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2 0 0 8年12月农 业 机 械 学 报第39卷 第12期 茶树花多酚粗提物分离纯化及抗氧化性 3 黄阿根 董瑞建 鲁茂林 汪志君 【摘要】 在采用超滤膜2树脂吸附乙醇一次洗脱联用技术提取茶树花多酚工艺得到粗提物的基础上,探索了 不同体积分数乙醇水溶液梯度洗脱法制备高纯度茶树花多酚的方法,分离纯化得到了各洗脱物,应用HPLC法分 析了各洗脱物的儿茶素的组成,并采用清除OH及DPPH 方法比较了各洗脱物的抗氧化性能。结果表明,收集 10 %、20 %、30 %和40 %乙醇洗脱液浓缩干燥后可得到得率为84119 % ,质量分数为92125 %的茶多酚精制品,比一 次用体积分数为70 %乙醇水溶液洗脱得到多酚质量分数84132 %的样品纯度高。其中体积分数为20 %乙醇的洗 脱组分多酚质量分数为97171 %;各洗脱组分中不同儿茶素得到有效富集分离,它们对OH及DPPH 清除率均呈 量效关系,都高于未分离纯化的样品,其中体积分数为20 %乙醇的洗脱组分中,EGCG质量分数最高为67139 % ,咖 啡碱得到有效去除,其对自由基清除率最高,可作为高级抗氧化剂使用。 关键词:茶树花 茶多酚 儿茶素 梯度洗脱 抗氧化性 中图分类号: TS20111文献标识码: A Separation and Purification of Polyphenols Crude Extracts from Tea Flower (Camellia sinensisL O Kuntze) and Their Antioxidative Activities Huang Agen Dong Ruijian Lu Maolin Wang Zhijun ( Yangzhou University ,Yangzhou225001, China) Abstract In order to utilize waste tea flowers (Camellia sinensisL O Kuntze) and develop an industrialized way to refine tea flower polyphenols , a novel method for obtaining high purity of tea flower polyphenols by various ethanol concentration gradient elution was established based on the previous technology of“ultra2filtration2resin absorption2ethanol elute extraction of tea flower polyphenols”. The results showed that an average content as high as 92125 % of refined tea flower polyphenols could be collected by gradient elution of 10 % , 20 % , 30 % and 40 % ethanol elute followed , whereas single elution of 70 % ethanol elute only led to 84132 % content of tea flower polyphenols.Therefore , catechins in various eluant components were effectively separated. There was also a good correlation between their purity and scavenging efficiency ofOH and DPPH, both of which were higher than that of the crude extracts. Ethanol (20 %) elution led to the highest EGCG content of 67139 % , and effectively removed theine in the final products which may directly used as antioxidants. Key words Tea flower , Tea polyphenols , Catechins , Gradient elution , Antioxidative activity 收稿日期: 2008208213 3 江苏省农业科技攻关项目(项目编号:E2003344) 黄阿根 扬州大学食品科学与工程学院 副教授, 225001 江苏省扬州市 董瑞建 扬州大学食品科学与工程学院 硕士生 鲁茂林 扬州大学食品科学与工程学院 副教授 汪志君 扬州大学食品科学与工程学院 教授 博士 引言 茶多酚是公认的高效、 安全的天然抗氧化剂,是 化学抗氧化剂的最佳替代品之一,在食品添加剂行 业应用前景广阔1。研究表明,茶多酚具有抑菌、 除臭、 抗辐射、 防癌、 抗突变和防治心血管疾病等功 效26。茶树花是茶树(Camellia sinensisL O Kuntze)产茶过程中的副产物,从开花到结果周期长 达17个月,在漫长的生长周期中花果从茶树中吸收 了大量养分,影响了茶叶产量与质量,常常被修剪弃 去。前期研究表明7,不同产地茶树花中都含有较 为丰富的茶多酚。为开发利用此多酚资源,作者已 研究报道了茶树花超声波低温浸提、 超滤去杂、 大孔 吸附树脂提炼,最终以70 %乙醇洗脱后制得了质量 分数为8413 %的茶树花多酚提物工艺路线810, 但未对多酚粗品儿茶素进行分离、 纯化,也未对粗提 物中的咖啡碱残留进行考察。针对上述问题,本文 采用树脂吸附与乙醇水溶液梯度洗脱方法对茶多酚 进行分离纯化,探索咖啡碱脱除方法,并揭示多酚的 抗氧化性能。 1 材料与方法 111 试验材料 茶树花,江苏扬州现场采集; HZ2806大孔吸附 树脂(丙烯酸酯类 ) , 上海华震科技贸易公司;没食子 酸丙酯对照品,中国医药上海化学试剂公司;简单儿 茶素 (C) , 儿茶素没食子酸酯(CG) ,表没食子儿茶 素(EGC) ,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) ,表 儿茶素(EC) ,没食子儿茶素没食子酸酯( GCG) ,表 儿茶素没食子酸酯(ECG) ,咖啡碱(CAF) ,纯度均大 于98 %;DPPH(1 ,12二苯基222苦基苯阱) ,Sigma公 司。 112 试验仪器 树脂层析柱 112 cm4010 cm;SBS2100型数 控计滴自动部分收集器,上海青浦沪西仪器厂; ALPHA 122/ LD型 冷 冻 干 燥 器,德 国Marin CHRIST公司;UV2401PC型紫外可见分光光度 计,日本岛津公司; F2930型荧光分光光度计,上海 精密科学仪器有限公司;Alliance高效液相色谱仪, Waters 2475型多波长荧光检测器,分离柱ZORBAX Eclipse XDB2C18 (4 16 mm250 mm) ,美国Waters 公司。 113 分析方法 11311 茶树花多酚含量测定 按GB831387 ,用酒石酸亚铁比色法进行测 定7。 11312 多酚样品儿茶素成分HPLC分析 称取1010 mg分离得到的茶树花多酚样品,用 少量乙醇溶解后,再用蒸馏水定容至10 mL容量瓶 中,摇匀,微孔滤膜过滤 (0 145m纤维膜)去除细微 固体杂质,收集滤液供分析用。 取10L样品,微量加样系统注射上柱,柱温 35,流动相:A泵,体积分数为2 %冰乙酸;B泵,乙 腈。采用梯度程序洗脱,其中B泵体积分数变化: 8 %(0 min)31 %(25 min) ,流量115 mL/ min。紫 外检测器UV280 nm检测。以儿茶素标准品为对 照,测定各茶树花多酚样品中儿茶素组成与含量7。 11313 羟基自由基( OH) 清除率测定 采用Fenton反应羟基自由基荧光光度法11进 行测定。称取待测样2010 mg ,蒸馏水溶解定容至 100 mL容量瓶,得质量浓度为0120 g/ L试验样品。 然后分别取样110、210、310、410、510和610 mL ,稀 释,用10 mL容量瓶定容,得到质量浓度分别为 0102、0104、0106、0108、0110和0112 g/ L样液,供 OH的清除率测定使用。 取3支10 mL比色管,第1支加入浓度为 8 mmol/ L Ce(NO3)3、015 mmol/ L H2SO4和样品溶液 各1 mL ;第2支加入浓度为8 mmol/ L Ce (NO3)3、 015 mmol/ L H2SO4、20 mmol/ L FeSO4和3 mmol/ L H2O2溶液各1 mL ;第3支加入浓度为8 mmol/ L Ce(NO3)3、015 mmol/ L H2SO4、20 mmol/ L FeSO4、 3 mmol/ L H2O2和样品溶液各1 mL ,分别用蒸馏水 稀释至刻度,摇匀。115 h后以365 nm为激发波长, 在370 nm波长处对3支比色管依次测定F、Fo和 Fs的荧光强度,计算不同样品对OH的清除率。 OH清除率为 R1= Fs-Fo F-Fo 100 % 式中 F Ce3 +荧光强度 Fo 有Fenton反应时Ce3 +荧光强度 Fs 有Fenton反应和清除剂存在时Ce3 + 荧光强度 11314 DPPH自由基(DPPH)清除率测定 DPPH在乙醇和乙醇2水溶液中呈深紫色,最大 吸收波长分别在517 nm和527 nm处。当有自由基 清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐 渐消失,其褪色程度与配对电子数呈化学计量关系, 因而可用分光光度法进行定量分析12。 取2支 试 管,第1支 加 入1 mL浓 度 为 012 mmol/ L DPPH乙醇溶液,第2支加入1 mL浓 度为012 mmol/ L DPPH乙醇溶液和体积为011 mL 不同质量浓度的受试样品溶液,用无水乙醇定容为 5 mL。 放置30 min后,在517 nm波长处测定2支试 管溶液的吸光率,计算DPPH自由基清除率。 DPPH自由基清除率为 R2= Ao-Ai Ao 100 % 式中 Ao DPPH溶液的吸光度 Ai 加入样品溶液时的吸光度 801农 业 机 械 学 报 2 0 0 8年 114 试验方法 11411 上柱吸附原料液的制备 上柱吸附原料液的制备工艺为1012: 11412 树脂吸附与梯度洗脱操作 30 mL经预处理的HZ2806树脂,装入层析柱 中。 用水洗涤平衡后上柱,上柱条件:上柱液量 180 mL ,初始质量浓度410 g/ L左右,pH值310 ,流 速120 mL/ h。吸附操作完成后收集流出液,测定多 酚、 咖啡碱含量及其固形物质量。吸附饱和柱依次 用300 mL左右的水及10 %80 %不同体积分数的 乙醇水溶液梯度洗脱,分别收集各梯度洗脱液,旋转 真空浓缩,低温冷冻干燥处理,得固体洗脱物,称量, 测定多酚、 儿茶素含量,计算多酚、 儿茶素的得率。 2 结果与分析 211 梯度洗脱物多酚含量及其得率 收集、 干制、 称量、 分析各梯度洗脱物,结果如表1 所示。茶树花多酚主要集中在体积分数为10 %、 20 %、30 %和40 %乙醇洗脱液中,而体积分数为 70 % ,80 %乙醇洗脱液中已检测不出多酚,计算得到 梯度洗脱样品中多酚的平均质量分数为91121 % , 得率为86171 %。考察多酚集中的10 %40 %乙醇 洗脱组分,其多酚的平均质量分数为92125 % ,得率 为84119 % ,相对于上柱原液中多酚质量分数 19143 %纯化效果显著,而直接用70 %乙醇水溶液 一步洗脱得到的产品质量分数只有84132 %9。 表1 样品纯化前后茶树花多酚比较 Tab. 1 Content analysis before and after purification of tea flower polyphenols 被测试液 固形物 总量/ g 多酚 质量/ g质量分数/ %得率/ % 上柱原液31705 501720 019143 流出液21025 601016 00179 水洗液01843 101053 16130 10 %乙醇洗脱液01200 901180 28917025103 20 %乙醇洗脱液01245 001239 49717133125 30 %乙醇洗脱液01138 201126 99118217163 40 %乙醇洗脱液01072 901059 6811768128 50 %乙醇洗脱液01020 101015 8781612119 60 %乙醇洗脱液01007 401002 4321430133 212 梯度洗脱物各组分儿茶素分析 将分步收集的体积分数为10 %、20 %、30 %和 40 %乙醇洗脱物进行HPLC检测,得到各梯度洗脱 样品组成如表2所示。从分析结果可以看出,随着 乙醇体积分数的增加,各组分流出的顺序依次为: C、CAF、EC、EGC、EGCG、ECG、GCG和CG。 表2 茶树花多酚梯度洗脱样品成分分析结果 Tab. 2 Components analysis of tea flower polyphenols gradient elution 洗脱乙醇 体积分数/ % 质量分数/ % CCAFECEGCECGEGCGGCGCG总儿茶素 101513813149141047147000036189 20115911712192214512108671390086143 30000143062137131592153113080122 40000025110614610103814350102 10 %乙醇洗脱物富含简单儿茶素和咖啡碱,而 30 %和40 %乙醇洗脱物富含酯型儿茶素;EGCG主 要集中在20 %乙醇洗脱段,质量分数达67139 %。 改变乙醇体积分数实际上改变溶液极性,利用相似 相溶原则来分离混合物,从结果可见,试验采用不同 乙醇水溶液初步分离不同儿茶素单体是有效的。 213 分离纯化过程中咖啡碱的分布 树脂用于茶多酚的分离纯化时咖啡碱残留较 多,不易有效去除。为此考察了HZ2806树脂吸附 分离过程中咖啡碱的分布。 茶多酚含有多个酚羟基,是酸性物质,而咖啡碱 是弱 碱 性 物 质,上 柱 原 液 咖 啡 碱 质 量 分 数 为 21931 % ,试验比较得出在pH值310时,咖啡碱吸 附性较弱,占上柱原液的质量分数为30148 % ,咖啡 碱并未吸附直接流出,此时流出液中不含多酚(见图1 的上柱原液与图2流出液HPLC分析图谱比较)。 901第12期 黄阿根 等:茶树花多酚粗提物分离纯化及抗氧化性 用120 mL的纯水快速淋洗时,脱除了占上柱原液质 量分数40151 %的咖啡碱,此时只有部分简单儿茶 素C解吸流出,其他儿茶素无损失(图 3) 。吸附柱 上的咖啡碱主要集中在10 %乙醇洗脱组分中,占上 柱原液质量分数13149 %的咖啡碱在此步被分离,少量 咖啡碱在20 %乙醇洗脱液中,其绝对含量见表2。 图1 上柱原液HPLC图谱 Fig. 1 HPLC of sample 图2 流出液HPLC图谱 Fig. 2 HPLC of effluent 图3 水洗液HPLC图谱 Fig. 3 HPLC of water eluate 214 梯度洗脱组分对OH的清除率 在众多自由基中,OH最为活泼,其反应速度 最快,对机体伤害最大,从常见食物资源中筛选OH 清除能力强的清除剂是水溶液体系抗氧化研究的重 要判据13。 精确称取相同质量的梯度洗脱样品、 原浸膏、 VC,测定它们对OH的清除率。从图4可以看出, 各试验样品都呈良好的量效关系,但各梯度洗脱样 品对羟基自由基的清除率各不相同。抗氧化性强弱 顺序依次为20 %乙醇洗脱液、10 %乙醇洗脱液、 30 %乙醇洗脱液、40 %乙醇洗脱液;且梯度洗脱的各 样品均比茶树花粗浸膏试样抗氧化性强,说明经过 分离纯化后,多酚含量高,抗氧化性增强,其中20 % 乙醇洗脱液中EGCG含量最高。Vc是食品、 医药 领域常用的抗氧化剂之一。由图4可知梯度洗脱所 得的多酚样品抗氧化性远大于Vc ,这也说明了茶树 花浸提树脂梯度组分具有优良的抗氧化性能。 图4 不同样品的OH清除率 Fig. 4 Scavenging efficiency ofOH from different samples 215 梯度洗脱组分对DPPH 的清除率 比较各洗脱组分对DPPH 的清除率结果如图5 所示;各试验样品都呈量效关系。抗氧化性强弱顺 序依次为20 %乙醇洗脱液、VC、10 %乙醇洗脱液、 30 %乙醇洗脱液、40 %乙醇洗脱液;梯度洗脱所得到 的样品均比茶树花粗浸膏试样抗氧化性强,说明经 过分离纯化后,捕捉DPPH 能力增强。 图5 不同样品的DPPH 清除率 Fig. 5 Scavenging efficiency of DPPH from different samples 比较而言,20 %的乙醇梯度洗脱物对OH清除 能力更强于同剂量的VC对DPPH 的清除效果;其 儿茶素主要成分是EGCG,这验证了EGCG是儿茶 素中抗氧化活性最强的组分,在药品、 化妆品中有较 高开发价值,梯度洗脱可单独收集20 %乙醇洗脱 物,可有效去咖啡碱,能得到含EGCG较高的产品。 结果揭示了茶树花多酚纯化物在这方面的良好功 效。 3 结论 (1)在超滤膜2树脂吸附联用新技术提取茶树 花多酚工艺的基础上,对吸附柱采用纯水淋洗去杂, 梯度洗脱收集体积分数为10 %、20 %、30 %和40 % 乙醇洗脱物,浓缩干燥可得到平均质量分数为 92125 %的多酚精制品,其工艺比直接用体积分数为 011农 业 机 械 学 报 2 0 0 8年 70 %乙醇水溶液洗脱得到的多酚质量分数为 84132 %的样品纯度高,其中体积分数为20 %乙醇 的洗脱组分多酚质量分数为97171 % ,是一种简单 实用制备高纯度茶树花多酚的方法。 (2)乙醇梯度洗脱,随着乙醇体积分数的增加, 组分流出的顺序依次为:C、CAF、EC、EGC、EGCG、 ECG、GCG和CG;可以分离得到以下不同规格的产 品:体积分数为10 %乙醇洗脱液可得到富集咖啡 碱 (13 149 %)和简单儿茶素产品。体积分数为 20 %乙醇洗脱物可得到质量分数为67139 % EGCG 的样品,其抗氧化活性强。体积分数为30 % 40 %乙醇洗脱液可得到富集ECG、EGCG、GCG、CG 儿茶素样品。HZ2806大孔树脂吸附梯度洗脱法是 有效制备不同儿茶素的工业化方法。 (3)乙醇梯度洗脱物对OH和DPPH 的清除 率都比原茶树花浸膏好,废弃茶树花经树脂分离纯 化后具有良好的抗氧化性活性,可根据不同需要作 为抗氧化剂使用。 参考文献 1 Gramza A , Korczak J. 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