17βE2对SD大鼠股骨骨髓单个核细胞 CD44、CD54表达的影响.pdf

西郑医学 2 0 0 8年 3月 第 2 0 券第 2期me dj we s t c h i n a ， ma r c h2 0 0 8 ， vo l . 2 0 ， n o . 2 1 7 p 一 e : 对s d大鼠股骨骨髓单个核细胞 c d 4 4 、 c d 5 4 表达的影响 王松1.2， 沈霖 ， 杨月琴2 ， 金丽2 (1. 华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合骨科， 2 . 武汉体育学院运动人体科学系， 湖北武汉 4 3 。 。 7 9) 【 摘要】 目的 研究不同浓度的17 卜 e : 对友骨健单个核细胞c d 4 4 、 c d 54表达的影响。方法通过免疫细胞化学 及圈 像分析、 统计学等方法来检刹分析不同浓度的(1 。 一、 10一 ， 、 1 0 一m ol / l ) 17卜 e : 作用体外培养的s d大成甘健单个核 细胞不同时间( 2 4 、 4 8 、 7 2 h ) 后， 细胞的c d 4 4 、 c d 5 4 的表达.结果 超过其生理浓度的1 7 卜 e : 使c d 4 4 的表达下降， 1 7 卜 e : 组随其作用时间的延长， c d 44的表达呈下降趋势. 1 7 各 e : 抑刹骨健单个核细胞c d 54表达， 其作用与别童、 时 间的呈依粕关系。结论不同浓度的雌激素在不同的时间抑制了体外培养的劳健单个核细胞c d 44、 c d 54 的表达， 并可 能由此影响细胞的分化。 【 关健词 雌激素， 单个核细胞， c d 4 4 ， c d 5 4 t 中图分类号i r 3 6 51 文献标识码i at 文章编号】 1 6 7 2 一 3 5 1 1 ( 2 0 0 8 ) 0 2 一 0 2 5 3 一 0 3 e f f e c t o f 1 7 p 一 e : o nt h ee x p r e s s 1 0 llo fcd4 4a n dcd5 4 o f ma r r o ws i n g l e 一 n u c l e u s c e l l s wa n gs o n g l z s h e nl i n ， ， y a n gy u e 月i n z ， et公 (l. u ， 俪 月“ 户 it aloft o ” 护 入 介 己 alc o i le geofh 如之 九 劝 g u n ity ofsc如“朋d 7 飞 c h ， 咖gy。 2 . 及户 a rt 二 t of hu 二 n sp喇: s c i oc e of wu ha二 inst “ 吮 of p 勺 介 以e 己 。 t 咖 ， wu ha，4 3 0 0 7 9 ， chi na) a b s t r a c t 】 0 b j e c t i v e t or e s e a r c ht h e e x p r e s s i o n o f c d 4 4 a n d c d 5 4 i nm a r r o ws i n g l e 一 n u c l e u s c e l l s c u l t u r e dw i t h d i f f e r e n t 。 o n c e n t r a t i o nso f 1 7 卜 e z . me t h o d s l m m u n o c y t o c h e m i s t r y ， i m a g e a n a l y s i s a n d s t a t i s t i c a n a l y s i : w e r e u s e dt o d e t e r m i n e a n da n a l y s e t h ee x p r e s s i o no f c d 4 4 a n dc d 5 4i nt h em a r r o ws i n g l e 一 n u c l e u s c e l l s c u l t u r e dw i t hd i f fe r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f l 7 卜 e : a n dt i m e . r e s u l t s wh e n t h e c o nce n t r a t i o no f l 7 卜 e : w a s b e y o n d p h y s io l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n ， t h ee x p r e s s i o no f c d 4 4i nt h em a r r o ws i n g l e 一 n u c l e u s c e l l sw a sd e c r e a s e d .t h ee x p r e s s i o no f c d 4 4i na l l t h ema r r o w s i n g l e 一 n u c l e u sc e l l sc u l t u r e dw i t hd i f fe r e n tc o n c e n t r a t i o n so fl 7 卜 e : w a sd e c l i n e dg r a d u a l l ya st i m ew e n to n .t h e e x p r e s s i o no f c d 5 4 i n m a r r o ws i n g l e 一 n u c l e u ， c e l l s w a s i n h i b i t e d b y1 7 户 e : . t h e i n h i b i t e d a c t i o n o f l 7 卜 e : w a 。 i n c r e a s e d b y t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f l 7 卜 e : o r a l o n g e r t i m e c u l t u r e . c o n c l u s i o n 1 7 卜 e : c a n i n h i b i t t h e e x p r e s s i o n o f c d 4 4 a n dc d 5 4 i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d d i f f e r e n t t i m e o f c u l t u r e ， w h i c hi s p r o b a b l y t h e c h a n n e l fo r 1 7 卜 e : t o i n f l u e n c e t h e d i f f e r e n t i a t i o no f m a r r o ws i n g l e 一 n u c l e u s c e l l s . k e y w o r d s 】 e s t r o g e n ， s i n g l e 一 n u c l e u s c e l l s ， c d 4 4 ; c d 5 4 目前研究表明成骨细胞和破骨细胞以及单个核细 胞都有雌激素受体， 雌激素通过其受体对它们有着直 接调控作用， 这将直接影响着一些细胞的生理活 动l.2 。大多数研究是关于雌激素对培养的成骨细胞/ 破骨细胞活性功能以及一些细胞因子合成的影响3. 们 ， 而关于雌激素对骨髓单个核细胞的粘附分子影响的研 究甚少。 在体外， 雌激素对骨髓单个核细胞粘附分子的 表达是否有影响呢?是否存在着剂量和时间方面的关 系呢? 因此， 我们研究不同雌激素水平对鼠骨髓单个核 荟金项目: 湖北省自然科学基金( n o . z o 04a b a z o s) 细胞粘附分子c d 44、 c d 54 表达的影响， 以期进一步 阐明雌激素作用机理。 1 材料与方法 1 . 1 实验材料和试剂s d大鼠由华西医大实验动物 中心提供、 淋巴细胞分离液( 上海试剂二厂) 、 d me m ( g i b c o b r l) 、无 酚 红 r p mi 一 1 6 4 0 培 养 液 ( g i b c o b r l ) 、 1 7 件 e : ( s i g m au s a) 、 新生小牛血清 ( 成都哈里生物工程有限公司) 、 兔抗人、 大鼠、 小鼠h - c a m 抗原( c d 4 4 ) ( 武汉博士德生物工程有限公司) 、 兔抗大鼠、 小鼠细胞间粘附分子(cd 5 4 ) ( 武汉博士德 生物工程有限公司) 、 s a b c免疫组化染色试剂盒( 武 万方数据 西部医学 2 0 0 8 年3月 第2 0 券第2 期me dj we s t c h i n a ， ma r c h2 0 0 8 ， v o l . 2 0 ， n o . 2 汉博士德生物工程有限公司) 。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 骨髓单个核细胞的分离与培养选用去势4 周s d大鼠2 只( 约2 50克) ， 颈椎脱臼法处死， 无菌条 件下分离股骨胫骨， 置于75%酒精中浸泡约 1 分钟。 h ank s 液洗涤， 咬去股骨、 胫骨两端， 用注射器吸 10 m l l 一 d n e m培养基( 含青霉素l o o u / m l 、 链霉素1 0 0 u/ ml)冲出骨髓， 制成骨髓细胞悬液。离心， i 0 0 0r / m i n ， 1 0 分钟。 ) 弃上清， 用d me m 3 m l 重悬细胞， 并 将细胞悬液贴壁轻轻加人到预置等体积淋巴细胞分离 液( 比重 1 . 0 7 7 ) 的离心管中。离心， z o o o r / m i n ， 3 0 分 钟。 收集云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中， 用 l 一 d me m培养基洗涤两次， l o o or / m i n ， 离心 5 分 钟。弃上清， 用含10%新生小牛血清l 一 d me m重悬， 用血球计数板计数细胞. 调整细胞浓度为l x 1 o s / m l ， 接种于24孔培养板中( 预先放人大小适宜并处理过的 盖玻片) ， 含 10写新生小牛血清、 青霉素l oou / m l ， 链 霉素 1 0 0 u/ m l 的l 一 d me m 于 3 7 ，c， 5%c o : 恒温培 养箱中培养24小时。 各组分别加人浓度为10一 、 1 0 一 ， 、 1 0 一m o l / l的1 7 卜 e : 培养2 4 、 4 8 、 7 2 小时。 1 . 2 . z s a b c法检测c d 4 4 、 c d 5 4 的表达将取出的 盖玻片用p b s ( 0 . o l m o l / l ， p h 7 . 4 ) 清洗， 1 分钟， 2 次。用丙酮( 80%) 固定， 10分钟。空气干燥， 10分钟。 用p bs 清洗， 2 分钟， 2 次。用3 %过氧化氢孵育15分 钟。 用p bs 清洗， 2 分钟， 2 次。 滴加封闭用血清， 室温 孵育 1 5 分钟。吸去血清， 滴加一抗( c d 4 4 、 c d 5 4 、 1 / 2 0 0 ) ， 阴性对照片以p b s 代替， 4 过夜。 用p bs 清洗， 5 分钟， 3 次。滴加生物素化二抗， 37， 30 分钟。用 p b s清洗， 5 分钟， 3 次。加s a b c ， 37， 30分钟。用 p bs 清洗， 5 分钟， 3 次。加d a b显色剂显色5 分钟。 自来水冲洗 2 分钟， 苏木素轻度复染 30秒， 自来水冲 洗 5 分钟。常规脱水、 透明、 封片。 1 . 2 . 3 图像分析及统计学处理采用美国c i ma g i n gs y s t e ms软件来检测细胞 c d 4 4 、 c d 5 4 的表达强度( 灰度值) ， 将所测数据( 每组随机25个视 野下的灰度值的平均值) 做多个样本嵌套设计的方差 分析。以a =。 . 05 为检验水准。 2 结果 2 . 1 不同时间、 不同浓度雌激素对骨髓单个核细胞 c d 4 4 表达的影响从表1 看， 24 h ， 不同浓度的灰度 值不同( f =74. 7 58， 尸 = 。 . 0 0 0)， 且任意两浓度的 灰度 值比 较均不同( 9 为5 . 6 0 一2 0 . 3 9 ， 均尸 0 . 0 1 ) ; 4 s h ， 不同浓度的 灰度值不同( f = 53. 275 ， 尸 =。 . o 0 0 ) ， 10一 m ol/ l与 1 0 一 7 m ol / l 、 1 0 一 “ m ol/ l的灰度值均相近( q 为3.50、 。 . 90， 尸 0 . o 5 ) ， 其余任意两浓 度比较， 灰度值均不同( q 为4 . 4115. 86， 均尸 0 . 05) ， 其余任意两浓度比较， 灰度值均不 同匆为4 . 8 4 1 3 . 6 7 ， 均p 0.05) ， 其余任意两浓度比较灰度值均 不同( q 为5 . 4 6 1 2 . 6 1 ， 均p 0 . 0 5 ) ， 其 余任意两浓度比 较灰度值均不同) ( q 为7 . 8437. “， 均 p 0 . 0 1 ) ; 7 2h ， 仅 1 0 一 m o l / l与 1 0 一 7 m o l / l的灰 度值相近， 其余任意两浓度比较灰度值均不同( q为 4 . 4 0 一1 9 . 8 9 3 ， 均 p 0 . 0 1 ) 。 .2 培养单个核细脸c d s4 班达的灰度值任士，) 几b . z n. 9 ，y . c . 1 . o f . x p r es s i o u o f c d 5 4 1 二 i n g l 卜 n u c l . 此改l l s l n v l t ro( 万 士， ) 浓度 ( m o l / l ) 1 0 一 1 0 一 ， 1 0 一 对照组 培养时间( h ) 2 44 87 2 1 4 2 . 4 1 士1 5 . 0 6 1 5 6 . 6 2 士 3 . 7 6 1 5 6 . 4 9 士 5 . 4 1 1 3 1 . 5 5 士1 1 . 1 8 1 8 1 . 5 9 士 3 . 3 9 1 7 8 . 4 0 士 1 . 5 5 1 9 5 . 2 7 士1 5 . 1 0 1 2 9 . 5 2 士 7 . 9 3 1 8 2 . 6 2 士 5 . 8 8 1 7 9 . 2 7 士 7 . 4 5 1 9 2 . 4 6 士1 0 . 7 1 1 4 8 。 0 9 士1 7 . 2 0 注: 调整 。 =0 . 0 1 7 3 讨论 3 . 1 雌激素对单个核细胞粘附分子c d 44、 c d 54表 达的影响目前研究表明: 雌激素能激活或抑制一些 细胞因子、 蛋白的表达。 雌激素能加强成骨细胞胶原的 合成， 能加强降钙素( c t ) 的分泌和1 ， 2 5 ( o h ) 2 d 3 的 合成， 能降低il一 1 ， i l 一 6 的产生卜7 。 已有实验证实: 雌 激素的功能作用是通过其受体发挥的。雌激素受体存 在于胞浆， 作为转录因子发挥调节作用， 当雌激素与胞 浆受体结合时可使受体激活， 激活的雌激素受体与雌 激素反应元件( 一个 2 3 k b的d n a回文序列) 结合而 引起靶基因的激活或抑制 卜川。 万方数据 西部医学 2 0 0 8 年 3月 第2 0 卷第2 期me dj we s t c h i n a ， ma r c h2 0 0 8 ， v o l . 2 0 ， n o . 2 本研究观察到对照组中培养的单核细胞c d 44 的 表达呈阳性， 随培养时间的延长其强度下降。在 24小 时内当浓度为 1 0 一m ol / l17卜 e : 的作用下， 与对照组 相比单个核细胞粘附分子c d 44 的表达强度增高， 但 当浓度为 1 0 一 、 1 0 一 7 m o l / l时与 1 0 一 吕 m o l / l 、 对照组 相比， c d 4 4 的表达强度降低。这提示: 一定浓度的雌 激索在某一时间点， 激活细胞c d 44大量表达， 但在另 一个作用条件下， 雌激素又能抑制c d 44 的大量表达。 c d 4 4 的表达在4872 h之间都有下调的趋势， 这可 能是由于c d 4 4自身具有负反馈的机制。最近研究表 明c d 4 4 不仅具有粘附功能的作用， 还具有胞内新信 号分子的传递作用。在细胞迁移和肿瘤细胞的生长调 控中， c d 44 传递着诸多的信号通路， c d 44 能增强 t p a( 1 2 一 。 一 t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l 一 1 3 一 a c e t a t e ) 反应元 件 介 导 的 转 录 活 动 lz . 本研究观察到对照组中培养的单核细胞c d 54都 呈强阳性表达， 在 244 8 h内其表达最强。不同浓度 的 1 7 户 e : 组与对照组相比， 单个核细胞粘附分子 c d 54的表达均有所降低， 并且在24小时内17卜 e : 对 单个核细胞c d 54表达的抑制作用呈剂量依赖关系 ( 雌激素的浓度愈高， 细胞c d 54 的表达愈低) ; 在24 4 8 h内细胞c d 54的表达都有下降趋势。 这提示: 雌激 素的浓度及作用时间对细胞粘附分子c d 54表达有较 大的关系， 雌激素抑制单个核细胞c d 54 的表达. 有研 究表明: 绝经期妇女用雌激素治疗可降低血浆中粘附 分子c d 54的含量， c d 54表达的抑制可能是其对女性 心血管系 统保护作用的 重要组 成部 分13 l1。 不同浓度的雌激素在不同的时间影响着体外培养 的骨髓单个核细胞粘附分子的表达， 并且这些粘附分 子的表达将影响着细胞的分化。本研究发现: 当浓度 为 1 0 一m ol/ l( 大鼠的生理浓度) 的 17各 e : 时细胞 c d 4 4 的表达最强， 超过其生理浓度时c d 44 的表达下 降。 雌激素组随着雌激素作用时间的延长， c d “的表 达呈下降趋势。c d 44作为信号分子具有负反馈的机 制。一定浓度的c d 44介导单核细胞的融合最终形成 多核的破骨细胞。雌激素能抑制骨髓单个核细胞 c d 5 4 的表达， 这种抑制作用呈剂量依赖关系， 并且随 着作用时间的延长c d 54 的表达呈下降趋势。缺乏雌 激素时， c d 54 的表达呈强阳性， 随培养时间的延长 c d 5 4的表达呈上升趋势， 而且这强阳性表达多限于 在融合的多核破骨细胞， c d 54参与了破骨细胞的形 成及粘附作用. p r o l if e r a t i v e r e s p o n s e ， t o s tr a in a n d1 7 bet a 一 e s t r a d i ola r e m e d i a t e d b y t h e e s t r o g e n r e c e p t o r a n dt h e r e c e p t o r fo r i n s u l i n 一 l i k e g r o w t h f a c t o r l j . j bon e mi n e r r e 。 ， 2 0 0 6 ， 1 7 ( 4 ) : 5 9 3 一 6 0 2 . 2 n i l s s o ns ， g u s ta f ， s o n j a . est r o g e n r e c e p t o r a c t io n j . c r i t r e v e u k a ryo t g e n e e x p r ， 2 0 0 5 ， 1 2 ( 4 ) . 2 3 7 一 5 7 ， 5 w e itz man n m n ， 而g g iac ， t o r a l d o g ， w e i t z man n l . i n c r e a s e d p r odu c t i o n o f i l 一 7 u nco u p le s bonefo r mat i o n f r o mbo讹r e s o r p t i o n d u r i n ge s t r o g e nd e f i c io n c y j .jc l i nlnv e s t ， 2 0 0 6 .1 1 0 ( 1 1 ) : 1 6 4 3 一 1 6 5 0 . 4 d u q u e g ， a bda i m i k e ， ma c o r i t t om. est r o g e n s( e z ) r e g u l a t e e x p r e s s i o na nd re s p o n ， eo f l ， 2 5 一 d ih y d r o x y v it a m ind 3r e c e p t o r s i n 比ne。 e l l : : 。 ha叱e : w i t h。 9 1 吃 。 n dh o r m o ned e p r iv a t i o n j . b i och e mb io p h y s r e s com m u n ， 2 0 0 2 ， 2 9 9 ( 3 ) : 4 6 4 一 4 5 4 . 5 x in gl ， c a r l s o nl ， s t o 邝 b ， eta l .e x p r e s s io no f e i t h e rn f - k a p p a bp 5 o o r p 5 2i n o s t e ocl a s t p r e c u t s o r s isr e q u i r e df o r l l 一 1 - in d u c e d b o n e re s o 印 t io n j . j bon e mi n e r r e s ， 2 0 0 3 ， 1 8 ( 2 ) : 2 6 0- 2 6 9 . 6 反h a e fe r t m， w r ig h t j a ， p i o l i p a， wi r 。 c r . i l 一 l b e r a 一 m e d i a t e d p r o i n f l a m mat o 叮r e s 卯n s e o a r ei n h ib i t e db ye s t r a d io l v iad o w n - r e g u l a t io n o f il一 i re c e p t o r t y p ei i nu t e r i n e e p i t h e l ia l c e l l : j . i m m u n o l o g y ， 2 0 0 5 ， 1 7 5 ( 1 0 ) : 6 5 0 9 一 6 5 1 6 . 7 t s u k i h a r 。 5 ， h a r a d a t ， deu r a l ， tta l . i n t e r l e u k i n 一 l b e t a 一 i n d u c e d e x p r e s s i o n o f i l 一 6 a ndp r 目u c t io n o f h u ma n c h o r i o n i c g o n ado t r o p i ni n h u ma nt r o p h o b l a s tc e l l ，v i an u c l e a rfa c t o r - k a 即a ba c t i v a t io n j .r e p r 团u c tlmm u n o l ， 2 0 0 4 ， 5 2 ( 3 ) : 2 1 8 - 2 2 3 . 8 mc car t h yt l ， h och ber gr b ， l a b a r e el 犯，cen t r e l l am.3 - k e t o s t e r o id re d u c t a s e a c t i v i t y a nde x p r e s s io n b y f e t a lr a t 0 o t e o b l a s t j . bi o l o g ic a l c h e m i s t 仔， 2 0 0 7 ， 2 5 ( 3 ) : 2 4 3 一 2 4 6 . 9 w泣 n d a h ls h . i d e n t i f ic a t io no ft a r g e tcel lsf o rt h ec e n o m ic e f f e c 切o f e s t r o g e n :inbon e j .e n d ocr inol o g y ， 2 0 0 7 ， 3 0 ( 4 ) : 2 6 7 一 2 7 0 . 1 0 m