低压液相层析色谱技术.ppt

第五章 低压液相层析（色谱）技术,慢 中等 快,色谱分离,液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称。,经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短,表11.1 两种不同形式液相色谱的这样特征,国产常压液相色谱系统的组成 层析柱 恒流泵 核酸蛋白检测仪 自动分部收集器 记录仪,一、低压液相色谱系统,层析柱 （a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子）,层析柱：填料的充填,恒流泵：提供稳定的液流,紫外检测仪：信号检测,部分收集器：样品的分部收集,记录仪：记录信号,BS100自动部分收集器安装圈 1反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16换向开关（逆、顺）；17手动开关,层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调蜾旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪,2、GE AKTA systems,AKTA prime,AKTA explorer,AKTA FPLC,3、Bio rad systems,二、柱层析法的一般技术,层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。 但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。,一、层析材料的准备 许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。 例如: 凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化 离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。,凝胶的前处理的方法,溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。 碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。,在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。,二、装柱 装柱是最关键的一步。 重力沉降法装柱 陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。 柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l3cm柱高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。,层析柱的形状，一般直径与高度的比为l：15为宜。 柱形必须根据层析介质和分离目的而定。 待分离物质的性质相近，柱越细长， 则分离效果越好，但流速较慢。 在样品组分并不复杂的情况下，采用“矮胖柱”。,三、平衡,层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于3-5倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。 检查柱是否均匀，可用蓝色葡聚糖2000，在恒压下走柱，如色带均匀下降，说明柱是均匀的，可以使用，否则应重新装柱,四、加样量和加样体积,加样量的多少和加样体积大小是影响分离效果的关键因素，加样量越少和加样体积越小，则分离效果越好。 它主要取决于层析目的(分析性柱层析或制备性柱层析)，也与样品中种类多少，相对浓度及亲和力有关。 对于分析性柱层析，加样量一般不超过床体积0.5-1，制备性柱层析加样量不超过1-3。 离子交换剂的加样量远远大于分子筛。 如果要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯度产品时，则样品的体积尽可能小。,1样品的准备,样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不同，预处理的方法也往往不同。 一般使其与起始缓冲液有相同pH，低的离子强度和尽可能小的体积。 预处理可酌情用超滤法、透析法和凝胶过滤法等进行浓缩和脱盐，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法除去。,2加样方法,有3种方法可将样品加到已制备好的柱顶： 1.简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加样；,保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂十分重要。 为此，除加样时注意不破坏胶面平整外，在整个层析过程中，应在胶面上端保留合适体积的洗脱液(约1-2 cm柱高)，避免洗脱液滴入柱内时，破坏胶面的平整或可能造成胶床干裂。,2.不需要让柱流干至床表面，而是加入1浓度的蔗糖来增加样品的密度； 3. 用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送到柱表面(如一些商品柱附有专门加样装置)。,洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。 使用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。 在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。,五、洗脱,六、流速及控制,洗脱液流速也往往影响层析的分辨率 在整个分离过程中，洗脱液通过柱时保持稳定的流速是十分重要的。 与流速有关的因素 所用介质的结构、粗细及数量； 层析柱大小，介质填装的松紧; 洗脱液的粘度、操作压等.,必须根据具体条件反复试验以确定一个合适的流速。 太高的流速使洗脱峰加宽，继而降低了分辨率； 过高时，有时会使流速先快后慢甚至发生阻塞。 流速可以通过调节“操作压”来控制，“操作压”相当于在柱上部的贮液瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差。,获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗脱液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。,七、分部收集,洗脱液必须分成小部分收集，每一部分相当于25的床体积。 这些部分一般被收集在试管中，使得在柱上已经分离的化合物仍然处于分离的状态。 每管收集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。,已有各种商品的自动部分收集器(fraction collector) 。它们设计成当一个管中收集了一定量的洗脱液后一个新的收集管自动地接替了它的位置。 预先确定的体积转移到每一个管中，或用电子控制的方法使预定的滴数滴入每一管。在一个固定的时间内，让洗脱液进入每个管。,八、检测和合并收集,洗脱液按一定的体积分别收集于试管中，为了测定收集的各部分中各种成分的分布须用一些能特异地检测被分离化合物的方法来进行分析，一般可用直接或间接方法， 直接法: 分光光度法、光折射法、荧光法和放免法等。 间接法: 化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法和生物活性测定法等。,如果某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫外光有吸收，如蛋白质在280nm，核酸在260nm处有最大的吸收。可用核酸白质检测仪。,洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。 欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的部分； 欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。,九、洗脱峰的纯度鉴定,由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗脱峰并不一定代表一个纯净的组分。 如果洗脱峰峰形不对称，或出现“肩”(shoulder)，则表示混有杂质。,对在一个特定的柱层析分离条件下显示出的每个峰要用几个纯度标准(一般2-3个高分辨率方法)来检验，才能确定它的均一性。 例如，可采用SDS电泳法、等电聚焦法、高效液相层析法和测定N末端氨基酸残基方法等。,十、脱盐和浓缩,洗脱峰在纯度鉴定的基础上，将同一组分合并。 若欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或超滤(去盐、去水)，透析去盐 再用冰冻干燥或有机溶剂沉淀等方法处理，得到干粉或沉淀。,科研、生产中要得到高纯度组分，往往要经过几次柱层析 每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐 超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再上第二次柱。,十一、凝胶的再生及保存,1、再生(一般无需做再生处理) 用过的凝胶经0.5M的NaOH(含0.5M的NaCI)混合液浸泡 当污染严重时用0.5MH