黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化、抑菌作用研究.pdf_第1页
黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化、抑菌作用研究.pdf_第2页
黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化、抑菌作用研究.pdf_第3页
黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化、抑菌作用研究.pdf_第4页
黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化、抑菌作用研究.pdf_第5页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

127基础研究食品科学2010, Vol. 31, No. 03 黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化、抑菌作用研究 宋 茹 1,2,汪东风2,谢 超1,王 铣1 (1. 浙江海洋学院食品与药学学院,浙江 舟山 316004;2.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东 青岛 266003) 摘 要:采用胃蛋白酶水解黄鲫,测定酶解液的蛋白提取率、可溶性肽含量、水解度及氨基酸组成,并对酶解 液体外抗氧化和抑菌作用进行研究。结果表明:黄鲫胃蛋白酶酶解液的蛋白提取率、可溶性肽提取率、水解度分 别为 (110.28 4.81)%、 (81.78 0.04)% 和 (18.12 0.39)%,黄鲫胃蛋白酶酶解液的人体必需氨基酸相对含量可达 37.91%。黄鲫胃蛋白酶酶解液具有很强的抗氧化能力,清除羟自由基和DPPH 自由基的ED50分别为4.55g/mL 和 4.46g/mL,还原力随着黄鲫胃蛋白酶酶解液质量浓度的增加而增大,在3.4 g/mL 和13.6g/mL 低、中质量浓度时 螯合金属离子能力与 EDTA 接近。体外抑菌实验显示:黄鲫胃蛋白酶酶解液具有广谱抑菌性,对大肠杆菌的抑菌 效力分别与 13.2115.44mcg/mL的氨苄青霉素和 325.00340.00U/mL的硫酸链霉素相当 (P 0.05)。 关键词:黄鲫;胃蛋白酶;酶解液;抗氧化作用;抑菌作用 in vitro Antioxidant and Antibacterial Activities of Pepsin Hydrolysate of Half-fin Anchovy (Setipinna taty) SONG Ru1,2,WANG Dong-feng2,XIE Chao1,WANG Xian1 (1. College of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China ; 2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China) Abstract : Half- fin anchovy (Setipinna taty) homogenate was hydrolysated by pepsin. Protein yield, contents of soluble peptides and degree of hydrolysis were analyzed and in vitro antioxidant and antibacterial activities of the hydrolysates were also evaluated. Results showed protein extract rate, soluble peptides contents, degree of hydrolysis of half-fin anchovy pepsin hydrolysate were (110 4.81)%, (81.78 0.04)% and (18.12 0.39)%, respectively. The relative contents of essential amino acids in half-fin anchovy hydrolysate (HAH) reached 37.91%. HAH showed strong radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH radicals with the ED50 values of 4.55 g/mL and 4.46 g/mL, respectively. The reducing power increased with rising concentration and the metal chelating ability was equivalent to that of EDTA at the 3.4g/mL or 13.6 g/mL. HAH displayed broad antibacterial spectra in vitro and the antibacterial effecacy against Escherichia coli was equal to 13.21 15.44 mcg/mL of ampicillin of and 325.00 340.00 U/mL of streptomycin sulfate (P0.05). Key words:half-fin anchovy (Setipinna taty);pepsin;hydrolysates;antioxidant activity;antibacterial activity 中图分类号:TS254.1 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2010)03-0127-05 收稿日期:2009-07-31 基金项目:舟山市科技计划项目(Y20082086) 作者简介:宋茹(1976 ),女,讲师,博士研究生,研究方向为食品加工与检验。E-mail:happysong545 黄鲫(Setipinna taty)属鳀科,黄鲫属,在我国南 海、东海、黄海、渤海海域可常年捕获,且产量较 大1 。但其个体小且肉薄、刺多,目前主要是加工成 干制品。国内外学者通过酶解方式从加工利用率低的海 水鱼及废弃物中获得大量的生物活性物质,如:具有抗 氧化作用的太平洋鳕鱼蛋白酶解液、金枪鱼骨蛋白肽2-3, 牡蛎蛋白抗菌肽4,海鲷鳞血管紧张素抑制肽5等。有 关黄鲫蛋白酶酶解液生物活性的研究还未见报道,本研 究在前期实验基础上对黄鲫胃蛋白酶酶解液的体外抗氧 化作用和抑菌作用进行研究,旨在为黄鲫蛋白酶酶解液 中活性物质的进一步分离纯化和鉴定提供参考。 1材料与方法 1.1材料与试剂 黄鲫购于舟山南珍水产市场。 大肠杆菌(Escherichia coli)、荧光假单孢菌 (Pseudomonas fluorescens)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、 2010, Vol. 31, No. 03食品科学基础研究128 八叠球菌 (Sarcina)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)为浙 江海洋学院食品与药学学院、医学院食品实验室保存 菌 种 。 胃蛋白酶、牛血清白蛋白、氨苄青霉素、硫酸链 霉素、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)为生化试剂;二丁 基羟基甲苯(BHT)食品级;其余试剂均为分析纯。 1.2仪器与设备 BS110S 型电子分析天平 北京赛多利斯分析天平有 限公司;DS-1 型高速组织捣碎机 上海标本模型厂; PP-20 型pH 计 德国赛多利斯公司;HHS 型电热恒温 水浴锅 海博迅实业有限公司医疗设备厂;EYELA N- 10001旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;LDZX-40BI 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械 厂;KDN-04C 型数控消化炉 上海新嘉电子有限公司; HWS型智能生化培养箱 宁波江南仪器厂;SW-CJ-1F型 单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;Himae CF 16 RX型多功能离心机;UV-1200UV型紫外-可见分光光 度计;PICO TAG 氨基酸分析仪 美国Waters 公司。 1.3方法 1.3.1黄鲫胃蛋白酶酶解液(HAH)制备 黄鲫去内脏后洗净,组织捣碎机捣碎,按照一定 比例加入去离子水混合,混合浆液用酸调节 pH 值到 2.0,37保温 10min,加入适量胃蛋白酶并搅拌均匀。 酶解过程中的前30min每隔15min加入少量盐酸或碱保持 pH 值在 2.0。反应结束后,95100加热 10min 钝化 灭酶。混合液经低温(4)7000r/min 离心10min,弃去上 层油膜和底部残渣,留中间酶解液再经过滤可得澄清液 体, 20保藏备用。 1.3.2蛋白提取率(NR)测定 黄鲫经胃蛋白酶水解后,记录水解离心后上清液的 总体积,然后取5mL 水解液,用凯氏定氮法6分别测定 上清液中蛋白含量及原料中总蛋白含量。 上清液中总蛋白质含量 蛋白提取率 /%= 100 原料中总蛋白质含量 1.3.3可溶性肽含量测定 采用三氯乙酸(TCA)沉淀法。取水解后上清液5mL 于离心管中,加入 5mL 浓度为 15%TCA 液,摇匀并静 置30min后,8000r/min 离心15min, 凯氏定氮法测定5mL 酶解液总蛋白质及离心后上清液蛋白质含量。 TCA沉淀后上清液中总蛋白质含量 可溶性肽含量 /%= 100 酶解液总蛋白质含量 1.3.4水解度(DH)测定 采用茚三酮比色法6测定上清液中游离氨基态氮 量,凯氏定氮法测定原料总氮量。 上清液中游离氨基态氮总量 水解液/%= 100 原料总氮量 1.3.5氨基酸组成分析 取一定量黄鲫胃蛋白酶酶解液,加入6mol/L HCl 充 氮气后,热融密封,110烘箱中水解 24h,脱酸后, 用水定容至适量浓度,用氨基酸分析仪测定。 1.3.6体外抗氧化能力测定 1.3.6.1体外清除羟自由基和 DPPH 自由基 体外清除羟自由基方法参照文献7略加修改。取 0.75mmol/L 邻二氮菲1mL于试管中,依次加入pH7.40的 PBS缓冲液2mL,样品1mL,充分混匀后,加入0.75mmol/L 的硫酸亚铁1mL,混匀,加0.12% 的 H2O2 1mL,37 保温 90min,蒸馏水调零,536nm 波长处测其吸光度, 计作As;用1mL 蒸馏水代替1mL H2O2测其吸光度,记 为 Ab;用 1mL 的蒸馏水代替 1mL 样品测其吸光度,记 为 Ap。 AsAp 羟自由基清除率 /%= 100 AbAp 体外清除DPPH 自由基测定方法参照文献8略加修 改。1.5mL 样品同1.5mL 99.5% 乙醇混合,加上375L 0.02% DPPH 自由基的99.5% 乙醇液,剧烈混合,室温 暗室下放置 60min,99.5% 乙醇调零,测定517nm 波长 处吸光度,记作A样品;用1.5mL 蒸馏水代替1.5mL样品, 其余条件同样品测定,记作 A对照;用 375L 乙醇代替 375L 的 0.02% DPPH 乙醇液,其余条件同样品测 定吸光度,记作 A空白。 A对照(A样品A空白) DPPH自由基清除率/%=100 A对照 1.3.6.2还原力测定 水解液还原力测定按照文献9方法进行。1mL样品 加入1mL pH 6.6 的0.2mol/L 磷酸盐缓冲液,混合均匀, 再加入 1mL 的 1% 铁氰化钾,混合物在 50水浴保温 20 min,急剧冷却后加入10% TCA 1mL,3000r/min 离 心10min,取上清液2mL加入2mL蒸馏水和0.8mL 0.1% 三氯化铁混合均匀,10min 后测定700nm波长处吸光度, 吸光度越大表明还原力越强。 1.3.6.3金属螯合率测定 按照文献10方法进行,1mL 样品液同 3.7mL 蒸馏 水混合, 然后加入0.1mL 2mmol/L FeCl2和 0.2 mL 5mmol/L 菲咯嗪,漩涡混合后室温放置20min,蒸馏水调零,测 定 562nm 处吸光度,记作 A样品;对照用蒸馏水代替样 129基础研究食品科学2010, Vol. 31, No. 03 品,其余条件相同为 A对照;样品空白用等体积蒸馏水 代替试剂,记作 A样空。 A对照(A样品A样空) 金属螯合率/%= 100 A对照 1.3.7体外抑菌作用研究 1.3.7.1抑菌谱研究 抑菌性测定参照琼脂孔穴扩散法11略加修改。培养 皿中加入 100L 活化好的菌悬液(菌龄为1824h,菌数 在 106107CFU/mL),然后加入15mL 4550左右营养 琼脂培养基,充分混合均匀,待琼脂凝固后,用灭菌 打孔器(直径 4 mm)打孔,每孔加入经过滤除菌的酶解液 25L,37培养 24h,测定抑菌圈直径。 1.3.7.2抑菌效力测定 采用氨苄青霉素和硫酸链霉素为抑菌药物阳性对 照,首先配制氨苄青霉素浓度为16901976mcg/mL,硫 酸链霉素浓度为13001360U/mL,分别经过滤除菌后, 用灭菌去离子水 2 倍稀释法逐步进行稀释,然后采用琼 脂孔穴扩散法分别测定黄鲫胃蛋白酶酶解液和不同稀释 倍数的抑菌药物对大肠杆菌的抑菌作用,根据抑菌圈直 径大小判定黄鲫胃蛋白酶酶解液抑菌效力。 2结果与分析 2.1黄鲫胃蛋白酶酶解液指标及氨基酸分析 由表 1 可知,黄鲫胃蛋白酶酶解液的蛋白提取率为 (110.28 4.81)% 大于100%,凯氏定氮法测定的是样品 粗蛋白含量,包括了其他含氮物质,而且酶解过程中 加入的胃蛋白酶也属于蛋白质类物质,所以最终酶解液 蛋白提取率高于 100%。加入三氯乙酸后,可溶性肽提 取率达到(81.78 0.04)%,说明黄鲫胃蛋白酶酶解液的 蛋白氮含量高。水解度高低影响肽链的长短,进而影 响相对分子质量大小。水解度过低,蛋白质中活性基 团未充分释放;水解度过高酶解液的乳化及乳化稳定 性、成泡及泡沫稳定性均显著的降低12。在前期实验基 础上,确定胃蛋白酶水解黄鲫的水解度(18.12 0.39)% 时抗氧化和抑菌作用强,且酶解液具有良好的功能性。 表 2 氨基酸分析表明,HAH 的谷氨酸和天冬氨酸 含量较高,人体必需7 种氨基酸相对含量为37.91%。疏 水性氨基酸相对含量为 37.37%,蛋白水解液和肽中疏水 氨基酸含量高能够增强水解物的抗氧化能力13,具有抗 氧化作用的氨基酸如:缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖 氨酸、精氨酸、组氨酸等与酶解液的抗氧化性有关14。 而具有抗菌作用的蛋白和肽类一级结构比较相似,N 端 富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸,C 端富含丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸等非极性氨基酸,中间部分则富 含脯氨酸15-16,HAH 含有与抗菌作用有关的氨基酸且相 对含量较高。 2.2HAH 体外抗氧化能力测定 2.2.1清除羟自由基和 DPPH 自由基能力 HAH、抗坏血酸(VC)、BHT 对羟自由基、DPPH 自由基的半抑制率浓度(ED50)结果见表3,ED50值越小表 示自由基清除能力越强。 自由基 ED50/( g/mL) HAHBHTVC 羟自由基4.5522.324.37 DPPH 自由基4.4622.783.80 表3 H A H 、B H T 、V C 对自由基清除能力比较 Table 3 Radical scavenging activity of HAH, BHT and VC against hydroxyl and DPPH free radicals 从表 3 可知,清除羟自由基方面,HAH 与 VC 接 近,清除效果均强于 BHT。VC 对DPPH 清除能力最强, 其次为 HAH,BHT 最弱。羟自由基是氧化能力最强的 自由基,实验结果表明 HAH 在低浓度时对羟自由基和 DPPH 自由基的清除能力要强于化学合成抗氧化剂BHT。 2.2.2还原力测定 HAH、BHT、VC在质量浓度为3.4、13.6、27.2g/mL 低、中、高 3 个质量浓度时的还原力大小如图 1 所示。 由图 1 可以看出,HAH、BHT、VC 的还原力随 着质量浓度的增加而增大,在低质量浓度 3.4g/mL 时 HAH 的还原力最高,而在中、高质量浓度 13.6g/mL 项目蛋白提取率/%可溶性肽含量/%水解度/% 结果110.28 4.8181.78 0.0418.12 0.39 表1 黄鲫胃蛋白酶酶解液指标测定结果(x s,n=3) Table 1 Indexes of half-fin anchovy pepsin hydrolysates (x s,n=3) 注:在强酸水解条件下色氨酸被破坏,所以检测结果不包括色氨酸。 氨基酸种类含量/(mg/100mL)氨基酸种类含量/(mg/100mL) 天冬氨酸(Asp)414.82异亮氨酸(Ile)145.01 苏氨酸(Thr)162.79亮氨酸(Leu)246.94 丝氨酸(Ser)171.14酪氨酸(Tyr)43.97 谷氨酸(Glu)607.40苯丙氨酸(Phe)131.88 甘氨酸(Gly)261.71赖氨酸(Lys)303.26 丙氨酸(Ala)298.16组氨酸(His)74.92 缬氨酸(Val)285.62精氨酸(Arg)198.64 甲硫氨酸(Met)79.68脯氨酸(Pro)148.72 必需氨基酸 37.91 疏水性氨基 37.37 相对含量/%酸相对含量/% 表2 黄鲫胃蛋白酶酶解液氨基酸分析 Table 2 Amino acid composition of half-fin anchovy pepsin hydrolysates 2010, Vol. 31, No. 03食品科学基础研究130 和 27.2g/mL 时则是BHT 还原力最大,HAH 次之,VC 还原力最低。 并非通过螯合过渡态金属离子作用来延缓脂质的氧化。 2.3HAH 体外抑菌作用 2.3.1体外抑菌谱研究 2.2.3金属螯合能力 金属螯合在脂质氧化中具有重要作用,因为食品存 在的过渡态金属离子如:Fe、Cu、Co 能够加速 Fenton 反应,从而加速脂质自动氧化、超氧阴离子降解为活 泼化合物。通过螯合过渡态金属离子降低其浓度,能 够达到延缓脂质氧化的作用 1 7 -1 9 。H A H 、B H T 、 EDTA、VC 在低、中、高质量浓度,即:3.4、13.6、 27.2g/mL 对 Fe2+的螯合结果见图2。 由表4 抑菌谱结果得知,HAH 对革兰氏阴性菌(G) 和革兰氏阳性菌(G)均有抑菌作用,具有广谱抑菌作 用。HAH 对G菌抑菌效果总体强于 G菌,由于大多数 抗菌肽属于中性或偏碱性蛋白,能通过与G菌外膜上的 脂多糖等负电物质相互作用,从而破坏膜结构以发挥抗 菌作用,而G菌无脂多糖膜,只能通过表面肽聚糖中的 胞壁酸、糖醛酸等带少量负电荷与抗菌肽发生作用20。 HAH 的中性和碱性氨基酸相对含量占54.91%,有利于 形成阳离子型抗菌肽类抑制 G菌。 2.3.2抑菌效力测定 HAH对大肠杆菌的抑制作用与不同稀释倍数的氨苄 青霉素和硫酸链霉素的抑菌效果比较见表 5。 由表 5 可知,HAH 对大肠杆菌的抑菌效果与稀释 128倍的氨苄青霉素(13.2115.44 mcg/mL)和稀释4倍的硫 酸链霉素(325.00340.00U/mL)抑菌效力相当(P0.05)。 3结 论 黄鲫胃蛋白酶酶解液可溶性肽含量高,必需氨基酸 含量丰富,酶解液体外清除羟自由基和DPPH 自由基能力 强于BHT,且具有一定的还原力和金属螯合力。体外抑 菌实验显示该酶解液对G和G菌有抑制作用,具有广谱 抑菌性,并且抑菌效力较高,有进一步开发应用价值。 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 HAH A700nm 质量浓度/( g/mL) 3.413.627.2 BHTVC 图1 H A H 、B H T 和V C 还原力比较 Fig.1 Reducing power of HAH, BHT and VC 75 55 35 15 5 螯合率/% HAHBHTVCEDTA 3.413.627.2 质量浓度/( g/mL) 图2 H A H 、B H T 、E D T 和V C 金属螯合力比较 Fig.2 Concentration despendence of metal ion chelating abilities of HAH, BHT, EDTA and VC 从图 2 可以看出,HAH 具有一定螯合 Fe2+能力, 在 3.4g/mL 和 13.6g/mL 低、中质量浓度时螯合金属 离子能力与 EDTA 相近,但在高质量浓度 27.2g/mL, EDTA 螯合金属离子能力明显强于 HAH。BHT 和 VC, 特别是 BHT对 Fe2+未表现出螯合能力,表明BHT和VC 的抗氧化性主要是通过清除自由基来降低氧化进程,而 注:. 未形成明显抑菌圈。 实验用菌抑菌圈直径/mm 大肠杆菌(Escherichiacoli)17.7 0.29 G菌 荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)10.8 0.35 普通变形菌(Proteus vulgaris)11.0 0.00 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)9.5 0.71 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)11.3 0.35 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) G菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)9.5 0.71 八叠球菌 (Sarcina)9.3 0.35 藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)8.8 0.35 表4 H A H 的抑菌谱(x s,n=3) Table 4 Antibacterial spectrum of HAH (x s,n=3) 注:.与氨苄青霉素抑菌圈大小比较无显著性差异(P 0.05);.与硫酸链霉素抑菌圈大小比较无显著性差异(P 0.05)。 项目 抑菌圈直径/mm 2 倍4 倍8 倍16 倍32 倍64 倍128倍 氨苄青霉素30.0 0.0028.5 0.7126.0 0.0024.0 0.0022.0 0.0019.5 0.7117.3 0.35 硫酸链霉素20.0 0.0017.8 0.3516.0 0.0013.3 0.3511.0 0.007.00 0.00 HAH17.7 0.29 表5 H A H 的抑菌效力与对照药物比较(x s,n=3) Table 5 Antibacterial efficacy of HAH and a control drug (x s,n=3) 131基础研究食品科学2010, Vol. 31, No. 03 参考文献: 1孙蜀东, 任一平. 黄海南部黄鲫 Setipinna taty (Cuvieret valenciennes) 渔业生物学研究J. 海洋湖沼通报, 2003(1): 62-65. 2SAMARANAYAKA A G P, LI-CHAN E C Y. Autolysis-assisted pro- duction of fish protein hydrolysates with antioxidant properties from pacific hake (Merluccius productus)J. Food Chemistry, 2008, 107: 768-776. 3JE J Y, QIAN Z J, BYUN H G, et al. Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzy- matic hydrolysisJ. Process Biochemist, 2007, 42: 840-846. 4LIU Z Y, DONG S Y, XU J, et al. Production of cysteine-rich antimicro- bial peptide by digestion of oyster (Crassostrea gigas) with alcalase and bromelinJ. Food Control, 2008, 19: 231-235. 5FAHMI A, MORIMURA S, GUO H C, et al. Production of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from sea bream scaleJ. Process Biochemistry, 2004, 39: 1195-1200. 6吴谋成. 食品分析与感官评定M. 北京: 中国农业出版社, 2002: 79- 80. 7De AVELLAR I G, MAGALHAES M M, SILVA A B, et al. Reevaluat- ing the role of 1,10-phenanthroline in oxidative reactions involving ferrous ions and DNA damageJ. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1675: 46-53. 8BERSUDER P, HOLE M, SMITH G. Antioxidants from a heated histidine-glucose model system. I. investigation of the antioxidant role of histidine and isolation of antioxidants by high performance liquid chromatographyJ. Journal of American Oil Chemists Society, 1998, 75: 181-187. 9OYAIZU M. Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatographyJ. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1988, 35: 777-775. 10DECKER E A, WELCH B. Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle foodJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38: 674-677. 11MURTHY P S, MANONMANI H K. Physico-chemical, antioxidant and antimicrobial properties of indian monsooned coffeeJ. European Food Research and Technology, 2009, 229: 645-650. 12VILAILAK K, SOOTTAWAT B, DUANGPORN K, et al. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally (Selaroides leptolepis) as influenced

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论