蕨菜多糖的分析.pdf

- 1 - 蕨菜多糖的分析蕨菜多糖的分析1 张方方，许文涛，黄昆仑，马丽艳，罗云波* 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京（100083） E-mail：lyb 摘摘 要：要：本文研究了采用DEAESepharose Fast Flow 和Sephacryl S-400 HR 柱层析纯化后 的蕨菜多糖的结构和单糖组成。 采用紫外光谱和傅立叶转换红外光谱法对蕨菜多糖进行定性 分析;采用气相色谱法测定蕨菜多糖中单糖的种类和构成比例;采用凝胶色谱法测定蕨菜多 糖的分子量。 结果表明,蕨菜多糖具有多糖特征性的紫外和红外吸收峰; 根据用不同分子量的 标准葡聚糖做出标准曲线，测定出纯化后的蕨菜多糖PLP分子量(Mw)为458000Da;气相分析 结果表明蕨菜多糖中葡萄糖含量最高（相对含量58.1%），其次是由半乳糖、甘露糖、鼠李 糖、阿拉伯糖（18.7%, 6.8%, 10.2% 和6.1%）等5种单糖组成。 关键词：关键词：蕨菜多糖, 红外光谱,气相色谱，分子量测定 1. 引言引言 随着科学技术的发展和人民生活水平的提高， 人们对医疗保健品的追求越来越趋向回归 自然。天然药物和天然营养保健品的研究开发已为国内外有关专家所重视1-2。天然多糖是 众多具有重要生物活性物质中的一类， 它具有多方面的生物活性和保健功能， 多糖因其具有 抗肿瘤3、抗病毒4、降血糖、降血脂5及提高免疫功能6-7等多种药理作用而越来越引起人 们的关注。 天然多糖可作为各种药物和保健品的有效成分， 对于预防和治疗包括癌症在内的 许多种疾病都具有巨大的潜力， 所以关于多糖的提取工艺、 结构性质和药理作用越来越引起 国内外学者的广泛关注，也取得了巨大的进展8-10。 多糖的化学结构是其生物活性的基础。 多糖的构效关系是指多糖的一级结构和高级结构 与其生物活性之间的关系，是当今糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题11。根据对多糖 的结构分析和药理研究，发现多糖存在明显的构效关系。多糖的构效关系12是指多糖的一 级结构和高级结构与生物活性之间的相关性，就其一级结构而言，多糖中的单糖组成、糖苷 键类型以及一些官能团对其生物活性都会有影响； 目前多糖的高级结构的研究还比较少。 多 糖的活性与溶解度有重要的关系，多糖的水溶性愈高，其药理活性也相应提高，如不溶于水 的-1,3 -D-葡聚糖经过部分羧甲基化后，水溶性提高，它的抗肿瘤活性也明显提高13。 蕨菜又名意菜、拳头菜、乌糯、狼萁等，广布全国各地，全天然、无公害、无污染，富 含氨基酸、维生素和矿物质等。既可食用，口感脆嫩、品位清香、营养丰富。具有山野菜的 独特风味，又可入药，清热滑肠、利水安神、降气化痰，又对风湿、痢疾、头晕、失眠、高 血压症都有疗效， 具有很好的食用价值和药用价值14-15。 本文将主要探讨蕨菜多糖结构和单 糖的组成情况,并测定了蕨菜水溶性多糖的相对分子量， 为进一步研究蕨菜多糖的生物活性， 开发蕨菜功能性食品奠定基础。 2材料和方法材料和方法 2.1 材料和试剂材料和试剂 蕨菜多糖(本实验室提取纯化，经DEAESepharose Fast Flow 离子交换柱和Sephacryl 1本课题得到科技部（863）项目（2006AA10Z440）,农业部“948”项目（2007-Z8）的资助。 *通讯作者 - 2 - S-400 HR 凝胶柱层析后的多糖PLP)； Dextran T-系列标准葡聚糖T-10、 T-40、 T-70、 T-500 和 蓝色葡聚糖( Pharmacia 公司)；标准单糖(E. Merck公司)；肌醇六乙酸酯(内标) (本实验室合 成) ;苯酚、硫酸、乙醇、盐酸羟胺、吡啶、醋酸酐、肌醇均为分析纯。 2.2 试验仪器试验仪器 UVIKON XL172紫外可见分光光度计（法国SECOMAM公司）；傅立叶红外光谱仪 (Nexus 5DXC FT-IR, Thermo Nicolet, America)；气相色谱仪 HP689 （Hewlett-Packard Component, Chelmsford, USA）；Elite-17ms 柱 (30 m 0.32 mm 0.25 m) 2.3 实验方法实验方法 2.3.1 蕨菜多糖的红外光谱分析蕨菜多糖的红外光谱分析 称取蕨菜多糖PLP 2mg 与400mg 干燥的KBr 混均，在玛瑙研钵中研磨5-10min。混合 均 匀之后，加入压膜内，在压力机中边抽气边加压，制成一定厚度一定直径的透明片，在红外 光谱仪上测定。用傅立叶转换红外光谱仪，在波数4000-400cm-1 期间测定红外光谱。 2.3.2 蕨菜多糖分子量的测定蕨菜多糖分子量的测定 16凝胶过滤法,Sephacryl S-400 HR 柱(1.050cm)，用0.5mol/L NaCl溶液按2ml/min的恒 定流速平衡 60h。兰色葡聚糖(分子量为200万)和各标准糖的上柱量都为3 mg，先用兰色葡 聚糖洗脱测得外水体积Vo ，再用分子量分别为T-500、T-70、T-40、T-10 的标准品相继上 柱。分部收集流出液(1 mL/ 管)，苯酚硫酸法检测糖峰，分别求得它们的洗脱体积Ve。以分 子量Mw 的对数lg Mw 为纵坐标，Ve/Vo 为横坐标作图，绘制标准曲线。样品按上述条件 上柱，求得它的Ve，根据Ve/Vo 值从标准曲线上求得样品对应的分子量。 2.3.3 肌醇六乙酰酯的制备肌醇六乙酰酯的制备 称取3g肌醇，加入4.5g 盐酸经胺、45ml醋酸酐和3m1无水吡啶，在90水浴反应2h并 不时摇动。待溶液中无不溶物后，将反应液置于冰水使肌醇肌醇六乙酰酯结晶析出。过滤后 加20ml蒸馏水洗涤，然后将产物100烘干，备用。气相色谱检测肌醇六乙酰酯应为单峰。 2.3.3 单糖衍生物的制备单糖衍生物的制备 17准确称取标准单糖样品10 mg于试管中,加入盐酸羟胺10 mg 和内标肌醇六乙酸酯8 mg,加入吡啶0.5 mL,振荡混匀, 在90水浴中加热反应30 min。取出后冷却至室温,加入0.5 mL醋酸酐,在90下继续反应30 min进行乙酰化, 70水浴中将反应产物用N2 吹干,加入1 mL氯仿重新溶解,取0.5L进行GC分析。 2.3.4 多糖样品的水解和衍生化多糖样品的水解和衍生化 精密称取蕨菜多糖样品10mg溶解到4 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液中,配成10 mg/mL的多糖 水解溶液,转移此溶液到安瓿中,充N2后封口,置于110烘箱中加热水解。 取出, 70水浴中N2 吹干。将上述水解后的蕨菜多糖,按照上述单糖衍生物制备的方法,依次加入各种试剂进行衍 生化反应,取0. 5L经过氯仿重新溶解的衍生化产物进行GC分析。 2.3.5 气相色谱条件气相色谱条件 18载气N 2 流速为40 mL/min；H2 流速为30 mL /min；空气流速为400 mL /min;进样温度 - 3 - 210；检测器温度240。初始柱温160(5 min)，程序升温5 /min至190 (4 min)，程序 升温3/min至终止温度210(10 min)。检测器：氢火焰离子化检测器(FID)。 3结果与分析结果与分析 3.1 紫外光谱分析紫外光谱分析 取蕨菜多糖适量,加水溶解,配制成浓度为1g/L的多糖水溶液,采用紫外可见分光光度法 190-400 nm范围内扫描。 光谱显示蕨菜多糖具有多糖特征性的紫外吸收图谱仅在200 nm处有 一锐细吸收峰,大于250 nm无明显的紫外吸收。结果表明,纯化的蕨菜多糖(PLP)中不含有核 酸、蛋白质以及其他杂质成分。 3.2 红外光谱分析红外光谱分析 图 1 蕨菜多糖 PLP 的 FT-IR 光谱 Fig 1 FT-IR spectra of the polysaccharide PLP 如图1所示,蕨菜多糖在3419 cm-1 处出现一个宽峰，是多糖的OH 的伸缩振动，表明 多糖存在分子内的氢键；2937 cm-1为一个弱的的CH 伸缩振动峰；1743 cm-1处是C=O的伸 缩振动峰； 1614 cm-1处是C=O 的非对称伸缩振动峰； 14001200 cm-1是多糖的特征吸收峰。 蕨菜多糖在12001000 cm-1有一个特殊的吸收区域，这是环的振动与COH 的伸缩振动以 及COC振动叠加的结果；834 cm-1 为-构型的吡喃糖吸收峰。以上均为多糖的典型结构。 - 4 - 3.3 蕨菜多糖分子量的测定 蕨菜多糖分子量的测定 图 2 多糖分子量测定的标准曲线 Fig 2 The calibration curve for determination the weight of PLP using standard dextrans 经过Sephacryl S-400 HR层析，测得荞麦多糖PLP的洗脱体积Ve，根据Ve/Vo 值从标准 曲线上求得荞麦多糖的相对分子量为458000Da。 3.4 气相色谱分析结果 气相色谱分析结果 多糖的化学结构是其生物活性的基础， 多糖中的单糖组成、 糖苷键类型以及一些官能团 对其生物活性都会有影响。 目前水解法是分析多糖链组成成分的主要手段， 将多糖链通过完 全水解分解为各个单糖， 然后分别确定各单糖的性质及在多糖链中的比例。 水解法包括完全 酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。乙酰解是将多糖与醋酸酐等混合反应，可得到乙 酰化单糖，由于变得容易气化，从而常被用于气相色谱对多糖成分的分析。 图3A为混合标准单糖糖腈乙酸酯衍生化后的气相色谱分析结果,图3B为蕨菜多糖水解 后各种单糖糖腈乙酸酯衍生化后的气相色谱分析结果。分析时间:30min左右，根据相应单糖 标准样品的相对保留时间进行定性， 根据面积归一化法计算各种单糖的含量占样品中总糖量 的百分比来定量，峰面积之比=质量比。根据蕨菜多糖样品的GC图和各种单糖标准品的GC 图比较,可以确定在蕨菜多糖中葡萄糖含量最高（相对含量58.1%），其次是由半乳糖、甘露 糖、鼠李糖、阿拉伯糖（18.7%, 6.8%, 10.2% 和6.1%）等5种单糖组成。 - 5 - 图3A 混合标准单糖气相色谱图谱 Fig 3A Gas chromatogram of mixed standard monosaccharides 1. 鼠李糖( Rhamnose) ； 2. 阿拉伯糖 ( Arabinose ) ； 3. 木糖 ( Xylose ) ； 4. 甘露糖 ( Mannose ) ； 5. 葡萄糖 (Glucose) ； 6. 半乳糖 ( Galactose ) ； 7. 内标( Internal standard )。 - 6 - 图3B 蕨菜多糖水解产物气相色谱图谱 Fig 3B Gas chromatogram of the hydrolyzed PLP 1. 鼠李糖( Rhamnose) ； 2. 阿拉伯糖 ( Arabinose ) ； 3. 甘露糖 ( Mannose )； 4. 葡萄糖 (Glucose) ； 5. 半乳糖 ( Galactose ) ； 6. 内标( Internal standard )。 4. 总结总结 本文对一种采用DEAESepharose Fast Flow 和Sephacryl S-400 HR 柱层析纯化后的蕨 菜多糖的单糖组成和结构进行研究。采用紫外光谱在190-400 nm范围内扫描，结果显示蕨菜 多糖具有多糖特征性的紫外吸收图谱峰，且纯化后的蕨菜多糖(PLP)中不含有核酸、蛋白质 以及其他杂质成分；红外光谱区通常指波数为4000-400 cm-1中红外区，用这个区域的红外光 通过样品， 分子中不同原子和官能团的振动都对应于红外光谱图上的不同吸收峰。 傅立叶转 换红外光谱分析表明PLP具有多糖特有的吸收峰；使用凝胶色谱法，根据用不同分子量的标 准葡聚糖做出标准曲线，测定出纯化后的蕨菜多糖PLP分子量(Mw)为458000Da；蕨菜多糖 PLP用三氟乙酸(TFA)水解后，经过乙酰化，使用气相色谱法测定蕨菜多糖中单糖的种类和 构成比例；结果表明,蕨菜多糖PLP中葡萄糖含量最高（相对含量58.1%），其次是由半乳糖、 甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖（18.7%, 6.8%, 10.2% 和6.1%）等5种单糖组成。 - 7 - 参考文献参考文献 1张志芬.浅谈天然药物的发展与中药研究.中国中药杂志，2005,30(17):1375-1377. 2林翠梧，蒋林斌，赵树凯.天然药物的研究与开发.广西大学学报(自然科学版)，2001,26(3):164-165. 3 X.P.Yang, D.Y.Guo, J.M .Zhang, et al. Characterization and antitumor activity of pollen polysaccharide J. International Immunopharmacology. 2007, 7(4), 427-434. 4 M. T. H. Khan, A. Ather, K. D. Thompson, et al. Extracts and molecules from medicinal plants against herpes simplex virusesJ. Antiviral Research. 2005, 67(2), 107-119. 5 S. P. Li, G. H. Zhang, Q. Zeng, Z. G. Huang, Y. T. Wang, et al. Hypoglycemic activity of polysaccharide, with antioxidation, isolated from cultured Cordyceps myceliaJ. Phytomedicine. 2006, 13(6), 428-433. 6 T. H. Yang, M. Jia, J. Meng, et al. Immunomodulatory activity of polysaccharide isolated from Angelica sinensisJ. International Journal of Biological Macromolecules.2006, 39, (4-5), 179-184. 7 A. I. Schepetkin and T. M. Quinn. Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potentialJ. International Immunopharmacology. 2006, 6(3), 317-333. 8冯国宣.抗癌植物资源与天然产物研究.湖北民族学院学报(自然科学版)，2001,19(3):26-32. 9马红樱，张德禄，胡春香等.植物活性多糖的研究进展.西北师范大学学报，2004,40(3):11 2-117. 10张晓静，刘会东.植物多糖提取分离及药理作用的研究进展.时珍国医国药，2003, 14(8):495-497. 11 赵国华，陈宗道，李志孝等.活性多糖的研究进展.食品与发酵工业，2002,27(7):45-48 12 曾凯宏. 真菌多糖的结构与功能. 食品科技，2001，4：65-68 13J.A. Bohn and J.N .BeMiller. (13)-Glucans as biological response modifiers: a review of structure-functional activity relationship. Carbohydrate Polymers.1995, 28:3-14 14 刘胜祥.植物资源学（第二版），武汉：武汉出版社，1994，8 15 南京野生植物综合研究所，中国野生植物，1991，3 16方积年.多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定J.药学通报1984,19(10):46-49. 17张惟杰搪复合物生化研究技术杭州:浙江大学出版社，1996 18李铁林，吴昌贤，张燕.糖和糖醇的气相色谱研究.分析化学，1982,10(2):272-276 Analysis of Pteridium aquilinum Polysaccharide Zhang Fangfang, Xu Wentao, Huang Kunlun, Ma Liyan, Luo Yunbo * College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing （100083） Abstract In this paper, monosaccharide composition and the structure of a water-soluble polysaccharide, obtained from Pteridium aquilinum , was studied by ultraviolet(UV) , Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and gas chromatography(GC). The water-solub