苦荞麦蛋白质的光谱学研究.pdf

- 1 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 苦荞麦蛋白质的光谱学研究 # 郭晓娜，姚惠源* 基金项目：基金项目：国家自然基金（30900999）,高等学校博士学科点专项科研基金（200802951003） 作者简介：郭晓娜（1978-），女，副教授，主要研究方向：谷物功能成分. E-mail: gxn1978 （江南大学食品学院，江苏 无锡，214122） 摘要：本文主要采用紫外吸收光谱和拉曼光谱（Raman）对苦荞麦蛋白质（TBWSP31）的 结构进行研究。紫外吸收光谱分析表明，TBWSP31 在 230nm处有最大吸收，此峰是肽键的 吸收峰，在 280nm处也有一个吸收峰，这是酪氨酸和色氨酸对紫外光的吸收产生的。Raman 光谱对 TBWSP31 的主链构象和侧链环境分析结果表明，TBWSP31 含有-折叠、-转角、 -螺旋和无规卷曲，其中-折叠的含量较多，C-C-S-S-C-C 侧链为反式扭式反式构象， 酪氨酸残基有的埋藏在疏水环境中，有的暴露于溶剂中，色氨酸残基趋向于暴露。 关键词： 粮食、油脂及植物蛋白工程；苦荞麦；蛋白质；结构；光谱 中图分类号：TS201.21 Spectrometric studies on the structure of tartary buckwheat protein Guo Xiaona1, Yao Huiyuan2 (school of food science and technology, Jiangnan University, Jiangsu Wuxi,214122) Abstract: The structure of tartary buckwheat protein（TBWSP31）was studied by UV absorption and Raman spectra. UV spectroscopy showed a strong absorption peak at 230nm produced by peptide bond and a clear absorption peak at 230nm produced by tyrosine and tryptophan. The secondary structure of TBWSP31 was determined by Raman Spectrometer. The results indicated that TBWSP31 had -sheet, -turn, -helix and random coil.The percentage of -sheet was higher. C-C-S-S-C-C was trans-gauche-trans conformation. Some residues of tyrosine buried in hydrophobic microenvironment, and the others exposed to the polar aqueous solvents. Most of tryptophan residues exposed to the polar aqueous solvents. Key words: grain，oil and plant protein engineering;tartary buckwheat;protein;structure;spectroscopy 0 引言引言 近年来， 在生物大分子和生物超分子体系的构象研究中， 特别是溶液中生物大分子空间 结构与功能相互关系的动态研究中，激光拉曼光谱法已成为很有发展前途的新技术1。激光 拉曼光谱能够显示蛋白质分子中肽键的特征性振动谱带、 主链骨架的振动谱带， 以及侧链的 振动谱带。 肽键的环境是蛋白质主链构象的反映， 因此可以利用肽键的特征性振动谱带来判 断蛋白质的主链构象。 在生命活动过程中， 不同的蛋白质具有不同的生理活性功能。 蛋白质的活性功能不仅决 定于蛋白质分子的一级结构， 更决定于其三维结构。 因此对蛋白质的结构进行深入的研究是 十分必要的，这对于其生理活性功能的解释具有非常重要的意义。 本文主要采用紫外吸收光谱和拉曼光谱（Raman）对苦荞麦蛋白质的结构进行研究。 1 实验部分实验部分 1.1 仪器与试剂仪器与试剂 ZOPR-52D 冷冻离心机 （日本 Hitachi Koki 公司） ； UV-2800 紫外可见分光光度计 （海 - 2 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 尤尼柯仪器有限公司）；BSZ-100 自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）；HD-3 紫外检 测仪（上海沪西分析仪器厂）；ISA/DILOR Lab RAM 显微共焦拉曼光谱仪（法国 Dilor 公 司）；DEAE-Sepharose FF 和 Sephacryl S-200 购自瑞典 Pharmacia 公司；Sephadex G-100 购自上海华美生物工程公司；所用试剂均为分析纯。 1.2 苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备 采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF 离子交换色谱、Sephadex G-100 凝胶过滤色 谱对苦荞麦水溶性蛋白质逐步分离纯化，并结合细胞实验，筛选出苦荞麦蛋白 TBWSP312。 1.3 紫外吸收光谱扫描紫外吸收光谱扫描 将配制好的 TBWSP31 溶液（500g/mL，用 pH7.0，20mmol/L 的磷酸盐缓冲液溶解） 用紫外分光光度计扫描，波长范围 200300nm，测定紫外吸收光谱。 1.4 激光拉曼光谱（激光拉曼光谱（Raman）分析）分析 采用法国 Dilor 公司的 LabRam-1B 型显微激光拉曼光谱仪测定 TBWSP31 的 Raman 光 谱。 Raman 光谱测定条件：氦氖激光器，激发线波长 632.81nm，由 CCD 多道探测，功率 6mW，光谱缝宽 100m，扫描步长 2cm-1，时间 50s，室温下测定，拉曼位移范围为 200cm-1 至 1800cm-1，这一范围已包括生物样品的主要特征峰扫描范围。实验时室温(201) ，重 复扫描 5 次, 由计算机作累加平均和基线校正，绘图输出3。 谱图处理：利用 Dilor 公司的 LABSPEC 软件，经过 700，915，1140，1520，1780 cm-1 手动划出基线，将原谱扣除基线后进行平滑处理，标出谱峰位置。 2 结果与讨论结果与讨论 2.1 紫外吸收光谱扫描紫外吸收光谱扫描 蛋白质能够吸收一定波长范围的紫外光， 溶液中蛋白质的光吸收随入射光波长的变化而 变化，TBWSP31 的紫外吸收光谱如图 1 所示。蛋白质之所以能产生紫外吸收光谱，主要是 色氨酸和酪氨酸残基的侧链基团对光的吸收； 其次是苯丙氨酸、 组氨酸和半胱氨酸残基的侧 链基团对光的吸收；此外还有肽键对光的强烈吸收。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸由于生色基 团不同（Trp 的吲哆基，Tyr 的酚基，Phe 的苯基），其紫外吸收光谱也不同。 由图 1 可知， TBWSP31 在 230nm处有最大吸收， 这应该是肽键的吸收峰， 此外在 280nm 处也有一个吸收峰，这是酪氨酸和色氨酸对紫外光的吸收产生的。 - 3 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 图 1 TBWSP31 的紫外吸收光谱图 Figure1 UV absorbance spectra of TBWSP31 2.2 激光拉曼光谱（激光拉曼光谱（Raman）分析）分析 早在 1928 年，印度物理学家拉曼（Raman）就发现了拉曼光谱，但是，直到 70 年代， 由于采用了激光作光源，克服了谱线太弱的缺点，才使拉曼光谱复兴起来。近年来应用激光 拉曼光谱法研究蛋白质分子构象逐渐受到重视 4。 图 2 TBWSP31 的 Raman 光谱图 Figure 2 Raman spectra of TBWSP31 TBWSP31 的 Raman 光谱见图 2。根据文献 5-7给出的蛋白质 Raman 光谱特征值进行谱 峰指认，指认结果如表 1 所示。 - 4 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 表1 TBWSP31的Raman光谱谱峰指认 Table1 Tentative assignment of selected bands in the Raman spectra of TBWSP31 样品谱峰 峰位(cm-1) 特征峰位 (cm-1) 谱峰指认 结构信息 510 S-S stretch 扭式扭式扭式构象 525 S-S stretch 扭式扭式反式构象 537 540 S-S stretch 反式扭式反式构象 700 700-745 C-S stretch 反式构象 641,826,854 645, 830,850 Tyr, 费密共振 state of phenolic OH group 756,877,1550 760,880,1360, 1553 Trp, 吲哆环 Sharp intense band indicates buried structure 934 940 螺旋 621,1004,1032, 1207,1604 622,1006 1030,1207,1605 Phe, ring breathe 1412 1409 His, N- deuteroimidazole probe of ionization state, metalloprotein structure, proton transfer in deuterated solution 1400 Asp, C=O stretch of COO - 离子化的羧基 1700-1750 Glu, C=O stretch of COOH or COOR 未解离的羧基，酯或金属配位 1451 1450,1465 Aliphatic residues, C-H bending 微环境, 极性 16555 Amide I 螺旋 1671 16703 Amide I 反平行折叠 1685 Amide I 无规卷曲 (non-hydrogen bonded) 1265 1260-1300 Amide III 螺旋 12355 Amide III sharp, 反平行折叠 1245 12454 Amide III broad, 无规卷曲 2.2.1 主链构象分析主链构象分析 蛋白质主链的构象主要由酰胺I带和酰胺III带的特征峰来确定。酰胺I带的特征峰是羰基 的伸缩振动和 N-H 摇摆振动的结果。从已知构象的蛋白质的拉曼光谱可以知道， 酰胺I带 的拉曼特征峰位置为：-螺旋结构 16555 cm-1； -折叠结构 16703 cm-1；无规卷曲结构 16653cm-1或 1685cm-1。酰胺III带的特征峰是 N-H 平面内的弯曲振动和 C-N 伸缩振动的结 果。从已知构象的蛋白质的拉曼光谱可以知道，酰胺III带的拉曼特征峰位置为: -螺旋结构 1260-1300 cm-1； -折叠结构 12355cm-1；无规卷曲结构 12454 cm-1。TBWSP31 酰胺I带的 拉曼特征峰为 1671 cm-1， 此谱峰形尖锐， 强度较大， 对应 -折叠。 酰胺III带的特征峰为 1265 和 1245 cm-1，1245cm-1处的峰形较宽，对应无规卷曲，1265cm-1处的峰对应 -螺旋，1265 和 1245 cm-1峰的强度均弱与 1671 cm-1。通过分析可知，TBWSP31 的二级结构中存在 -折 叠、-螺旋和无规卷曲，并且 -折叠的含量较多.。 从图 2 还可以看到，1325、1337 和 1451cm-1处的峰强度很大，并且峰形尖锐。1325 和 1337cm-1处的峰是由亚甲基 CH2的变形振动（扭转面内摇摆）造成的，此峰强度最大。 1451cm-1处的峰是由 C-H 弯曲振动造成的，峰的强度稍弱于 1325 cm-1。957cm-1处的峰是由 C-C 伸缩振动造成的，但其峰形不明显，可能是由于强度弱，被噪音干扰所致。1127cm-1 处的峰是由 C-N 伸缩振动造成的，强度较弱。 2.2.2 侧链环境分析侧链环境分析 由图 2 可知，表征 TBWSP31 中酪氨酸残基的谱带出现在 641、826 和 854 cm-1。其中 酪氨酸残基在 850 和 830 cm-1附近的双峰是对构象敏感的， 它是由环呼吸振动和面弯曲振动 产生的费密共振双峰。 由这对谱峰的强度比可以反映出酪氨酸在蛋白质中所处的微环境。 当 - 5 - 中国中国科技论文在线科技论文在线 其强度比为 0.30.5 时, 表示酪氨酸残基“埋藏”在疏水环境并在其 OH 基和负电荷受体之 间形成强氢键，当强度比为 1.251.40 时, 则表明酪氨酸残基全部暴露于溶剂中。对于 TBWSP31 来说，I854/I826的比值为 0.95，说明酪氨酸有的“埋藏”在疏水环境中，有的暴露 于溶剂中。 据文献可知，表征色氨酸残基的特征谱带出现在 760、880、1360 和 1553 cm-1。其中 1360cm-1的谱峰强度大，Trp 趋向于埋藏，谱峰强度弱，则趋向暴露。由图 2 可知，表征 TBWSP31 中色氨酸残基的谱带出现在 756、877 和 1550 cm-1，没有明显的谱峰出现在 1360cm-1，说明 TBWSP31 中色氨酸残基趋向于暴露。 表征 TBWSP31 中苯丙氨酸残基的谱带出现在 621、1004、1032、1207 和 1604 cm-1。 1004 cm-1处的谱峰强度很大，并且峰形非常尖锐，这是苯丙氨酸中苯环的“呼吸”振动产 生的。 2.2.3 S-S 的空间结构的空间结构 在拉曼光谱中，蛋白质 S-S 伸缩振动的位置出现在 500550cm-1，它的位置变化对 C-C-S-S-C-C 链的几何构型是敏感的。二硫键在此范围内有三种构象，在 510 cm-1附近是扭 式扭式扭式（gauche-gauche-gauche）构象，在 525cm-1附近是扭式扭式反式 （gauche-gauche-trans）构象，在 540cm-1附近是反式扭式反式（trans-gauche-trans）构 象。TBWSP31 的拉曼光谱图中，二硫键谱峰出现在 537cm-1，说明二硫键为反式扭式 反式构象。 3 结论结论 本文主要采用紫外吸收光谱和拉曼光谱（Raman）对苦荞麦蛋白质（TBWSP31）的结 构进行研究： 1. 紫外吸收光谱分析表明，TBWSP31 在 230nm处有最大吸收，此峰是肽键的吸收峰， 在 280nm处也有一个吸收峰，这是酪氨酸和色氨酸对紫外光的吸收产生的。 2. Raman 光谱对 TBWSP31 的主链构象和侧链环境分析结果表明，TBWSP31 含有- 折叠、-转角、-螺旋和无规卷曲，其中-折叠的含量较多，C-C-S-S-C-C 侧链为反式 扭式反式构象，酪氨酸残基有的埋藏在疏水环境中，有的暴露于溶剂中，色氨酸残基趋向 于暴露。 参考文献参考文献 1 王斌, 王靖, 余江. FT-Raman 光谱对蛋白质二级结构的定量分析J. 光谱学与光谱学分析, 1999, 19(5): 674676. Wang Bin, Wang Jing, Yu Jiang. A quantitative study on secondary structure of proteins by ft-raman spectroscopyJ. Spectroscopy and Spectral Analysis, 1999, 19(5): 674676. 2 Xiaona Guo，Kexue Zhu, Hui Zhang，et al. Purification and characterization of the antitumor protein from Chinese tartary buckwheat water-soluble extractsJ. J.Agric.Food Chem., 2007,55:6958-6961 3 Fujiang Zhu, Neil W. Isaacs, Lutz Hecht, Laurence D. Barron.Raman Optic