茶饮料中微量色素物质的HPLC分析方法研究.pdf

茶 叶 科 学 2 0 0 7 ，2 7( 4)：3 4 3 3 4 8 J o u r n a l o fT e a S c i e n c e 茶饮料中微量色素物质的 H P L C分析方法研究 潘顺顺 ，陆建 良，杨 晓丽 ，郑新强 ，杜颖颖 ，De v a j i t B，梁月荣木 ( 浙江 大学 茶叶研究所 ，浙江杭州 3 1 0 0 2 9) 摘要：以含 乙腈 的流动相作为洗脱剂 ，对茶饮料中微量色素物质的 HP L C分析方法进行了研究。结果显示，在 色谱柱长为 1 5 c m、 柱温为 3 5 、 总流量为 1 ml 、 检测波长 4 5 0 n m条件下 ， 最佳的洗脱参数为 ： 以 3 0 5 9 6 5 ( v v v )的乙腈 、乙酸和水 的混合液为流动相 A，以 7 5 1 5 1 0( v v v )的乙腈 、甲醇和氯仿混合液为 B相 ； 梯度洗脱 ，即前 2 0 mi n内 B相由 8 0 上升到 1 0 0 ，并保持 1 5 mi n 。在该条件下新黄质、紫黄质、叶黄素、 叶绿素 b 、叶绿素 a 、脱镁叶绿素 b 、 B一 胡萝 卜素和脱镁叶绿素 a等色素物质均可获得基线分离 。同时研究还 显示 ，该方法重复性较好 ，检测限低 ，可满足绿茶饮料中微量色素物质的分析。 关键词：茶树 ；茶饮料 ；H P L C；色素物 中图分类号： $ 5 7 1 1 ； 06 5 7 7 2 文献标识码 ： A 文章编号： 1 0 0 0 3 6 9 X( 2 0 0 7) 0 4 3 4 3 0 6 St u d y o n HPLC M e t h o d f o r t he An a l y s i s o f Tr a c e Pi g me nt s i n Re a dy - - t o - - d r i n k Te a PAN Sh un s hu n， LU J i a n l i a n g， YANG Xi a o- l i ， ZHENG Xi n q i a n g， DU Yi n g yi ng ， De v ij a t B L I ANG Yu e r o n g 木 ( T e a s c i e n c e i n s t i t u t e o f Z h e j i a n g Un i v e r s i t y ， Ha n g z h o u 3 1 0 0 2 9 ， Ch i n a ) Ab s t r a c t ：S t u d y o n HP LC me t h o d f o r a n a l y z i n g o f t r a c e p i g me n t s i n r e a d y - t o d r i n k t e a wa s c o n d u c t e d b y u s i n g d i f f e r e n t e l u a n t s wi t h a c e t o n i t r i l e a s mo b i l e p h a s e Re s u l t s h o we d t h a t g r a d i e n t e l u t i o n wa s s u i t a b l e f o r a n a l y z i n g b y u s i n g a c e t o n i t r i l e a c e t i c a c i d wa t e r i n r a t i o o f 3 0 5 9 6 5 ( v v v )a s mo b i l e p h a s e A， a n d u s i n g a c e t o n i t r i l e me t h a n o l c h l o r o f o r m i n r a t i o o f 7 5 1 5 1 0 ( v v v ) a s mo b i l e p h a s e B T h e o p t i mi z e d e l u t i o n t i me p r o g r a m c o u l d b e d e s c r i b e d t h a t p h a s e B i n c r e a s e d g r a d i e n t l y f r o m 8 0 t o 1 0 0 i n e a r l y 2 0 m i n u t e s ，t h e n r e ma i n e d 1 0 0 f o r 1 5 mi n u t e s Th e m a i n p i g me n t s ， i e n e o x a n t h i n ， v i o l a x an t h i n ，l u t e i n ， c h l o r o p h y l l b ， c h l o r o p h y l l a ， p h a e o p h y t i n b ， B Ca r o t e n e a n d p h a e o p h y t i n a ，c o u l d b e s e p ara t e d u p t o b a s e l i n e u n d e r t h a t c o n d i t i o n Ve rif i c a t i o n t e s t s h o we d th a t t h e o p t i mi z e d HP LC me t h o d wi t h g o o d r e p e a t a b i l i t y a n d l o w d e t e c t i o n l i mi t s wa s s u i t a b l e fo r me a s u r e me n t o f t r a c e p i g me n t s i n r e a d y t o d r i n k t e a Ke y wo r d s ： Ca me l l i a s i n e n s i s ， r e a d y t o d r i n k t e a ， HP LC， p i g me n t s 近年来 ，我 国茶饮料发展 势头迅猛 ，已成 为茶产业的重要组成部分 。但是 ，由于我国茶 饮料发展历史短、 基础研究较薄弱， 一些技术 问题一直困扰着茶饮料行业 。由于褐变导致 “ 绿茶饮料不绿”就是其中的重要问题之一。 研究显示 ， 绿茶饮料汤色主要受到叶绿素和类 黄酮等呈色物质的影响 卜 ，同时还与儿茶素 类物质的氧化程度有关 。虽然茶鲜叶中含 有大量叶绿素类和类胡萝 卜 素物质 ， 分别占茶 叶干重 的 0 3 0 8 和 0 1 0 2 ， 但是这些 收稿 日期：2 0 0 7 - 0 2 0 9 修订 日期 ：2 0 0 7 O 7 O 9 基金项 目：浙江省科技厅资助项 目 ( 2 0 0 5 C 2 2 0 5 8 ，2 0 0 6 C1 2 0 7 5) 作者 简介： 潘顺顺 ( 1 9 8 2 一) ， 女 ，山东烟 台人 ， 在读硕 士生 ， 研究方 向为茶树 生物技术与资源利用 。 + 通讯作者 ： Y r l i a n g z j u e d u c n 维普资讯 茶叶 科 学 2 7卷 物质都属于脂溶性色素 ，在茶汤中溶解度较 小， 因此有学者认为 ， 叶绿素类和类胡萝 卜 素 对干茶色泽和叶底有重要影响 ， 但对茶汤颜色 作用不显著 】 。但是 ， 也有学者根据添加抗氧 化剂不能完全阻止高温灭菌或加温老化过程 中绿茶饮料的褐变4 5 】 、以及添加 z n 和 c u 可以稳定茶汤的绿色色泽3 9 1 o 等试验结果 ， 推测在浸提时叶绿素类物质可能以微细的胶 质状或油状悬浮于茶汤之中， 并在高温等条件 下发生降解 ， 并导致汤色褐变。要客观评价 叶绿素类和类胡萝 卜 素等对茶饮料色泽的贡 献 ， 首先需要一种可以对茶饮料中色素物质进 行快速定性和定量的有效分析方法。 令人遗憾 的是 ， 迄今为止 ， 未见茶饮料中叶绿素单体及 其衍生物等色素物质 H P L C分析的研究报道。 本研究就不同 H P L C 洗脱条件对绿茶饮 料微量色素物质分析效果 的影响进行了比较， 为绿茶饮料汤色褐变等研究提供快速、 准确的 检测技术。 l材料与方法 1 1色素单体的制备和定性定量 1 1 1色素单体制备 混合色素制备 ： 称取少量去叶脉的茶树新 鲜叶片置于研钵中， 加入少量石英砂和聚乙烯 吡咯烷酮 ，研磨后加入适量丙酮浸提 ，并于 4 、1 2 0 0 0 r m i n离心 5 m i n ，上清液以 N 2 吹干，转溶于石油醚 ( 6 0 - 9 0 C)中，锡箔纸 包裹 ，于一 2 0 C 贮藏。 薄 层 层 析 (T h i n l a y e r c h r o ma t o g r a p h 。 T L C)：称取 O 5 g 羧 甲基纤维素钠 ( C MC) ， 加入 1 0 0 m l 蒸馏水， 加热使之完全溶解。加入 3 O g 硅胶 ( 青岛海洋化工有限公司制造 ) ，超 声波混匀 1 0 m i n ，均匀涂于玻璃板上，晾干。 将上述制备好的混合色素 ， 均匀点样于硅胶板 上 ，以石油醚 ( 6 0 9 0 C) 丙酮 三氯 甲烷 = 1 1 1的混合溶液作展层剂 ，层析完成后，将 割下的色素带置于 2 m1 的离心管中，以丙酮 或无水乙醇溶解 ，于 4 C 、1 2 0 0 0 r rai n离心 1 0 m i n ，取上清液贮存于一 7 0 C 冰箱中。 1 1 2色素单体定性和定量 以 H P 8 4 5 3 紫外可见分光光度计 ( 美国惠 普公司 ) 对制备的色素单体进行扫描， 并根据 标准品 (B一 胡萝 卜 素、叶黄素 ：S i g ma 公司 ) 和有关参考文献 儿 ， 进行定性、定量。 1 2茶饮料的制备 1 2 1鲜汁茶饮料的制备 采 自浙江大学华家池校区实验茶 园的一 芽三、四叶新梢 ( 浙农 1 3 9品种 )，经蒸汽杀 青后粉碎，按 1 2 5( w， 、 ， ) 的茶水比于 4 0 C 条 件下超声浸提 1 0 m i n ， 脱脂棉过滤后，滤液于 4 o C 、8 0 0 0 r mi n 离心 2 0 m i n ，取上清液待用。 1 2 2干茶绿茶饮料的制备 以蒸青绿茶为原料， 按 1 ： 1 0 0( w v ) 的茶 水比，于 4 0 C 条件下超声波浸提 1 0 m i n ，经 粗滤和离心制备饮料， 具体操作参照孙庆磊等 n 的方法。 1 3色素 H P L C分析条件优化 采用 S C L 一 1 0 A H P L C(日本岛津公司 ) 分 析制备的混合色素、 单体以及茶饮料。 色谱柱 为 O D S C l 8 5 IJ m，1 5 c m4 6 mm ( 美 国 P h e n o me n e x 公司 )，检测波长 4 5 0 a m，柱温 3 5 C，进样量 1 O l 。以含乙腈的流动相作为 洗脱剂 ，A相为体积比为 3 0 5 9 6 5的乙腈、 乙酸和水，B相为体积比 7 5 1 2 0 1 5的乙腈 、甲 醇、 氯仿混合液， 以不同的线形梯度进行洗脱 ， 总流量为 1 m l ，具体如表 1 。 2结果与讨论 2 1 T L C分离制备色素单体的定性定量 茶鲜叶混合色素经 T L C分离后 ，制备各 色素单体。 结果显示 ，以石油醚、丙酮和三氯 甲烷作为展层剂可获得 6条清晰的主要色素 带( B a n d 0 1 - 0 6 ) ，依次为橙黄色 、蓝绿色、黄 绿色、黄色以及两条浅黄色弱带 ( 图 1 )。各 色素带转溶后 的吸收光谱分析结果显示 ， 分离 到的 6条色素带的吸收峰与标准品( n t 黄素、 维普资讯 4期 潘顺顺 ，等：茶饮料中微量色素物质的 H P L C分析方法研究 3 4 5 B 一胡 萝 卜素 ) 及 前 人 报 道 m， 基 本 一 致 ( 图 2 )，分别确定为 B一 胡萝 卜 素、叶绿素 a 、叶绿素 b 、叶黄素、紫黄质和新黄质，并 以消光系数 值进行了定量 ( 表 2 )。 表 1不同的洗脱条件 Ta b l e 1 Di f f e r e n t e l u t i o n p r o g r a m s 方法 Mo t h 0 d 洗脱程序 o nI i me p r 。 锄 A 1 0 0 B( 无梯度 ) 2 0 ra i n 内 B 相从 O 上升 到 1 0 0 ，并 保持 。 l 5 mi n ，之后在 5 mi n内 B回到 O 2 0 rai n内 B 相从 5 0 上升到 1 0 0 ，并保持 1 5 mi n ，之后在 5 mi n内 B回到 5 0 2 0 rai n内 B 相从 7 5 上升 到 1 0 0 ，并保持 1 5 mi n ，之后 在 5 mi n内 B回到 7 5 2 0 rai n内 B 相从 8 0 上升 到 1 0 0 ，并 保持 1 5 mi n ，之后 在 5 mi n内 B回到 8 0 2 0 rai n内 B 相从 9 0 上到升 1 0 0 ，并 保持 1 5 mi n ，之后 在 5 mi n内 B回到 9 0 2 2色素 H P L C分析效果评价 2 2 1不同洗脱条件对分析效果的影响 H P L C分析结果显示 ，以乙腈、甲醇和氯 仿混合液 ( 体积比为 7 5 2 0 5 )为流动相，在 无梯度 ( 流量为 1 m1 ) 条件下， 所有色素几乎 在 1 0 m i n之内全部被洗脱 ，但分离效果不佳 ( 图 3 A)；之后我们以乙腈、甲醇和氯仿混 图 1混合色素 T L C分析效果 Fi g 1 Re s u l t o f TL C s e p a r a t i o n 合液为 B相， 并以含 3 乙腈和 O 5 乙酸的水 溶液为 A 相 ，尝试采用梯度方式进行洗脱 。 结果显示 ，当起始 B相为 0 ，并在 2 0 mi n内 上升到 1 0 0 ( 表 1 方法 B)，该条件下色素 分离效果较无梯度时好， 但分析时间很长， 且 出峰过分集 中 ( 图 3 B)；之后随着起始 B相 比例逐渐增加，各色素分离度增加 ( 图 3 C， D)；当起始 B相比例为 8 0 ，并在 2 0 mi n 内上升到 1 0 0 ， 之后 1 0 0 B保持 1 5 mi n ， 该 条件下叶绿素等主要色素均达到基线分离( 图 3 E)；当起始 B相 比例增加到 9 0 时 ，分析 效果又下降 ( 图 3 F)。可见 ，采用方法 E进 行普通茶叶色素 H P L C分析， 可获得较满意的 效果 。 400 45 0 500 55 0 600 650 700 波 长W a v el en g t h( n m ) 图 2 T LC分离纯化的各色带吸收光谱 F i g 2 Ab s o r pt i o n s p e c t r u m o f t h e b a n d s i量薹 譬 维普资讯 3 4 6 茶 叶 科 学 2 7 卷 注： ，B- 胡萝 卜 素和叶黄素的吸收峰参考值为标准品扫描结果 ；只有经 H P L C分析后纯度超过 9 5 的单体用于定性分析。 No t e ： ， Re f e r e n c e v a l u e o f a b s o r p t i o n p e a k s o f B c a r o t e n e a n d l u t e i n we r e o b t a i n e d b y s c a n n i n g o f c h e mi c a l p u r e s t an d a r d s P i g me n t mo n o me r wi t h p u r i t y 9 O c o n fi r me d b y H P L C wa s s u b j e c t e d t o q u a l i t a t i v e e v a l u a ti o n 一 A 呈I 0 0 曼5 0 笛 c 1 00 8 昏 皇 5 0 E 毒矗 罢1 0 0 。 昏 皇 5 O 2O 3 O 4 0 0 1 0 2 0 3 0 时 问 T i me( rai n ) 时 问 T i me( rai n ) 图 3不同条件洗脱效果比较 Fi g 3 Co mp a r i s o n o f d i f f e r e n t e l u t i o n p r o g r a ms 注 ：A - F分别 为表 1中所示 的不同洗脱条件 No t e ： A- F me a n s d i f f e r e n t e l uti o n pr o gr a ms d e s c r i b e d i n Ta bl e 1 2 2 2洗脱条件优化 将制备的叶绿素 a和 b单体以 0 1 mo l L 的盐酸进行酸化处理 ，获得了脱镁 叶绿素 a 和 b ， 然后以方法 E所述进行 H P L C分析 ， 结 果发现 ，脱镁叶绿素 a和 b无法与 B 胡萝 卜 素达到基线分离。因此 ，我们在洗脱方法 E 的基础上 ，通过调节 B相中氯仿 的比例 ，进 一 步优化 了分析条件。结果显示 ，随着 B相 中氯仿比例增加， 各色素保 留时间缩短， 当 B 相中乙腈 、 甲醇和氯仿三者比例达到 7 5 1 5 1 0 时，经酸化后的茶鲜叶混合色素 ( 图 4 A)和 鲜汁茶饮料 ( 图 4 B)中脱镁叶绿素 a( 峰 6 ) 和 b( 峰 8 ) 与 B 胡萝 卜 素 ( 峰 7 ) 可获得基 线分离 ，同时其它色素分离效果也较好 。因 此最终确定的叶绿素等色素的 H P L C 分析条 件为 ：流动相 A为乙腈， 乙酸， 水( 3 0 5 9 6 5 ， v v v ) ， 流动相 B为乙腈， 甲醇， 氯仿 ( 7 5 1 5 1 0 ， v v v)，洗脱方法为 0 2 0 mi n ，B相从 8 0 上 升 到1 0 0 ，并保 持1 0 m i n；流 速1 O ml mi n ，柱温为 3 5 ，检测波长 4 5 0 a m。在 该条件下 ，各色素按保 留时间从小到大依次 为新黄质 、紫黄质 、叶黄素、叶绿素 b 、叶绿 素 a 、脱镁叶绿素 b 、B一胡萝 卜 素和脱镁 叶 绿素 a( 图 4)。 B 如 D 如 u 矗 声 o 声 u 矗 声 o H 声 莓 昏 莓 昏 F O O u 声 o H 声 一 JlI 莓 昏 维普资讯 4期 潘顺顺 ，等 ：茶饮料 中微量色素物质的 H P L C分析方法研究 2 3方 法验证 与重复性评价 以优化后的 H P L C 条件，分析了以蒸青 茶和杀青叶为原料制备的绿茶饮料 中的色素 组成 ， 并根据标准样 ( 叶黄素和 B一 胡萝 卜 素 ) 和制备的色素单体进行定量。结果显示 ，以 1 1 0 0茶水比 ( w v ) 于 4 0 C 下超声浸提的蒸 青绿茶饮料 中，以黄色的叶黄素和 B一 胡萝 卜 素含量较高 ，分别达到 9 1 4 9和 4 7 0 4 n g ml ， 其次为叶绿素 b和 a 、以及脱镁叶绿素 b和 a ( 表 3 )；鲜汁茶饮料 ( 茶水 比为 1 2 5 )中叶 黄素、 叶绿素 b和脱镁叶绿素 b 含量较高( 表 3 )；而且鲜汁饮料 中叶绿素类 ( 呈绿色 )， 类胡萝 卜 素 ( 呈黄色 )的比值较高，这与感 官上鲜汁饮料较蒸青绿茶更绿是一致的。从 实验 的重 复 性看 ，本 方 法 中 ，除 紫黄 质 ( 1 1 9 0 )和脱镁叶绿素 b ( 5 5 6 ) 的变异系 数大于 5 外 ， 其余检测成分的变异系数均在 5 以内 ( 表 3 )，说明本方法重复性较好。 A 呈； 0 o 星 5 0 B 4 名 笛 世 盆 昏尝 2 4 J l h 8 l J 0 1 0 2 0 3 0 时间 T t m e( m i B ) 图 4优化后的茶叶色素分离效果 F i g 4 P i g me n t s s e p a r a t i o n a f t e r o p timi z a tio n 注： A为酸化后的茶鲜叶混合色素， B为鲜汁绿茶饮料； 其中峰 1 为新 黄质、峰 2为紫黄质、峰 3为叶黄素、峰 4为叶绿素 b 、峰 5为叶绿 素 a 、 峰6 为脱镁叶绿素b 、峰7 为口 胡萝 素、 峰8 为脱镁叶绿素 a No te： Aa c i d i fie d p i g me n t s e x t r a c t e d f r o m f r e s h l e a v es， B r e a d y - t o - d r i n k t e ama d ef r o m s t e a mi ngfix e dl ea v es； p e a k 1 n e o x a n t h i n ，p e a k 2 v i ol a x a n t h i n 。p e a k 3 1 u t e i n。p e a k 4 c h l o r o p h y l l b ， p e a k 5 c h l o r op h y l l a ，p e a k 6 p h a e o p h y t i n b ，p e a k 7 口- C a r o t e n e ， p e a k 8 p h a e o p h 【y t i n a 表 3蒸青茶饮料和鲜汁茶饮料中主要色素含量 Ta b l e 3 Co n t e n t s o f p i g me n t s i n r e a d y - t o- d r i n k t e a p r e p a r e d b y t h e s t e a m f i x e d g r e e n t e a a n d d e e n z y mi n g l e a v e s 新黄质 紫黄质 叶黄素 叶绿素 b 叶绿素 a 脱镁叶绿素 b B- 胡萝 卜 素 脱镁叶绿素 a N e o x a n t h i n Vi o l a x a n t h i n L u t e i n C h l o r o p h y l l b C h l o r o p h y l l a P h a e o p h y t i n b B- Caro t e n e P h a e o p h d n a 注：表中数据为平均数 标准差 ( 单位为 n g m 1 )，括号内的数值为变异系数( ) N o t e ： Da t a we r e d e s c r i b e d a s m e a n s t a n d ard d e v i a t i o n ( n g m1 ) o f 3 r e p l i c a t e s , c o e f fi c i e n t o f v a r i a t i o n ( ) Wa S a l s o g i v e n i n b r a c k e t 3讨 论 研究显示 ，采用乙腈， 乙酸 7 ( 3 0 5 9 6 5 ， V V v ) 为流动相 A，乙腈， 甲醇， 氯仿 ( 7 5 1 5 1 0 ， v ， v v ) 为流动相 B； 梯度洗脱条件为， 前 2 0 m i n 内流动相 B 从 8 0 线性增加到 1 0 0 ，并以 1 0 0 B 保持 1 0 mi n ，在该试验条件下 ，绿茶 饮料中的色素物质出峰顺序为新黄质、紫黄 质 、叶黄素、叶绿素 b 、叶绿素 a 、脱镁叶绿 素 b 、 B 胡萝 卜 素和脱镁叶绿素 a 。 进一步的分析表明，以蒸青干茶 ( 茶水比 1 1 0 0)和杀青叶 ( 茶水比 1 2 5 )为原料，经 低温超声浸提制备的绿茶饮料中， 各种脂溶性 色素物质含量在 1 0 1 0 n g ml 水平。 而叶绿素 a 和 b以及叶黄素等色素在水 中的呈色阈值在 1 0 1 0 n g ml 左右l 1们， 可见在绿茶饮料中， 叶 绿素和类胡萝 卜 素等物质均高于阈值 ， 说明这 些色素对绿茶饮料的色泽均有明显贡献。 在本 维普资讯 3 4 8 茶 叶 科 学 2 7卷 研究中， 除了已经定量分析的叶黄素、 叶绿素 b和 a 、脱镁叶绿素 b和 a 、 B 胡萝 b 素、新 黄质和紫黄质外， 我们还从蒸青干茶制备的饮 料中检测到了叶绿素酸酯 a 和 b ，以及其他一 些保留时间短、 水溶性强的色素物质。这些物 质的定性和定量尚有待进一步研究。 参考文献 ： 【 1 】 方元超 ， 梅丛笑，杨朝伟 茶汤色 、香、味的变化机理及提 高茶汤品质的方法 J 】 冷饮与速冻食品工业， 2 0 0 0 ( 4 ) “ 1 9 2 1 【 2 】 林亲录，刘冠民 绿茶饮料保色的探讨 【 J 】 食品科学， 1 9 9 4 ( 9 ) ： 1 8 2 0 【 3 】 赵良绿茶饮料 的护色和稳定性研究 【 J 】 食品研究与开发， 1 9 9 8 ， l 9 ( 1 ) ： 2 9 - 3 1 4 】 罗龙新 液体茶储藏期的品质变化 J 中国茶叶， 1 9 9 8 ( 4 ) ： 1 1 1 3 【 5 】 方元超 ，梅丛笑绿茶 饮料 的护色技术【 J 】 茶 叶机械杂志， 1 9 9 9 ( 4 ) ： 1 - 3 【 6 】 梁 月荣 ，陆建 良，马辉罐装绿茶饮 料防褐变研究 【 J 】 浙 江农业大学学报， 1 9 9 9 ， 2 5 ( 3 ) ： 2 6 0 2 6 2 7 梁月荣茶饮料特性及工艺研究 J 粮油) H - r与食 品机械 ， 2 0 0 1 ( 7 ) ： 1 2 1 4 【 8 】 李小 满茶饮料关键控制点及其处理的研究 J 广州食品 工业科技 ， 2 0 0 1 ， 1 7 ( 1 ) ： 8 0 8 3 【 9 】 高新蕾绿茶饮料防褐变的研究 J 】 饮料工业 ， 2 0 0 2 ， 5 ( 2 ) ： 2 2 26 【 1 0 】杨晓萍， 郭大勇， 周家刚 绿茶饮料汤色的稳定性【 J 食 品工业， 2 0 0 3 ( 2 ) ： 1 9 2 0 【 l l 】 De l i a B R AA g u i d e t o c a r o t e n o i d a n a l y s i s i n f o o d s M W a s h i ng t o n ， DC， I LSI Pr e s s ， 2 0 01 ： 1 5 1 6 【 1 2 】 Mi e k o K， D e l i a B R A A s c h e me f o r o b t a i n i n g s t a n d ard s a n d HP L C q u a n ti fi c a ti o n o f l e a f y v e g e t a b l e c aro t e n o i d s J F o o d Che mi s t r y， 2 00 2， 78 ： 3 8 9 3 9 8 【 1 3 】 孙庆 磊，梁 月荣，陆建 良，等不 同浸提方法对 茶汤品质 的影 响【 J 】 _茶叶， 2 0 0 5 ， 3 1 ( 2 ) ： 9 1 - 9 4 【 1 4 】 Wa l k e r J S ， K e e l y B J D i s t r i