亚油酸刺激胰岛β-细胞胞浆游离钙水平升高的机制.pdf

生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2010, 62(6): 529-534 529 研究论文 Received 2010-09-24 Accepted 2010-11-08 This work was supported by National Key Technology R E-mail: zhaoyf ; DONG Lei, Tel: +86-29-87679279; E-mail: donglei4488 亚油酸刺激胰岛 细胞胞浆游离钙水平升高的机制亚油酸刺激胰岛 细胞胞浆游离钙水平升高的机制 王 莉1，付荣国1，刘晓丹1，桂保松1，孙 强2，陈 晨2，赵玉峰3,*，董 蕾1,* 1西安交通大学医学院第二附属医院，西安 710004；2 西安交通大学医学院，西安 710061；3 第四军医大学教学实验中 心，西安 710032 摘摘 要：要：为明确亚油酸影响胰岛 细胞的胞浆游离钙水平(Ca2+i)的作用和机制，本研究运用胶原酶灌注消化法原代培养大 鼠胰岛细胞，使用钙离子荧光指示剂Fluo-3 负载细胞后在共聚焦显微镜下观察Fluo-3 荧光强度以反映Ca2+i变化，灌流给 药观察亚油酸等药物的作用，记录结束后采用免疫细胞化学染色方法鉴定 细胞。结果显示，亚油酸(20 mol/L)刺激 细 胞 Ca2+i升高，表现为最初的峰型升高和随后的较为持久的平台期升高。平台期升高可被去除细胞外液中Ca2+所阻断，也 可被瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道的阻断剂La3+所抑制，峰型升高和平台期升高均被耗竭细胞内钙库 的Ca2+或者抑制磷脂酶C活性所阻断。结果表明，亚油酸通过刺激 细胞内钙库的Ca2+释放和激活TRP 通道，导致Ca2+i升高。 关键词：关键词：亚油酸；胰岛； 细胞 中图分类号：中图分类号：R335+.6 Effects of linoleic acid on intracellular calcium concentration in primarily cul- tured rat pancreatic -cells and underlying mechanism WANG Li1, FU Rong-Guo1, LIU Xiao-Dan1, GUI Bao-Song1, SUN Qiang2, CHEN Chen2, ZHAO Yu-Feng3,*, DONG Lei1,* 1 The Second Affiliated Hospital of Medical School, Xian Jiao Tong University, Xian 710004, China; 2 Medical School of Xian Jiao Tong University, Xian 710061, China; 3Experiment Teaching Center, Fourth Military Medical University, Xian 710032, China Abstract: In this study, we investigated the mechanism of linoleic acid-stimulated increase in intracellular calcium concentration (Ca2+i) in pancreatic islet -cells. Pancreatic islet cells were primarily isolated from rats and cultured for the experiments. The cells were loaded with Fluo-3/AM, the indicator of Ca2+i, and the intensity of Fluo-3 was measured using confocal microscope. The islet -cells were identified by immunocytochemical staining with insulin antibody after recording. The drugs were given by perfusion system. The results showed that linoleic acid (20 mol/L) stimulated Ca2+i increase with the first peak increase and the following plateau increase. Linoleic acid-stimulated Ca2+i increase was partly inhibited by removal of extracellular calcium and by transient receptor potential (TRP) channel blocker, La3+, and it was totally blocked by exhaustion of intracellular calcium stores and inhibition of phospholipase C. It is concluded that linoleic acid stimulates Ca2+i increase in islet -cells through both extracellular calcium influx via TRP channels and calcium release from intracellular calcium stores. Key words: linoleic acid; islets; -cells 胰岛 细胞分泌胰岛素，发挥调控物质代谢的 重要作用。细胞内游离钙水平(Ca2+i)是调控胰岛 素分泌的关键因素1，多种物质通过改变胰岛 细 胞Ca2+i而调节胰岛素分泌，游离脂肪酸是其中的 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2010, 62(6): 529-534 530 微镜下，调节记录的各项参数，灌流给药，连续 记录 Fluo-3 发射光强度的变化。信号采集频率为 5 s/ 幅。共聚焦显微镜记录后，应用 Fluoview-500 软 件系统对单个细胞的荧光强度进行分析。正常细胞 外液成分如下：NaCl 140 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、 CaCl2 2.4 mmol/L、MgSO4 1.2 mmol/L、NaH2PO4 0.4 mmol/L、Na2HPO4 0.34 mmol/L、NaHCO3 2 mmol/L、 HEPES 10 mmol/L、葡萄糖 3 mmol/L。无钙细胞 外液则去除 CaCl2，加入 EGTA 4 mmol/L。 1.4 免疫细胞化学染色 免疫细胞化学染色 胰岛 细胞的定性采用 免疫细胞化学染色完成。在记录Ca2+i结束后，细 胞用 4% 多聚甲醛固定 10 min。PBS 冲洗后，加入 3% H2O2孵育15 min，灭活内源性过氧化氢酶。PBS 清洗后，加入 10% 羊血清封闭 30 min，再加入胰 岛素抗体室温孵育 1 h。PBS 充分清洗后，加入辣 根过氧化物酶标记的二抗，室温反应 1 h。PBS 充 分清洗后，加入 DAB显色液显色，随后PBS清洗， 对显色结果进行照相保存。将免疫染色照片与共聚 焦显微镜记录的照片进行比对，确定胰岛素阳性细 胞即 细胞的Ca2+i的变化。 1.5 统计学分析 统计学分析 数据采用 meanSD 表示，采 用 t 检验和方差分析进行统计学处理。以 P0.05 为 有显著性差异。 2 结果结果 2.1 共聚焦显微镜记录与免疫组织化学染色的结果共聚焦显微镜记录与免疫组织化学染色的结果 图1A是在激光激发状态下记录视野内各个细胞 的荧光强度，连续动态记录分析即可反映荧光强度 变化。图 1B 是免疫细胞化学染色结果，通过与共 聚焦显微镜记录的细胞图进行对比，即可明确所记 录细胞中的胰岛细胞，即胰岛素阳性细胞。图1C 是单个胰岛 细胞的Fluo-3 荧光强度在葡萄糖刺激 下的强度变化，此荧光强度变化反映了Ca2+i的变 化。 2.2 亚油酸刺激胰岛 细胞亚油酸刺激胰岛 细胞Ca2+i升高升高 亚油酸(20 mol/L)可快速刺激细胞内Fluo-3荧 光强度显著增强，提示Ca2+i升高。亚油酸刺激的 Ca2+i升高表现为最初的峰型升高和随后的较为持久 的平台期升高(图2A)。对亚油酸刺激后5 min 的平 均Ca2+i水平进行数据分析，统计结果如图 2B 所 示，胰岛 细胞的Ca2+i水平在亚油酸刺激后显著 性升高(n=30, P0.01)。 一个重要物质。游离脂肪酸不仅作为胰岛 细胞内 的代谢物质，近来的研究表明，游离脂肪酸还可通 过其细胞膜受体刺激胰岛 细胞Ca2+i升高，从而 影响胰岛素分泌2。 脂肪酸膜受体是新近发现的一个受体家族，其 中 GPR40 和 GPR120 是长链脂肪酸的膜受体3。 GPR40最先被发现特异性表达于胰岛 细胞，其激 活可刺激细胞Ca2+i升高4。游离脂肪酸激活其膜 受体后升高细胞Ca2+i的分子机制目前尚有争议。 有研究认为细胞内钙库的 Ca 2+ 释放是脂肪酸激活 GPR40 后引起 细胞Ca2+i升高的原因5，也有研 究认为GPR40激活细胞电压依赖性钙通道导致细 胞外Ca2+内流是Ca2+i升高的原因6。为进一步明确 游离脂肪酸刺激 细胞Ca2+i升高的分子机制，本 研究在原代培养的大鼠胰岛 细胞上观察了亚油酸 刺激 细胞Ca2+i升高的作用，并就其机制进行了 探讨。 1 材料与方法材料与方法 1.1 实验材料 实验材料 Sprague-Dawley (SD)成年雄性大 鼠，体重 200250 g，由第四军医大学实验动物中 心提供。亚油酸、胶原酶 V、dispase、Histopaque- 1077、thapsigargin、U73122 等试剂购自 Sigma 公 司，Fluo-3/AM 购自 Invitrogen 公司。胰岛素抗体 和 DAB 显色试剂盒购自 Dako 公司。 1.2 大鼠胰岛细胞的原代培养 大鼠胰岛细胞的原代培养 方法参见他人 报道7，具体如下：成年雄性 SD 大鼠在麻醉后颈 椎脱臼处死，无菌条件下开腹，夹闭胆总管入肠 处，沿胆总管注射10 mL胶原酶液(Hanks 液，0.1% 胶原酶 V)入胰腺。将膨胀的胰腺游离剪下，移入 离心管，37 静止消化 30 min，然后振摇分散胰 腺组织。充分清洗后，用 Histopaque-1077 密度梯 度离心收集胰岛。胰岛用蛋白酶消化液(D-Hanks 液，0.1% dispase)分散为单个细胞，种植于多聚赖 氨酸包被的盖玻片上，置于 5% CO2孵箱，37 培养。培养液用含 10% 新生牛血清的 RPMI1640完 全培养基。每 3 天换液，培养第 3 天至第 6 天的细 胞用于实验。 1.3 共聚焦显微镜技术测定共聚焦显微镜技术测定Ca2+i 培养的胰岛 细胞用 Fluo-3/AM 在 37 负载 20 min，随后用细 胞外液充分清洗后静置 20 min。待细胞稳定后，置 于灌流槽中，置于 Fluoview-500 奥林巴斯共聚焦显 531 王 莉等：亚油酸刺激胰岛 细胞Ca2+i升高的机制 图 1. 胰岛 细胞内游离钙水平(Ca 2+i)的测定 Fig. 1. The recording of Ca2+i in rat islet -cells using confocal microscope. A: The image of cells after Fluo-3 loading for Ca2+i recording. B: Immunocytochemical staining after Ca2+i recording using insulin antibody. C: Typical intensity changes of Fluo-3 in a labeled insulin- positive cell in response to glucose. Scale bar, 50 m. 图 2. 亚油酸刺激的胰岛 细胞Ca2+i升高 Fig. 2. Linoleic acid (LA)-stimulated Ca2+i increase in rat islet -cells. A: Representative response of -cells to LA. B: Analysis of Fluo-3 intensity in control and LA groups. Data are expressed as meansSD, n=30. *P0.01 vs Control. 生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2010, 62(6): 529-534 532 2.3 细胞外细胞外 Ca2+和细胞钙库内和细胞钙库内 Ca2+在亚油酸刺激 的 细胞 在亚油酸刺激 的 细胞Ca2+i升高中的作用升高中的作用 细胞用无钙灌流液(细胞外液去除钙离子并含2 mmol/L EGTA)孵育 5 min 后，亚油酸刺激仍可引 起 细胞Ca2+i的峰型升高，但是随后的平台期升 高被消除(图 3A，n=23)。随后，我们观察了细胞 内钙库耗竭对亚油酸刺激的 细胞Ca2+i升高的影 响。用细胞内钙库的钙泵抑制剂 thapsigargin (10 mol/L)预处理细胞30 min，耗竭 thapsigargin敏感 性钙库的Ca2+后， 细胞受亚油酸刺激后无Ca2+i升 高(图 3B，n=20)。 2.4 钙离子通道阻断剂对亚油酸刺激的 细胞钙离子通道阻断剂对亚油酸刺激的 细胞Ca2+i 升高的影响升高的影响 运用10 mol/L镧离子(La3+)阻断瞬时受体电位 (transient receptor potential, TRP)通道后，亚油酸刺 激的细胞Ca2+i升高部分被抑制： Ca2+i升高的峰 型部分未受影响，而Ca 2+ i的平台期升高被阻断 (图 4A，n=26)。运用电压依赖性钙通道阻断剂尼 莫地平(1 mol/L)处理细胞，在尼莫地平存在的情 况下，亚油酸刺激的 细胞Ca2+i升高并未受到抑 制，其形态较正常对照细胞无显著差别(图 4B， n=21)。 图 4. 钙通道阻断剂对亚油酸刺激的胰岛 细胞Ca2+i升高的影响 Fig. 4. The influence of calcium channel blockers on linoleic acid (LA)-stimulated Ca2+i increase in islet -cells. A: LA-stimulated Ca2+i increase after La3+ treatment. B: LA-stimulated Ca2+i increase after nimodipine treatment. 图 3. 细胞外Ca2+和细胞内钙库Ca2+在亚油酸刺激的胰岛 细胞Ca2+i升高中的作用 Fig. 3. The role of extracellular calcium and intracellular calcium stores in linoleic acid (LA)-stimulated Ca2+i increase in islet -cells. A: Effects of removal of extracellular Ca2+ on LA-stimulated Ca2+i increase. The -cells were incubated with Ca2+ free perfusate before LA stimulation. B: Effects of exhaustion of intracellular Ca2+ stores on LA-stimulated Ca2+i increase. The -cells were incubated with thapsigarain (10 mol/L) before LA stimulation. 533 王 莉等：亚油酸刺激胰岛 细胞Ca2+i升高的机制 2.5 抑制磷脂酶抑制磷脂酶 C 对亚油酸刺激的 细胞对亚油酸刺激的 细胞Ca2+i 升高的影响升高的影响 细胞内磷脂酶系统在介导细胞内钙信号中具有 重要作用，用磷脂酶C抑制剂U73122 (5 mol/L)处理 细胞10 min 后，亚油酸刺激的细胞Ca2+i升高 被完全阻断(图 5，n=28)。 3 讨论讨论 脂肪酸作为细胞内代谢物质，可进入多种代谢 过程，产生众多的代谢中间产物，影响细胞功能。 近来，研究表明，脂肪酸不仅是代谢物质，而且 是细胞膜受体的激动剂，激活其细胞膜受体，进而 通过细胞内第二信号系统对细胞功能进行调节。本 研究发现，用磷脂酶C 抑制剂U73122 抑制磷脂酶 C进而抑制磷脂酰肌醇第二信号系统后，亚油酸刺 激的细胞Ca2+i升高被抑制，这提示亚油酸刺激 的Ca2+i升高由膜受体耦联的磷脂酰肌醇第二信号系 统所介导。本研究在细胞水平从Ca2+i变化角度进 一步提示脂肪酸膜受体途径参与调节胰岛细胞的 胰岛素分泌。 本研究显示，亚油酸刺激的 细胞Ca2+i升高 由细胞内钙库Ca2+释放和钙释放诱导的Ca2+内流所 介导。去除细胞外液中Ca2+后，亚油酸仍可刺激 细胞的峰型Ca2+i升高， 提示Ca2+i升高来源于细胞 内钙库的 Ca 2+ 释放。Thapsigargin 可通过抑制 thapsigargin敏感性钙库的钙泵活动而逐渐耗竭钙泵 内 Ca2+ 8，经 thapsigargin 处理后，亚油酸刺激的 细胞Ca2+i升高消失，提示thapsigargin敏感性钙 库是亚油酸刺激的峰型Ca2+i升高的钙源。亚油酸 刺激的细胞Ca2+i平台期升高在去除细胞外液中 Ca2+ 和耗竭细胞内钙库 Ca2+ 后均被抑制，这提示 Ca2+i的平台期升高是细胞内Ca2+ 释放和细胞外Ca2+ 内流共同作用的结果。细胞外Ca2+可通过电压依赖 性钙通道和钙释放诱导的钙内流等多种方式进入细 胞。钙释放诱导的钙内流是TRP通道所介导的一种 钙离子内流，通过细胞内钙库Ca2+ 释放后某种机制 所激活9, 10。La3+等重金属可阻断该通道11。本研 究表明，电压依赖性钙通道阻断剂尼莫地平不能阻 断亚油酸刺激的Ca2+i平台期升高，提示电压依赖 性钙通道并不参与亚油酸刺激的Ca2+i升高。TRP 通道抑制剂La3+则可阻断亚油酸刺激的Ca2+i平台 期升高。此结果提示，钙释放诱导的钙内流是亚油 酸刺激的Ca2+i平台期升高的原因。 综上所述，本研究表明亚油酸可刺激 细胞内 钙库的Ca2+释放和细胞外Ca2+内流，导致Ca2+i升 高，脂肪酸膜受体及细胞内磷脂酰肌醇第二信号系 统可能介导了亚油酸刺激细胞Ca2+i升高的作用。 本研究提示游离脂肪酸刺激胰岛素分泌的一个重要 原因是Ca2+i升高，进而在细胞内钙水平指出游离 脂肪酸对胰岛内分泌功能的影响。 参考文献参考文献 1Shuttleworth TJ. Intracellular Ca2+ signalling in secretory cells. J Exp Biol 1997; 200: 303-314. 2Nolan CJ, Madiraju MS, Delghingaro-Augusto V, Peyot ML, Prentki M. Fatty acid signaling in the beta-cell and insulin secretion. Diabetes 2006; 55 Suppl 2: S16-S23. 3Brown AJ, Jupe S, Briscoe CP. A family of fatty acid binding receptors. DNA Cell Biol 2005; 24: 54-61. 4Itoh Y, Kawamata Y, Harada M, Kobayashi M, Fujii R, Fukusumi S, Ogi K, Hosoya M, Tanaka Y, Uejima H, Tanaka H, Maruyama M, Satoh R, Okubo S, Kizawa H, Komatsu H, Matsumura F, Noguchi Y, Shinohara T, Hinuma S, Fujisawa Y, Fujino M. Free fatty acids regulate insulin secretion from pancreatic beta cells through GPR40. Nature 2003; 422: 173-176. 5Schnell S, Schaefer M, Schofl C. Free fatty acids increase cytosolic free calcium and stimulate insulin secretion from beta-cells through activation of GPR40. Mol Cell Endocrinol 2007; 263: 173-180. 图 5. 磷脂酶C抑制剂U73122 (5 mol/L)对亚油酸刺激的胰 岛 细胞Ca 2+i升高的影响 Fig. 5. The effects of inhibition of phospholipase C on linoleic acid (LA)-stimulated Ca2+i increase in islet -cells. Islet -cells were pre-treated with phospholipase C inhibitor U73122 (5 mol/L) for 10 min, and then the LA-stimulated Ca2+i increase was totally inhibited. 生理学报