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现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.8 770 金属离子浓度对枯草芽孢杆菌芽孢率的影响 金属离子浓度对枯草芽孢杆菌芽孢率的影响 姚露燕，张水华，曹昱，王永华 （华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640） 摘要：通过摇瓶单因素试验，研究了金属离子浓度对枯草杆菌 BS-MM03 菌株发酵生产的芽孢率的影响，发现 Mg2+离子对其影 响最为显著，其次为 Mn2+离子。利用正交试验确定其最适产芽孢的金属离子浓度组合为：Mg2+ 0.030%、Mn2+ 0.015%、Ca2+ 0.02%、 Fe2+ 0.004%。 关键词：枯草芽孢杆菌；金属离子；芽胞率 中图分类号：Ts201.3；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)08-0770-03 Effect of Metal Ion Concentration on Sporulation Efficiency of Bacillus subtilis YAO Lu-yan, ZHANG Shui-hua, CAO Yu, WANG Yong-hua （College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology, Guangzhou 510640, China） Abstract: By single factor experiments, the effect of metal ion concentration on sporulation efficiency of Bacillus subtilis BS-MM03 was examined. Among the examined ions, Mg2+ ion showed the highest effect on sporulation efficiency, followed by Mn2+ ion. Orthogonal experiment showed that the optimal ion concentrations was as follows: Mg2+ 0.030%,Mn2+0.015%,Ca2+ 0.02% and Fe2+ 0.004%。 Key words: Bacillus subtilis; metal ion; sporulation efficiency 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 作为有益的根际 微生物，近年来越来越受到人们的广泛关注，目前在 净化水产养殖环境、农作物病害防治、家禽饲料添加 剂等方面取得较好的效果。然而，国内外对枯草芽孢 杆菌的研究大都把视线放在了营养体细胞和代谢物质 上，而对芽孢杆菌的抗逆性休眠体芽孢，却研究 得不多。 枯草芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保存，复 活率高，是制备枯草芽孢杆菌制剂的理想存在形式， 而制剂中的芽孢含量是影响制剂应用效果的关键因 素。芽孢的形成受环境因素的影响，不同菌种形成芽 孢的条件不同，因此，一些学者对枯草芽孢杆菌的发 酵培养进行了研究， 以期获得较高的含菌量或芽孢量。 张丽霞等1采用 Plackett-bruman 设计法和响应面分析 法，在摇瓶发酵条件下，使含菌量明显提高；张根伟 2通过单因素试验和正交试验，对枯草芽孢杆菌 BS-6 的液体发酵条件进行了研究。本文就金属离子对枯草 芽胞杆菌菌株 BS-MM03 的芽胞产率的影响进行了研 究，以期获得较高的芽胞产率，为枯草芽孢杆菌制剂 的产业化生产提供基础资料。 收稿日期：2008-03-24 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 本实验室提供，编号为 BS-MM03。 1.1.2 仪器与试剂 仪器：YXQ-LS-30S灭菌锅、ZHWY-200D 恒温 摇床、YSEI 生化培养箱、ACCULLAB，ALC-210.4 电子天平、eppendorf 移液枪、sartorius，PD-10 酸度 计。 试剂：牛肉膏、蛋白胨、玉米浆为市售，NaCl、 KCl、MgCl2、MnCl2H2O、FeCl2、CaCl2均为分析纯。 1.1.3 培养基 种子培养基：LB 培养基 基本培养基：DSM 培养基3，蛋白胨 1%、牛肉 膏 0.3%、NaCl 0.5%、KCl 0.2%、 MgCl2 0.03%、CaCl2 0.01%、MnCl2 0.01%、FeCl2 0.003%，pH 为 7.1；121 灭菌 20 min。 检测培养基：LB 琼脂培养基 1.2 方法 1.2.1 种子培养 以无菌操作从斜面挑取一环至装有20 mL种子培 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.8 771 养基的 100 mL 锥形瓶中，将锥形瓶置于 200 r/min、 37恒温摇床中培养 78 h。 1.2.2 摇瓶培养 以 2%接种量将种子接入装有 50 mL 培养基的 250 mL 锥形瓶中，并于 200 r/min、37 恒温摇床培 养 18 h。 1.2.3 活菌和芽孢计数 活菌计数：以平板涂布法进行计数，培养基为 LB 培养基。 芽孢计数：将样品在 80 水浴中处理 15 min 后 进行平板涂布计数。 2 结果与讨论 2.1 Mg2+离子的影响 本实验选择了初始 MgCl2含量为 0.010%、 0.030%、0.050%、0.070%、0.090%的摇瓶培养基，其 它试剂含量与基本培养基相同， 培养 18 h 后结果见图 1。由测定结果可以看出，随着 MgCl2含量的升高， 活菌数、芽孢数和芽孢率呈先升后降的趋势，其含量 为 0.03%时活菌数、芽孢数和芽孢率均达到最大。有 文献报道 Mg2+离子有利于活菌的生长但不利于芽孢 的生成6， 在本实验中只在 MgCl2含量大于 0.030%后 活菌数和芽孢率均下降。 图 1 Mg 2+离子含量对芽孢率的影响 Fig.1 Effect of Mg 2+ ion concentration on sporulation efficiency 2.2 Mn2+离子的影响 本实验选择了初始 MnCl2含量为 0.001%、 0.005%、0.010%、0.015%、0.020%的摇瓶培养基，其 它试剂含量与基本培养基相同， 培养 18 h 后结果如图 2。由测定结果可以看出，随着 MnCl2含量的升高活 菌数、芽孢数和芽孢率也逐渐升高，但当含量超过 0.015%后三者均开始下降。 有文献报道 Mn2+离子对活菌的生长和芽孢的生 成都有促进作用，但当含量达到某一域值时，将呈现 抑制趋势4,5，本实验结果也符合这样的趋势。 图 2 Mn 2+离子含量对芽孢率的影响 Fig.2 Effect of Mn 2+ ion concentration on sporulation efficiency 2.3 Ca2+离子的影响 本实验选择了CaCl2初始含量为0.010%、 0.020%、 0.030%、0.040%、0.050%的摇瓶培养基，其他试剂含 量与基本培养基相同，培养 18 h 后结果如图 3。由测 定结果可以看出，CaCl2含量对活菌数的影响不显著， 但对芽孢率有一定的影响， 在含量为0.020%时芽孢率 最高。 图 3 Ca 2+离子含量对芽孢率的影响 Fig.3 Effect of Ca 2+ ion concentration on sporulation efficiency 2.4 Fe2+离子的影响 图 4 Fe 2+离子含量对芽孢率的影响 Fig.4 Effect of Fe 2+ ion concentration on sporulation efficiency 本实验选择了FeCl2初始含量为0.002%、 0.004%、 0.006%、0.008%、0.010%的摇瓶培养基，其它试剂含 量与基本培养基相同，培养 18 h 后结果如图 4。由测 定结果可以看出， FeCl2含量对活菌数、 芽孢数和芽孢 率有一定影响， 当其含量为 0.004%时三者均达到最大 值。 2.5 正交试验 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.8 772 使用 L9正交实验对 MgCl2、 MnCl2、 CaCl2、 FeCl2 四个因素进行 4 因素 3 水平正交实验，设计见表 1， 结果见表 2。 表 1 正交设计 Table 1 Orthogonal Design 因素水平 MgCl2/% MnCl2/% CaCl2/% FeCl2/% 1 0.010 0.005 0.005 0.001 2 0.030 0.015 0.020 0.004 3 0.050 0.025 0.035 0.007 表 2 正交实验 Table 2 Results of the orthogonal experiments 实验号 MgCl2/% MnCl2/% CaCl2/% FeCl2/% 芽孢率/% 1 1 1 1 1 69 2 1 2 2 2 76 3 1 3 3 3 74 4 2 1 2 3 81 5 2 2 3 1 89 6 2 3 1 2 79 7 3 1 3 2 73 8 3 2 1 3 77 9 3 3 2 1 76 K1 219 223 225 234 K2 249 242 233 228 K3 226 229 236 232 k1 73.0 74.3 75.0 78.0 k2 83.0 80.7 77.7 76.0 k3 75.3 76.3 78.7 77.3 R 10 6.4 3.7 2 从表 2 知，各种因素当中，MgCl2含量对芽孢率 的影响最大，其次是 MnCl2含量和 CaCl2含量，FeCl2 含量的影响最小，最优因素组合为 0.030%的 MgCl2、 0.015%的 MnCl2、 0.035%的 CaCl2和 0.001%的 FeCl2。 3 结论 芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆 性休眠体，并非细菌生活史不可缺少的部分，它的形 成受营养物质和环境因素的影响。 通过本实验发现金属离子对 BS-MM03 枯草芽孢 杆菌发酵生产的芽孢产率有影响， 其中 Mg2+离子的影 响最为显著， 其次为 Mn2+离子，其最适产芽孢的金属 离子含量组合为：Mg2+ 0.030%、Mn2+ 0.015%、Ca2+ 0.02%、Fe2+ 0.004%。 参考文献 1 张丽霞,李荣禧,王琦,等.枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化 J.中国生物防治,2006,22(增刊):82-88 2 张根伟.枯草芽孢杆菌 BS-6 液体发酵条件的研究J.河北 省科学院学报,2005,22(1):54-57 3 Sandra M. 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