动物细胞大规模培养方法及其应用.ppt

Section 4：Scaling-up of cell culture 动物细胞的大规模培养,动物细胞大规模培养技术失建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。 主要包括： 悬浮培养 微载体培养 微囊化培养 中空纤维法,利用大规模培养哺乳类细胞是一项重要的生产生物制品的技术，包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单抗等，具有很高的经济和社会效益。,1、悬浮培养 动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。动物细胞没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气。 对于小规程培养多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。 悬浮培养，设备结构简单，有成熟的理论计算，可以借鉴微生物发酵的部分经验，放大效应小。 但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫强力。此外，有许多动物细胞属于贴壁依赖性的，不能悬浮培养。 悬浮培养的关键是要选择适当的搅拌和通气装置.,2、微载体培养系统 贴壁依赖性动物细胞的培养，最初是采用滚瓶系统，其结构简单、投资少，技术成熟，重现性好，放大只是简单地增加该瓶数。但是，滚瓶系统劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面积小。为了克服这些不利因素，1967年，van wezell开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞。微载体是直径为60250 m的微珠。采用微裁体系统培养动物细胞，细胞贻壁于微载体上，微载体(和细胞)悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层。,1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。 微载体是直径60-250m的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。,这种模式，把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起，具有两种培养方法的优点。 1) 表面积体积比大 2) 由于微裁体悬浮于培养基中，是均匀悬浮 培养，简化了细胞生长各种环境因素的监测和控制。 3) 培养基利用率高。 4) 采样重演性好。 5）收获过程不复杂。 6) 放大较容易。 7) 劳动强度小，占用空间小,与微载体结合的生物反应器系统,收获细胞 接种球传球,3、包埋培养 悬浮生长和对贴壁依赖生长的细胞都适用，细胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对悬浮生长的细胞用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖生长细胞用胶原包埋。由于动物细胞培养慢而费有高，且对剪切力敏感， 经包埋后可有效的保护细胞。,4、微囊化培养 在动物细胞微囊化的制备中，主要是应用海藻酸聚氨基酸的方法，简单过程是动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后再用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。动物细胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是关键材料。 微囊化方法能使细胞处于相对稳定、受剪切力小的环境中，而养分和氧又可以从微囊外的培养液扩散进入。,5、中空纤维培养系统,中空纤维是聚砜或丙烯的聚合物制成，一个培养筒内由数千根中空纤维所组成，然后封存在特制的圆筒中，组成的培养系统。每根纤维管内成为“内室”，可灌流无血清培养液供细胞生长；管与管之间称为“外室”。接种的细胞就贴在管壁上，并吸取“内室”渗透出来的养分，迅速生长繁殖。,中空纤维培养系统,自学：,1000L气升式细胞反应器 系统,中空纤维反应器：左右两箭头为无菌空气进出口。细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维中外表面。,典型动物细胞培养反应器 A 中空纤维反应器（贴壁反应器）,其中关键的是一个笼式撑拌器。笼式通气装置的特点主要是可以避免在向培养基中通气时，气泡不会直接损伤细胞。（因为气泡已被上部的200目丝网机械的破坏了。同时，在采用微教体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生泡沫所裹抉在气液界面。 导流筒随搅拌同步转动（3060rpm)时，由于离心力的作用，使搅拌器中心管内产生负压，迫使搅拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从三导 流筒口排出，绕搅拌器外缘螺旋下降，培养基和悬浮的细胞或附着细胞或微载体反复循环。由流体搅拌加流体循环，使反应器内流体混和相当好。,B、气腔式反应器（悬浮培养或微载体培养用:搅拌器形式之一）,无泡搅拌反应器是一种装有膜搅拌器的生物反应器，这种反应器的开发和应用在生产中同时解决了通气和均相化的要求。无泡搅拌反应器采用多孔的疏水性的塑料管装配成通气搅拌桨。由于选用多孔塑料管具有良好的氧通透性，从而实现无泡通气搅拌。由于这类反应器能提供动物细胞生长中所需的溶氧要求，产生的 剪切力较小以及在通气中不产生泡沫，避免了在其它反应器中常见的某些弱点，如泡队等，因而己广泛地应用于实验室研究和中试工业生产。 膜由聚丙烯或其它材料制成，它被加工成多孔的管。在多孔管内的气体压力不能超过鼓泡压力，即气泡在膜外表面出现的静止内压。对于不湿润的硫水膜，相对于水的气泡压力约在13X10Pa。上述这一要求是容易实现的，即加在管上的压力 应比管内流动压力降和气泡压力的总和高出10。在那种情况下，就可以形成管外的气掖界面层。即使当多孔管运动时单独的气泡不出现，其传质的情况基本上与气体鼓泡相似。,C 膜搅拌器(悬浮培养或微载体培养用:搅拌器型式之二),D 流化床反应器（悬浮培养或微载体培养用搅拌器形式三）,流化床反应器的基本原理就是使支持细胞生长的微粒呈流态化。右图所示为由胶原制成的微粒直径约500 m，具有像海绵一样的多孔性用非毒性物质增加其比重使之达到16或更高，以便它在高速向上流动的培养波中里流态化。细胞就接种于这种微粒之中，通过反应器垂直向上循环流动的培养液使之成为流化床，并不断提供给细胞必要的营养成分，细胞得以在微粒中生长。同时，新鲜培养浪不断地披加入，而培养产物或代谢产物又不断地被排除。 这种反应器传质性能很好，并在循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供 给高密度细胞所需的氧，同时排除代谢产物如二氧化碳(c02)。反应器中的液体流速能足以使细胞微粒悬浮，却不会损坏脆弱的细胞；培养的细胞密度同且细胞长时间停留在反应器中，细胞生长环境可方便地调控。对贴壁与非贴壁细胞均适用。放大也容易。,动物细胞培养应用,1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等,Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺,DMEM培养基,胎牛血清,其他成分,锥形瓶逐级放大培养,加碱（碳酸氢钠）,加糖（葡萄糖）,灌注培养液,微载体,5L种子罐培养,培养液,50L 生 物 反 应 器,接种狂犬 病毒,出液口,收获病毒,动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,大规模动物细胞培养的问题及对策,1、优化细胞培养环境 2、改变细胞特性 3、提高产品的产率,1、细胞培养环境,细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。 体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。,2、细胞死亡与凋亡,在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高CHO细胞的目的蛋白产率。 方法是向CHO细胞中导入p21、p27的基因，使细胞周期中G1期延长(细胞静止)，改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。,3、培养基与细胞系,无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。 在生产疫苗、单抗和各种生