超高压提取西洋参皂苷的工艺研究.pdf

第21卷 第5期 2005年5月 农 业 工 程 学 报 T ransactions of the CSA E Vol . 21 No. 5 M ay 2005 超高压提取西洋参皂苷的工艺研究 陈瑞战,张守勤,王长征,窦建鹏,吴 华,张玲玲 (吉林大学生物与农业工程学院,长春130025) 摘 要:研究在常温下超高压提取西洋参根中皂苷的最佳提取工艺。探讨了不同提取溶剂、 溶剂浓度、 提取压力、 溶剂与原 料比、 提取时间等因素对皂苷得率的影响,确定了超高压提取西洋参根中皂苷的最佳条件,并将超高压提取法与热回流提 取、 微波提取、 超声提取、 超临界CO2萃取等提取法进行了比较。超高压提取西洋参根中皂苷的最佳提取条件: 70%乙醇水 溶液为提取溶剂,提取压力为200M Pa,溶剂与原料比为501,提取时间为2m in。 超高压提取西洋参根中皂苷具有提取得 率高、 时间短、 能耗低等优点,可用于中药有效成分的提取。 关键词:超高压;提取;西洋参;皂苷 中图分类号: O62335; TQ 036+. 4 文献标识码: A 文章编号: 100226819(2005)0520150205 陈瑞战,张守勤,王长征,等.超高压提取西洋参皂苷的工艺研究J .农业工程学报, 2005, 21(5): 150- 154. Chen Ruizhan,Zhang Shouqin, W ang Changzheng, et al .Technological process of ultrahigh2pressure extraction of saponins fromPanax quinquef oliusJ .T ransactions of the CSA E, 2005, 21 (5): 150-154. (in Chinese w ith English abstract) 收稿日期: 2004211225 修订日期: 2004204225 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30472135) 作者简介:陈瑞战(1967- ),男,副教授,博士研究生,研究方向为药 物有效成分提取。长春 吉林大学生物与农业工程学院, 130025。E2 mail: ruizhanchen163. com 通讯作者:张守勤(1946- ),男,教授,主要从事农产品加工研究。长 春 吉林大学生物与农业工程学院, 130025。Email: zsqjlu. edu. cn 0 引 言 西洋参(Panax quinquef olius)系五加科属植物, 原产于加拿大和美国,目前中国已经有大面积的栽培。 西洋参的主要成分是皂苷,具有较高的生理活性、 独特 的药理作用。 西洋参中人参皂苷的常规提取方法有浸渍 法1,渗漉法2,煎煮法2,回流提取法2,索氏提取 法3,近年来研究和开发的有超声提取法3,微波提 取3,超临界流体萃取4等新技术。目前在西洋参皂苷 的规模化生产中采用的基本上是常规提取工艺,这些方 法不同程度的存在提取时间长,效率低,且由于长时间 的加热会造成皂苷活性的降低、 损失等问题。采用具有 现代技术特征的超临界流体萃取方法时,由于人参皂苷 的极性强、 分子量大,提取效率很低。因此迫切需要 “安 全、 高效、 稳定” 的西洋参有效成分提取新工艺。 超高压生物加工技术在食品灭菌5、 病毒灭活6、 疫苗制取7、 蛋白质改性8、 生化制药等多方面都有很 好的应用。 近年来张守勤等提出并将超高压技术应用于 中药有效成分的提取9,并利用该技术提取了黄酮9、 皂苷、 生物碱、 多糖10, 11、 挥发油等多种中药有效成分。 超高压提取(U ltrahigh2pressure extraction,缩写 为UHPE ), 也称超高冷等静压提取,它是在常温下用 1001000 M Pa的液体静压力作用于药液上,使提取溶 剂渗透到药物细胞内,在预定压力下保持一段时间使有 效成分达到溶解平衡后迅速卸压,由于细胞内外渗透压 力差突然增大,细胞内的有效成分转移到细胞外的提取 液中,于是达到了提取有效成分的目的。 与传统的煎煮、 回流提取等方法相比,超高压提取 在缩短提取时间、 降低能耗、 减少杂质成分溶出的同时, 提高了有效成分的收率。超高压提取是在常温下进行 的,因此避免了因热效应引起的有效成分结构变化、 损 失以及生理活性降低,同时由于超高压提取是在密闭环 境下进行的,没有溶剂挥发,不会对环境造成污染,因此 该技术更加符合 “绿色” 环保的要求。 本文研究了从西洋参根中提取皂苷的超高压提取 工艺,并且与热回流、 微波、 超声、 超临界CO2萃取等提 取方法进行了比较,该提取工艺具有许多独特的优势。 1 试验材料与方法 1. 1 仪器与材料 1) 仪器与设备 DL 700间歇式超高压提取设备(上海大隆机器 厂 ); LC2V Pseries岛津高效液相色谱仪,包括:四元泵, 脱气单元,柱温箱, SI L210A dvp自动进样器, SPD2 M 10A V P、UV2V IS检测器,CLA SS2V P工作站; HA 221250206超临界萃取装置(江苏南通华安超 临界萃取有限公司 ); JY292型超声波发生器(宁波新芝生物技术研究 所 ); M G25586DTW ,微波炉,加装了回流冷凝、 搅拌和 控温装置; MA 110电子天平(精度0. 1mg,上海天平仪器厂 ); RE252旋转蒸发器(上海安亭电子仪器厂 ); C18(5m, 250mm4. 6mm)层析柱(迪马公司)。 2) 材料和试剂 国产西洋参(产地:吉林省靖宇县 ); 皂苷标准品 Rb1和Re(由吉林大学基础医学院天然药物实验室提 供,纯度 90% );乙腈、 甲醇(美国Fisher公司,色谱 051 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 纯 ); 其它试剂(北京化工厂,分析纯)。 1. 2 超高压提取工艺流程及设备 1. 2. 1 超高压提取工艺流程 超高压提取工艺流程(见图 1) 具体特点说明如下: 1) 筛选需要的西洋参干根 ; 2) 原料干燥、 粉碎(或脱脂处 理)等前期处理 ; 3) 按不同的溶剂和原料比混合后包装 并密封 ; 4) 按照预先确定的操作参数进行高压处理 ; 5) 使用过滤或离心等方法将固体药渣从提取液中分离出 去 ; 6) 减压蒸馏(或膜分离)挥发溶剂后得提取液 ; 7) 提 取液经过萃取、 柱层析、 重结晶等方法进行分离纯化,得 总皂苷或单体皂苷 ; 8) 对纯化后的提取物进行结构、 纯 度、 活性测试。 图1 超高压提取工艺流程图 Fig. 1 Technological process of ultrahigh2pressure extraction(UHPE) 1. 2. 2 超高压提取设备 间歇式超高压提取原理示意图如图2。将药物原料 按照一定的料液比混合后装在耐压、 无毒、 柔韧并能传 递压力的软包装内密封,然后放入高压容器内;启动高 压泵,首先将容器内的空气排出,然后升高到所需的压 力,并在此压力下保持一定的时间;迅速打开控制高压 回路的阀门,卸除压力;取出高压处理后的料液,进行后 续处理。 图2 间歇式超高压提取原理示意图 Fig. 2 Schematic diagram of the principle of interm itent UHPE 1. 2. 3 样品的预处理 取西洋参干根,在60真空干燥箱中干燥12 h;粉 碎后过孔径为0. 42 mm的样品筛;按401的溶剂与 原料比加入三氯甲烷,回流3 h,过滤除去滤液,滤渣挥 干溶剂后得脱脂样品,备用。 1. 2. 4 提取西洋参皂苷的方法 精确称量用同一批次的脱脂样品各1 g,分别按照 501的溶剂与原料比,加入70%的乙醇水溶液,用不 同的方法提取西洋参皂苷,提取液减压回收溶剂后经过 大孔树脂纯化,得总皂苷。提取方法如下: 1) 超高压提取:提取条件的确定见第二部分; 2) 超声波提取: 50 kHz、250 W超声波处理40 m in; 3) 微波提取: 2450M Hz、300W微波处理15 m in; 4) 回流提取:水浴加热沸腾,回流提取时间6 h; 5) 超临界CO2萃取:该法使用的原料为脱脂样品 而不是上述脱脂样品与乙醇的混合液,提取的携带剂为 乙醇,含量为 5% ( V?V ), 提取温度40,提取压力50 M Pa,CO2流速为2 L?m in,萃取时间4 h。 除超高压提取外,其它提取方法的工艺参数均参考 相关文献确定2- 4。 1. 2. 5 检测方法 1) 色谱条件 将所得总皂苷加甲醇(光谱纯)溶解定容,过0. 45 m膜后密封备用。检测条件为:柱温35;检测波长 203 nm;进样体积20 L; 流动相由乙腈和0. 05%磷酸 水溶液组成,流速1. 0 mL?m in;梯度洗脱程序为: 0 20m in,乙腈的体积分数为20%22%; 2045m in,乙 腈的体积分数为22%45%; 4555 m in,乙腈的体积 分数为45%55%; 5560 m in,乙腈的体积分数为 55%100%; 6065 m in,乙腈的体积分数为100% 20%。 2) 工作曲线的绘制 分别准确称取人参皂苷Rb1和Re标准品各1. 55 mg和1. 94 mg,置于同一5 mL容量瓶中,加入3 mL 甲醇溶解,超声振荡1 m in后用甲醇定容至刻度,得1 号样品。 分别吸取1号样品一定体积配成25号样品, 各样品中两种标准品的含量见表1。 表1 混合标准溶液中皂苷的浓度 Table 1 Concentration of saponins2Rb1and Re contrast 12345 Rb1?mgmL - 1 0. 3100. 18600. 09300. 04650. 0233 Re?mgmL - 1 0. 38800. 28080. 14040. 07020. 0351 在上述色谱条件下,进样标准品混合溶液20 L , 测得混合标准溶液的HPLC图谱(图3),分别取进样浓 度为表1的5个不同浓度梯度的混合标准溶液20 L , 测定不同浓度的单体皂苷峰面积(X ), 对应的皂苷浓度 Y(mg?mL ), 进行线性回归计算,得混合标准溶液中两 种不同皂苷回归方程,见表2。 图3 混合标准品的HPLC图谱 Fig. 3 HPLC spectra of different standard saponins 151 第5期陈瑞战等:超高压提取西洋参皂苷的工艺研究 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 表2 皂苷Rb1和Re的HPLC混合标准曲线 Table 2 HPLC figure of calibration curve of saponins Rb1and Re 名称标准曲线R值 Rb1y= 3. 48217E-07x-8. 71567E-03R2= 0. 998 Rey= 2. 37396E-07x-4. 51656E-03R2= 0. 997 2 超高压提取工艺参数的确定 2. 1 提取溶剂的影响 超高压提取西洋参皂苷首先必须选择一种对皂苷 溶解性较大,而对杂质成分溶解性较小,提取后又易于 分离的提取溶剂。由于皂苷的分子量相对较高,在极性 溶剂中的溶解性较大,因此选取了水、 乙醇、 甲醇、 正丁 醇4种极性较大常用提取溶剂,在压力、 保压时间、 固液 比等工艺参数完全相同的条件下进行超高压提取,结果 见图4。 图4 提取溶剂对皂苷2Rb1(2Re)得率的影响 Fig. 4 Effects of different extraction solvents on the extraction ratio of saponins Rb1and Re 由图4可以看到, 4种溶剂都可用于提取西洋参皂 苷,但50%乙醇提取得率最高,且无毒、 无不良气味、 易 回收。因此,选取乙醇水溶液作为超高压提取西洋参皂 苷的提取溶剂。 2. 2 溶剂浓度的影响 中药有效成分结构复杂,要达到快速高效提取的目 的,需要根据所提取化合物分子结构中功能基的极性大 小、 数量等情况选择合适浓度的提取溶剂。 一般地,两种 基本母核相同的成分,其分子中功能基的极性越大,或 极性功能基数量越多,则整个分子的极性大,亲水性强, 分子非极性部分越大,或碳链越长,则极性小,亲脂性 强;不同浓度的有机溶剂极性大小不同,因而对提取产 物的溶解性也不同。因此,需要通过试验确定超高压提 取使用的乙醇浓度。 超高压提取西洋参皂苷,其它条件相同时,不同溶 剂浓度对对提取得率的影响见图5。 结果表明,不同浓度的溶剂在高压条件下下对提取 得率的影响也不同。由图5可以看到,当乙醇浓度增大 时,西洋参皂苷的提取收率增大,但是当乙醇浓度为 90%时,由于蛋白质等生物大分子的溶解性降低,发生 凝聚堵塞组织的微孔,使皂苷从组织细胞内向周围提取 溶剂扩散的传质阻力增大,因而西洋参皂苷的提取收率 明显降低。因此根据 “相似相溶” 的原则,确定提取溶剂 乙醇的适宜浓度为70%。 图5 溶剂浓度对皂苷2Rb1(2Re)得率的影响 Fig. 5 Effects of concentrations of ethanol on the extraction ratio of saponins Rb1and Re 2. 3 提取压力的影响 压力是超高压提取的一个重要因素,压力对提取过 程的影响主要表现在以下几个方面: 1) 对药材浸润速率的影响 药物有效成分的提取可以分两个过程:一是药材浸 润和溶质溶解过程;二是溶质的扩散过程。在溶剂通过 药材颗粒表面毛细孔浸润到细胞内部过程中,增加压 力、 升高温度、 增大药材颗粒的比表面积(粉碎)都可以 加快浸润速率。 2) 对溶质扩散速率的影响 溶剂浸润到细胞内部后,有效成分溶解在溶剂中, 在卸压过程中增大细胞内外的渗透压差,也就是提高压 力可以加快有效成分向外扩散的速率。 3) 压力可以降低传质阻力 超高压可以破坏细胞壁和胞内各种膜,从而降低了 有效成分的传质阻力。 在升压和卸压过程中,细胞内外的压力差较大,造 成了细胞壁和细胞膜的破坏,有效成分充分暴露出来, 从而使药材成分的溶出更加迅速完全,提高得率。 在其它条件相同的情况下,压力对得率的影响见图 6。压力增加,提取收率逐渐增加。在200500M Pa之 间,二者呈线性正相关关系,但是增大的幅度不大;当压 力达到600M Pa时,提取收率有所降低。在一定的压力 范围内,增加提取压力有利于皂苷的溶出,但会使设备 投资明显提高。综合考虑,确定超高压提取西洋参皂苷 的压力为200M Pa。 图6 不同提取压力对皂苷Rb1得率的影响 Fig. 6 Effects of different pressures on the extraction ratio of saponin Rb1 251农业工程学报2005年 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 2. 4 溶剂与原料比的影响 药物有效成分的提取是由渗透、 溶解、 扩散几个过 程组成,其中扩散占着最主要的作用12,根据第一定 律,物质的扩散速度与扩散过程中的浓度梯度有如下关 系: dnA?dt=D S (d cA?dx) 即溶质A的扩散速度与其浓度梯度dcA?dx和固液 界面积S成正比。 式中nA为溶质A的浓度,D为扩散系 数。 提取过程中,药材中溶质浓度逐渐降低,药液中溶质 浓度则逐渐增高。溶剂与原料的比值越大,则浓度梯度 越大,有效成分的扩散速率越大。 在其它条件相同时,不 同溶剂与原料比,超高压提取西洋参皂苷的提取得率不 同,其结果如图7。 图7 不同溶剂与原料比对皂苷Rb1得率的影响 Fig. 7 Effects of the ratios of solvent to material on the extraction ratio of saponin Rb1 从图7中可以看出当溶剂与原料比在101100 1范围内,随着溶剂与原料比的增加,西洋参皂苷的 提取收率逐渐增加。但在溶剂与原料比比超过501 后,提取得率增加并不显著,而溶剂的消耗量以及后处 理工作量却明显增大。因此,综合考虑确定溶剂与原料 比为501比较适宜。 2. 5 提取时间的影响 图8为提取西洋参皂苷Rb1时提取得率与提取时 间(以保压时间计算)的关系图。由图8可见,保压时间 在25 m in范围内,提取得率基本没有变化,说明延长 提取时间并不能明显提高提取得率。 图8 提取时间(m in)对皂苷Rb1得率的影响 Fig. 8 Effect of extraction ti me on the extraction ratio of saponin Rb1 这是因为提取压力很高,有效成分的扩散速度很 快,在很短的时间内(小于2 m in ), 药物细胞内外有效 成分的溶解扩散已经达到了平衡,溶出基本达到最大 值,因此超高压提取时间以2 m in为宜。 综合上述试验结果,确定西洋参的超高压提取最佳 工艺条件为:压力200M Pa,保压时间2 m in,溶剂与原 料比501,提取溶剂为70%乙醇水溶液。 3 不同提取方法的比较 使用同一批原料进行了不同提取方法提取西洋参 皂苷的提取试验。 不同提取方法的西洋参皂苷Re的得率见表3。其 中超高压提取的工艺条件为前述最佳条件。 表3 超高压与其它提取方法的比较 Table 3 Comparison of UHPE w ith other extraction methods 方法溶剂 提取时间 ?m in Re得率 ?% 微波提取法70%乙醇150. 751 热回流提取法70%乙醇3600. 727 超声提取法70%乙醇400. 684 超高压提取法70%乙醇20. 792 超临界CO2萃取法CO2+乙醇(携带剂)2400. 309 由表3可以看到在不同提取方法中,超高压提取时 间最短,是常规热回流提取时间的0. 6% ,而提取得率 却最高。在上述提取方法中,提取得率最低的是超临界 CO2萃取,这是因为超临界CO2不适合提取极性强、 分 子量大的有效成分13。 4 结 论 1) 超高压能够快速高效地提取皂苷 超高压首次应用于西洋参皂苷的提取,能够促进溶 剂的渗透、 缩短有效成分的溶解平衡时间、 提高溶质的 扩散速率,因而具有提取速率快,得率高的优势。 通过试 验研究,得到了超高压提取西洋参皂苷的最佳工艺参 数:提取溶剂为70%的乙醇水溶液,提取压力200 M Pa,溶剂与原料比例为501,保压时间 2 m in。 2) 提取产物生理活性好 超高压提取过程中压力每升高100M Pa,温度大约 升高3。由于高压容器和外界环境有着良好的热交 换,在整个提取过程中基本可以维持在室温下进行,因 而最大程度地保留了中药材中生物活性物质及各种营 养成分的天然结构,避免了因热效应引起的有效成分变 性、 损失、 药理活性降低等问题。 3) 节能、 高效 超高压提取过程中,流体形变较小,在流体压缩时 消耗的能量较小14,且提取过程温度变化小,与周围环 境的热量交换也很小。 超高压提取消耗的能量只有热回 流的1%左右。由于提取时间较短,一台有效容积为50 L的超高压设备处理西洋参原料的能力与2 m 3 的超临 界CO2萃取设备相当,与3m 3 的煮提机组相当,因此超 高压提取具有高效的特点。 4) 工艺操作简单、 安全 超高压提取技术使用的是液体传质,由于液体的可 压缩性非常小14(水在800M Pa时恢复到常压体积膨 351 第5期陈瑞战等:超高压提取西洋参皂苷的工艺研究 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 胀12% ,超临界CO2恢复到常温常压体积膨胀500倍 以上 ), 因此超高压提取设备的安全性和操作方便性远 高于超临界CO2萃取设备;超高压提取的单元操作,可 以借助机械完成,操作简单,适宜于规模化、 现代化生 产。 虽然超高压技术在中药有效成分提取方面具有许 多独特的优势,但其应用研究还处于刚刚起步阶段,在 实际生产中的推广与应用时,还有很多工作要做,如提 取工艺参数的协同效应的优化等问题尚须做进一步深 入研究。 参 考 文 献 1 张春红,张崇禧,郑友兰,等.浸渍法提取西洋参皂苷最佳 工艺的研究J .吉林农业大学学报, 2003, 25(1): 73- 74. 2 闫光军,张宝江,徐道娟.几种常用西洋参提取工艺研究比 较J .山东医药工业, 2002, 21(4): 8. 3 张 晶,陈全成,弓晓杰,等.不同提取方法对西洋参皂苷 提取率的影响J .吉林农业大学学报, 2003, 25(1): 71- 73. 4 宋启煌,白 研,周家华,等.巴西西洋参提取皂苷的工艺 研究J .广州化工, 2000, 28(4): 94- 96. 5 N ienaber U ,et al .H igh2pressure processing of orange juice: combination treatment and a shelf life study J . Journal of Food Science, 2001, 66(2): 331- 336. 6 Shigehisa T, et al . 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