FAST指数在复原乳区分中的应用初探.pdf

中国农学通报第2 2卷 第1 1期2 0 0 6年1 1月 h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n 畜牧兽医科学 畜牧兽医科学 1前言 物质的荧光特性主要有 3 个重要的参数： 激发波 长( E x) 、 发射波长( Em) 和荧光强度。牛奶中的许多荧光 物质含有其特定的激发波长和发射波长， 其中水相体 系中乳清蛋白主要含有 - 乳球蛋白、 a - 乳球蛋白、 免疫球蛋白和白蛋白， 所有这些蛋白质的氨基酸组成 中均至少含有一个色氨酸残基。根据蛋白质的结构， 当激发波长在 2 8 0 2 9 5 n m时， 通过最大发射波长和色 氨酸光量子的产量可以确定特征荧光发射光谱。乳清 蛋白在 p H = 4 . 6 的乙酸盐缓冲液中变性后，在激发波 长和发射波长分别为 2 9 0 n m和 3 4 0 n m时，含非变性 蛋白的上清液中色氨酸的荧光强度是蛋白质变性的 一个较好的指标。 另外， 牛奶在加热过程中会因蛋白质和还原糖发 生梅拉德反应生成特定的产物，如赖氨酸衍生物、 吡 喏和吡啶衍生物等， 这类物质的荧光强度也会相应增 F A S T指数在复原乳区分中的应用初探 卜登攀, 李树聪, 张瑞超, 周凌云, 于建国, 魏宏阳, 王加启 （中国农业科学院北京畜牧兽医研究所； 动物营养学国家重点实验室； 农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心 （北京） ， 北京 1 0 0 0 9 4 ） 摘 要:F A S T指数是评价牛奶热损害的敏感指标, 在研究生鲜乳热加工、 奶粉及其复原乳色氨酸或梅 拉德反应产物荧光强度的变化规律的基础上,评价了F A S T指数用于鉴定生鲜乳和巴氏杀菌乳是否 添加复原乳的效果。研究结果表明,奶粉生产过程中, 色氨酸已经受到破坏, 同时, 不同奶粉之间色氨 酸的荧光强度存在差异。与生鲜乳相比, 复原乳中色氨酸荧光强度( F T r p )明显降低, 随着生鲜乳中复 原乳含量的增加, 色氨酸的相对荧光强度线性下降; 生鲜乳加热后, 其中梅拉德反应产物的荧光强度 ( F A M P) 明显升高, 此类物质荧光强度升高也与牛奶中复原乳含量增加呈显著的线性相关; 试验结果还 表明F A S T指数能有效的用于区分生鲜乳和巴氏杀菌乳, 以及巴氏杀菌乳中是否添加了复原乳。 关键词: 复原乳, 色氨酸, 梅拉德反应, 荧光强度,F A S T指数 中图分类号:S 8 7 9 . 9文献标识码:A A p p l i c a t i o no f F A S TMe t h o di nD e t e r mi n a t i o no f t h eP r e s e n c eo f R e c o n s t i t u e dMi l k B uD e n g p a n , L i S h u c o n g , Z h a n gR u i c h a o , Z h o uL i n y u n , Y uJ i a n g u o , We i H o n g y a n g , Wa n gJ i a q i ( M i n i s t r yo f A g r i c u l t u r eM i l ka n dD a r i yQ u a l i t yS u p e r v i s t i o na n dI n s p e c t i o nE v a l u a t i o nC e n t e r , B e i j i n g1 0 0 0 9 4 ) A b s t r a c t : T h eF A S Tm e t h o di sb a s e do nq u a n t i f i c a t i o no f p r o t e i nd e n a t u r a t i o nb ym e a n so f T r pf l u o r e s - c e n c e ( F T r p ) a n da c c u m u l a t i o no f f l u o r e s c e n t M a i l l a r dp r o d u c t s ( F A M P) i nt h ep H4 . 6 - s o l u b l ef r a c t i o no f t h em i l k . T h ef l u o r e s c e n c eo f r a wm i l k , p a s t e u r i z e dm i l k, a n dm i l kp o w e r w a sd e t e r m i n e d . T r pf l u o r e s - c e n c ew a s m u c hl o w e r i nr e c o n s t i t u t e dm i l kc o m p a r e dt of r e s hm i l k , w h e r e a s t h ef l u o r e s c e n c eo f a d v a n c e d M a i l l a r dp r o d u c t s ( F A M P) i n c r e a s e dd u r i n gh e a t t r e a t m e n t a p p l i e dt of r e s hm i l k . A s t h ep r o p o r t i o no f r e c o n - s t i t u t e dm i l ki n c r e a s e di nf r e s hm i l k, t h eF T r pd e c r e a s e dl i n e a r l ya n dF A M Pi n c r e a s e dl i n e a r l y . T h eF A S T m e t h o dc a nb ea ne f f e c t i v ew a yi nd e t e r m i n a t i o no ft h ep r e s e n c eo fr e c o n s t i t u t e dm i l ki nf r e s ho r P a s t e a u r i z e dm i l k . K e yw o r d s : R e c o n s t i t u t e dm i l k , T r p , M a i l l a r dr e a c t i o n , F l u o r e s c e n c e , F A S Ti n d e x 基金项目:科技部国家 “十五” 科技攻关计划 “改善牛奶品质营养调控技术研究” （2 0 0 2 B A 5 1 8 0 2 - 0 7 ） 。 第一作者简介:卜登攀， 男， 1 9 7 5 年出生， 博士。 研究方向： 牛奶品质改良。 通信地址： 1 0 0 0 9 4 北京市圆明园西路 2 号农业部奶及奶制品质量监督检验测试中 心。E - m a i l ： b u r d e n p a n g m a i l . c o m 。 通讯作者:王加启， 男， 1 9 6 7 年出生， 博士生导师， 研究员， 研究方向： 动物营养与饲料科学。E - m a i l : w a n g - j i a - q i 2 6 3 . n e t 。 收稿日期:2 0 0 6 - 0 6 - 0 1 ， 修回日期： 2 0 0 6 - 0 7 - 3 1 。 1 C h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 2N o . 1 1 2 0 0 6N o v e m b e r h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n 加。梅拉德反应产物荧光信号的发射波长大部分在 3 6 0 4 5 0 n m之间， 利用梅拉德反应产物能够反应热处 理样品蛋白质的营养损失。 当牛奶在灭菌、 干燥等高温加热的奶粉生产工艺 中，不同特征物质的荧光强度会因受热处理而变化， 而牛奶蛋白质因受热处理的破坏会降低其固有的荧 光强度， 因此， 当牛奶中含有复原乳时会改变牛奶本 身的荧光强度。B i r l o u e z - A r a g o n 等 （1 9 9 8 ） 提出了一种 利用荧光强度快速区分牛奶热损害的方法，即 F A S T 指数 1 ， 该指数综合考虑了牛奶中色氨酸和梅拉德反 应产物的荧光强度，可用于评价牛奶热处理强度。 G u a n 等 （2 0 0 5 ） 研究表明 2 ， 利用 F A S T方法指数能够 对生鲜乳中含 5 %的复原乳做出灵敏检测。笔者在研 究热处理和添加复原乳对液态奶荧光物质影响的基 础上， 评价了 F A S T方法用于区分巴氏杀菌乳中是否 存在复原乳的应用效果。 2材料与方法 2 . 1乳清蛋白沉淀方法 称 5 0 0 m g 牛奶，加 4 . 5 m l 乙酸盐缓冲液 （0 . 1 M， p H = 4 . 6 ） ,振 荡 后 在 4 0 0 0 g离 心 1 0 m i n 。 利 用 Wh a t m a n 4 2 号滤纸过滤， 取 0 . 5 m l 滤液加 4 . 5 m l 超纯 水， 4 冰箱保存待测。 2 . 2F A S T指数计算方法 F A S T指数 = F A M P F T r p 1 0 0 F A M P= I 3 6 0 n m I 4 4 0 n m ， F T r p = I 2 9 0 n m I 3 4 0 n m ,I 表示荧光强度 2 . 3仪器设备 用 H I T A C H I F - 4 5 0 0 型荧光光度计检测样品中特 定波长处的荧光强度。狭缝宽度为 5 n m ， 每日测定时 用 1 0 n g / m l 的硫酸奎宁溶液作为 1 0 0 %校准。 3试验结果 3 . 1牛奶样品中色氨酸的荧光强度特性 3 . 1 . 1不同稀释浓度对生鲜乳中色氨酸荧光特性的影 响 由于荧光检测受荧光物质浓度的影响而具有不 同的灵敏度， 因此确定适合检测条件非常重要。试验 对牛奶乳清蛋白中的色氨酸浓度进行不同的稀释， 结 果表明，色氨酸的荧光强度受稀释倍数的影响。图 1 列 出 了 当 激 发 波 长 为 2 9 0 n m 时 ， 发 射 波 长 从 2 9 0 n m 4 5 0 n m范围内的不同稀释倍数下的相对荧光 强度。 从图 1可以看出， 在激发波长为 2 9 0 n m ， 发射波 长为 3 6 0 n m左右时，色氨酸具有最大的相对荧光强 度， 但样品的稀释浓度影响荧光强度， 稀释 1 0 0倍时 的检测灵敏性更高。 3 . 1 . 2复原乳中色氨酸的荧光特性当用奶粉制成复 原乳后，在同样的条件下检测色氨酸的荧光强度， 并 与生鲜乳相比， 其相对荧光强度显著降低 （图 2 ） 。 表明 在奶粉生产过程中， 色氨酸已经受到破坏。同时， 不同 奶粉之间色氨酸的荧光强度也存在差异 （图 2 ） 。 3 . 1 . 3生鲜乳中不同复原乳含量对色氨酸荧光特性的 影响利用市售的 S L和 H L两种奶粉制成复原乳后 和生鲜乳按不同梯度配比，然后在激发波长为 2 9 0 n m ，发射波长从 3 0 0 n m 4 6 0 n m处得到荧光图谱 （如图 3 ） 。从图 3 知，随着生鲜乳中复原乳含量的增 加， 色氨酸的相对荧光强度逐渐降低， 二者之间存在 较强的线性关系 （图 4 ） 。 图1不同稀释浓度对生鲜乳中色氨酸相对荧光强度的影响 （E 2 5 和 E 1 0 0 分别表示稀释 2 5 倍和 1 0 0 倍） 畜牧兽医科学 2 中国农学通报第2 2卷 第1 1期2 0 0 6年1 1月 h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n 图4生鲜乳中复原乳含量与色氨酸荧光强度之间的关系 图5牛奶在巴氏灭菌后对色氨酸荧光强度的影响 3 . 1 . 4加热处理对色氨酸荧光强度的影响通过比较 生鲜牛奶和巴氏纯鲜牛奶巴氏牛奶的荧光光谱 （激发 波长为 2 9 0 n m ） ， 结果显示 （图 5 ） ， 巴氏牛奶杀菌过程 后经巴氏杀菌后 （7 2 ， 2 0 s ） ， 检测样品中色氨酸的荧 畜牧兽医科学3 C h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 2N o . 1 1 2 0 0 6N o v e m b e r h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n 图6复原乳含量对巴氏牛奶中色氨酸荧光强度的影响 图7巴氏杀菌乳中复原乳含量与色氨酸荧光强度之间的关系 光强度( 见图 6 ) 。 从图 6 可以看出， 随着复原乳含量的增加， 巴氏 牛奶中色氨酸的荧光强度逐渐降低， 二者之间仍存在 强的线性关系 （图 7 ） 。 因此， 这一规律能够对判断巴氏 灭菌奶中是否添加复原乳提供依据。 3 . 1 . 4市售巴氏杀菌乳中色氨酸荧光强度不同品牌 图8市售不同奶粉之间色氨酸相对荧光强度比较 （D 1 9 D 2 5 表示不同的市售奶粉制成的复原乳） 畜牧兽医科学 4 中国农学通报第2 2卷 第1 1期2 0 0 6年1 1月 h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n 奶粉其生产的具体工艺之间存在差异， 因此牛奶在加 工处理的过程中经受的热处理过程也会不同， 因此对 色氨酸产生不同程度的破坏， 其损坏的程度可以从奶 粉制成的复原乳中色氨酸的荧光强度体现出来（图 8 ） 。 3 . 2梅拉德早期反应产物的荧光特性 3 . 2 . 1生鲜乳和巴氏杀菌乳中梅拉德早期反应产物的 相对荧光特性热处理导致部分蛋白质变性，同时形 成梅拉德反应的荧光产物， 因此也改变了蛋白质中色 氨酸的荧光特性。图 9 为生鲜牛奶在水浴 7 2 2 0 s 后不同激发波长下 （E x = 2 9 0 3 6 0 n m ） 的发射光谱 （E m = 3 0 0 6 5 0 n m ） 。 图9生鲜乳在7 2 2 0秒处理前后荧光光谱变化 图1 0生鲜乳在7 2 2 0秒处理前后色氨酸和梅拉德反应产物荧光强度变化 （A表示 E x =3 3 0 n m时， E m在 3 0 0 n m 5 5 0 n m之间生鲜乳的荧光特性； B表示 E x =2 9 0 n m时， E m在 3 0 0 n m 5 5 0 n m之间生鲜乳的 荧光特性； C表示 E x =3 3 0 n m时， E m在 3 0 0 n m 5 5 0 n m之间巴氏杀菌乳的荧光特性； D表示 E x =2 9 0 n m时， E m在 3 0 0 n m 5 5 0 n m 之间巴氏杀菌乳的荧光特性） 畜牧兽医科学5 C h i n e s e A g r i c u l t u r a l S c i e n c e B u l l e t i n V o l . 2 2N o . 1 1 2 0 0 6N o v e m b e r h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n 甲基赖氨酸的荧光强度， 该结果与利用 H P L C检测的 呋喃甲基赖氨酸的变化规律一致 3 。 3 . 2 . 3F A S T指数在复原乳判定中的应用通过上述的 试验结果表明， 在特定的激发波长 （E x ） 和发射波长 （E m ） 下， 奶样中的荧光物质因样品的特性而呈现规 律 性 变 化 。 尤 其 当E x / E m = 2 9 0 / 3 4 0 n m 和 E x / E m = 3 6 0 / 4 4 0 n m时， 分别为色氨酸和梅拉德反应产 物荧光信号的特征检测区。 发射光谱显示两个峰 （如图 9 示） ， 其中， 发射光 谱在 3 0 0 4 5 0 n m区域内可以区分色氨酸 （最大吸收峰 在 3 4 0 n m附近） 和梅拉德反应 （最大吸收峰在 4 1 0 n m 附近） 的荧光光谱。由于梅拉德反应的荧光产物中结 合有蛋白质， 因此在梅拉德反应产物和一些含有色氨 酸残基的蛋白质间可能存在荧光漂移现象。从图 9 可 以看出， 随着激发波长的的增加， 发射光谱最大峰的 波长逐渐增加。 图 1 0为激发波长分别在 2 9 0 n m和 3 3 0 n m处生 鲜乳在 7 2 加热处理前后特征荧光物质变化图谱。 当 在特定的激发波长下， 生鲜乳和生鲜乳经 7 2 2 0 s 加 热处理后发射光谱的最大峰均在同一发射波长下。而 且， 明显可以看出热处理影响牛奶的荧光特性。当牛 奶在 7 2 加热后， 3 4 0 n m处的荧光强度显著降低， 而 在 4 1 0 n m处的荧光强度明显升高 （图 8 ） 。 3 . 2 . 2复原乳中梅拉德反应的荧光特性由于牛奶在 制作奶粉的生产过程中会经过不同的温度处理， 因此 该过程会伴随着梅拉德反应的发生。因此当牛奶中含 有利用奶粉制作的复原乳时， 会改变牛奶固有荧光物 质的荧光强度。利用全脂奶粉按不同比例和生鲜乳混 合后， 水浴 7 2 加热 2 0 s ， 然后检测 3 6 0 n m / 4 4 0 n m处 的荧光强度 （图 1 1 ） 。 从图 1 1 可以看出， 随着复原乳含 量的增加，所检测的荧光强度呈线性增加。由于 3 6 0 / 4 4 0 n m处的荧光强度主要为梅拉德反应产物呋喃 图1 1复原乳中梅拉德反应产物的荧光特性 图1 2复原乳含量与色氨酸荧光强度及热敏感指数之间的关系 （WD S 0 WD S 1 0 0 表示不同复原乳的含量） 畜牧兽医科学 6 中国农学通报第2 2卷 第1 1期2 0 0 6年1 1月 h t t p : / / w w w . c a s b . o r g . c n 7 2 加热后牛奶 F A S T指数与其中复原乳比例 拟合数学模型 （f i s t o r d e r ） ， 结果如图 1 2 示。 其中， 横轴 表示色氨酸的荧光强度， 而纵轴表示 F A S T指数。从 该图可以看出， 利用 F A S T指数能较好的区分不同复 原乳的含量。为了进一步验证该指数的区分效果， 试 验对 6 个生鲜乳样品 （a 1 - a 6 ） 、 6 个生鲜乳均质后 7 2 2 0 s 杀菌后样品（b 1 - b 6 ） ， 6 个已知加工原料及工艺的 市售巴氏杀菌乳( c 1 - c 6 ) 和两个未知工艺和原料的市 售巴氏杀菌乳( Y L和 MN ) 进行测定， 结果如图 1 3 。 从图 1 3 可以看出，利用 F A S T指数对于生鲜乳 和巴氏杀菌乳的区分非常灵敏。图 1 3 中检测的样品 可以区分为 3 类， 即生鲜乳样品 、 生鲜乳加工的巴氏 杀菌乳样品和市售巴氏奶样（G M和 Y L ） ，样品 G M 和 Y L明显不同于其它巴氏杀菌乳，其色氨酸的荧光 强度相对最低， 而热敏感指数最高。由于此项研究中 未能获得不同复原乳含量的巴氏杀菌乳以及 U H T牛 奶的标样， 因此在试验中对是否使用复原乳只做出了 定性的判断； 同时， 需要说明的是， 该指数仅适合于对 标准生产工艺条件下巴氏杀菌乳质量的评定， 如果牛 奶样品未严格按照巴氏杀菌乳生产工艺而过度加热 或者存在高含量的回流乳时应用该方法容易引起误 判。 4小结 通过上述系列试验结果表明， 利用 F A S T指