶量 0. 08 % , 进行酶解 4h提取, 实验结果如图 9所示。 图 8? 不同酶解温度对茶树菇多糖提取率的影响 (下转第 98页 ) ?93?2009年 37卷第 7期广州化工 3? 结? 论 ( 1) pH值和反应时间是影响 PFS除氟效果的重要因素。在 pH值为 4. 0 5. 0条件下除氟效果最佳; 除氟效果随反应时间增 加而增大, 但除氟率增大速率却逐渐减小。 ( 2)除氟效果随 PFS投加量的增加而增大。当 PFS投加量 较小时, 除氟率迅速增大, 继续增大投加量, 则对除氟贡献不大; 增大 PFS投加量, 除氟效果较好, 但也应尽量控制 PFS投加量在 0. 35mg/L以内。 ( 3)通过比较投加 A l 3+ 能提高 PFS除氟效果。试验结果表 明, 采用先投加 A l Cl3后投加 PFS的除氟效果更好。 参考文献 1 ? 中国生活饮用水卫生标准 (GB 5749- 2006). 2 ? 吴兆清, 许国强, 彭晓平. 含氟水处理的研究进展 J. 湖南有色金 属, 2003, 4( 19): 38- 42 . 3 ? 水处理剂 - 聚合硫酸铁国家标准 (GB 14591- 2006). 4 ? 史婷婷, 杨秀丽, 王宁涛. 聚合硫酸铁和钙盐除氟试验研究 J. 安 全与环境工程, 2009 , 2( 16): 58- 61 . 5 ? 徐晓军. 化学絮凝剂作用原理 M . 北京:北京科学出版社, 2005. (上接第 93页) 图 9? 不同底物浓度对茶树菇多糖提取率的影响 由图 6可知, 随着用酶量的增加, 多糖提取率亦增加。但当 用酶量为原料的 0. 08% 时, 提取率达到最大值, 再增加酶量提取 率下降。由图 7可知, 随着酶解时间的提高, 多糖提取率有所提 高, 但提取率并不随酶解时间延长而显著提高, 只有达到高温热 水浸提阶段才有利于多糖的溶出。由图 8可知, 当酶解温度在 44? 46? 时, 酶活力最高, 其中以 45? , 纤维素酶的活性最高, 多糖提取率亦最高。由图 9可知, 当底物浓度相差不大时, 茶树 菇多糖提取率的影响不显著。当底物浓度 (物料体积比 )高于 1? 20 时, 茶树菇多糖提取率变化非常小。 3? 结论与展望 通过以上四种不同方法对茶树菇多糖的进行提取并分析影 响多糖得率的各种因素, 热水浸提法最佳工艺条件为: 提取温度 为 90? , 固液比为 1? 20 , 浸提时间为 4h, 提取 3次共计 12小时, 多糖提取率为 42 . 51% 。微波、 超声波外场强化和酶解作用均有 利于多糖提取。 茶树菇多糖具有明显的抗氧化活性, 这预示着它在医学及 人类保健事业上有潜在的利用价值, 本论文未能对其分子结构 与生物活性之间的构效关系进行研究, 对于茶树菇多糖的抗氧 化活性研究, 这并不能代表药物在体内清除自由基的实际情况, 但对于离体大面积筛选抗氧化药物有一定的价值, 并可为对其 进一步的研究和开发利用提供依据。 参考文献 1 ? 姚新生. 天然药物化学 (第二版 ) M . 北京: 人民卫生出版社, 1994: 53- 65 . 2 ? L iu F, Fung M C , Oo iV