米酒凝乳酶酶学性质研究.pdf

江苏农业科学2 0 0 8年第 5期 一7 l一 米酒凝乳酶酶学性质研究 李 莹，周剑忠 ， 黄开红，黄 自苏 ( 江苏省农业科 学院农产品加 工研 究所 ， 江苏南 京 2 1 O O 1 4 ) 摘要： 采用乙醇沉淀法提取米酒中凝乳酶的粗酶液， 对其酶学性质进行了分析。试验结果表明： 米酒中凝乳 酶的最适反应温度为6 0， 但该温度条件下的酶活稳定性较差， 6 o下处理 6 0 r a i n ， 酶活性仅存 1 5 。在实际 干酪生产中， 选择最适酶促反应温度 4 5 o C； 米酒凝乳酶的最适反应 p H值在4 5 5 左右， 此范围内具有较高的酶 活稳定性 ； 添加 0 4 g L C a C 1 ， 间接加快酶促反应速率， 增强凝乳硬度。 关键词 ： 米酒；凝乳酶 ； 酶学性质 中图分类号 ： Q 9 4 6 5 文献标志码 ：A 文章编号 ： 1 0 0 21 3 0 2 ( 2 0 0 8 ) 0 5 0 0 7 1 0 2 凝乳酶是干酪生产中起凝乳作用 的关键物质 ， 传统来源于小牛的皱 胃。据统计 ， 随着干酪工业 的 发展 ， 全世界每年要宰杀 5 0 0 0万头小牛以获得凝乳 酶， 造成全球性小牛短缺 J 。因此， 筛选高效微生 物凝乳酶代替小牛凝乳酶， 以缓解小牛凝乳酶供应 的紧张状态 ， 具有极大的发展前景。 米酒通常可被用作制造中国传统乳制品扣 碗酪。米酒 中含有的蛋白酶活性成分可以凝固乳中 酪蛋 白， 这种蛋 白酶成分来源于酒 曲中存在的微 生 物 J 。米酒发酵酿 造 中的主要菌系根霉可 作 为凝乳酶的潜在产生菌 ， 而且它产生 的凝乳酶在食 品卫生学上是安全的 I 4 J 。本研究通过乙醇沉淀法 提取米酒中凝乳酶的粗 酶液 ， 对其凝乳活性及有关 影响因素进行 了初步分析 ， 为干酪工业生产中微生 物凝乳酶的开发利用提供试验依据。 1 材料与方法 1 1 材料 脱脂奶粉 ： 新西兰乳 品公 司； 糯米 ： 南京孝陵卫 市场； 酒曲： 安琪甜酒曲。 1 2 仪 器设备 L R H一1 5 0型生 化培养箱 ( 上 海一恒 ) ， D Z K W 一 4型电子恒温水浴锅 ( 上海科析 ) ， S Z一1型旋涡 混合器 ( 江苏金坛 ) ， Z D一2型 p H计 ( 上海雷磁 ) ， J J 5 o o型精密电子天平( 常熟双杰) ， A n k e L X J 一1I B 收稿 日期 ： 2 0 0 80 40 1 基金项 目： 江苏省农业科学院科 研基 金( 编号 ： 6 1 1 0 7 5 8 ) 。 作者简介 ： 李莹( 1 9 8 l 一 ) ， 女 ， 硕士 ， 助理研究员 ， 主要从事食 品生 物技术研究。Em a i l ： h ij o l y 1 6 3 c o rn。 通讯作者 ： 周剑忠 ， 博士 ， 副研究 员。T e 1 ： ( 0 2 5) 8 4 3 9 1 5 7 1 。 型离心机( 上海安亭 ) 等。 1 3试验 方 法 1 3 1 米酒 的制作新鲜糯米洗净浸泡 2 0 h ， 常压 蒸 0 5 h ， 淋水冷却， 加入酒曲搅拌均匀， 于 3 0保 温发酵4 8 h后， 加水继续发酵至 5 d ， 将发酵液过 滤。取滤液 ， 于 4冰箱冷藏备用。 1 3 2 凝乳酶提取取一定量的米酒， 加入 3 倍体 积 的冷 乙醇 ， 边加 边搅 拌 ， 之后 于 4 静 置 1 h ， 5 0 0 0 r m i n离心 0 5 h 。将离心得 到的沉淀用 p H 值 6 0的磷酸缓冲液溶解， 即为粗酶液。 1 3 3 凝乳活性测定 凝乳活性测定采用 A r i m a法 ， 取 5 m l 1 0 0 g L的脱脂乳 ， 3 5 o C保温 5 m i n ， 加入 0 5 m l 经适当稀释的发酵液 ， 于旋 涡混合器充 分混合， 准确记录从加入酶液到乳凝固的时间( S ) 。 凝乳酶活性定义 ： 4 0 mi n凝 固 1 m l 1 0 0 g L脱脂乳 的酶量定义为 1 个酶活力单位( S o x h e lt U n i t ， S U ) 。 = 式 中： 卜一 凝乳时间( s ) ； D 一稀释倍数。 2 结果与分析 2 1 米 酒凝乳 酶 的最适 反 应温度 分别设 置选 取反 应温 度为 3 O、 4 0 、 5 0 、 6 0 、 6 5、 7 0 、 8 0 c C， 将脱脂 乳保温 5 m i n ， 然后加入相 同稀释 倍数的粗酶液 ， 测定凝 乳酶活力 ， 以最高 酶活性为 1 0 0 计 ， 结果见 图 1 。由图 1可 以看 出， 该曲线呈 现不对称型， 即低于最适温度， 曲线下降平缓； 高于 最适温度 ， 曲线下降较 陡。较高的反应温度对酶反 应有两方面的影响， 既加快反应速度， 又容易使酶热 失活。低于最适反应 温度 ， 加快反应速度 占主导地 一 7 2一 江苏农业科学2 0 0 8年第5期 位 ， 曲线下降平缓 ； 高于最适反应温度， 酶的热失活 占主导地位， 曲线下降较 陡。当温度在 3 0 6 0范 围时， 酶活力随着温度 的升高而增加 ； 当温度超过 6 0 q C时， 凝乳酶活性降低。由此可以确定凝乳酶最 佳反应温度约为 6 0 。 2 2米酒凝乳酶的最适反应 p H值 凝乳酶大多属于酸性蛋白酶 ， 又称天门冬氨酸 ， 这是由于这些酶类的活性中心部位有 2个天门冬氨 酸残基。酸性蛋白酶 的最适 p H值 在 1 5 5 0左 右 j 。分别将脱脂乳 的 p H值调到 4 0 、 4 5、 5 0 、 5 5、 6 0 、 6 5 、 7 0， 再加入稀 释倍数相 同的粗酶液 ， 测定凝乳酶活性 ， 以最高酶活性为 1 0 0 计 ， 结果见 图 2 。由图 2可知 ， p i t值越低 ， 凝乳 时间越短。p H 值在 6 0以上时， 其凝乳时间显著延长。因为随 p H 值的升高 ， 凝乳酶的活性下降 ， 不足以产生足够的副 K一酪蛋白胶束而使脱脂乳凝结。 一 、 掣 ! i g 龆 莨 一 一 ! 望 避 靛 O O 8 O 6 0 4 0 2 O O 0 2 0 4 0 6 0 8 0 温度 ( ) 图 1 米酒凝乳酶 的最适反应温度 p H值 图2 p H 值对米酒凝乳酶活性的影响 2 3米 酒凝 乳酶 的热稳 定性 取 5 ml 1 0 0异 L的脱脂乳 ， 3 5 o C保温 5 m i n ， 加 入经 3 0 6 0 c I = 处理 6 0 m i n的凝乳酶 ， 取 出后迅速 于冰水浴冷却， 然后测定残余酶活， 以最大酶活性计 为 1 0 0 ， 其他处理温度下的残余酶活性 与之 比较 ， 计算相对酶活性 ， 结果见图 3 。由图 3可知 ， 凝乳酶 在 4 5 的情况下处理 6 0 mi n ， 酶的活性都很稳定 ； 随着温度的升高 ， 在 5 5处理 6 0 m i n凝乳酶活性 丧失 3 3 7 ； 6 0处理 6 0 m i n酶活性仅存 1 5 。 2 4米 酒凝 乳酶 的酸碱 稳定性 取 5 ml 1 0 0 g L的脱脂乳 ， 3 5 保温 5 m i n ， 加 入经不同 p H值( 2 0 8 0 ) 处理 6 0 m i n的凝乳酶 ， 然后测定残余酶活 ， 以最大酶活性计为 1 0 0 ， 其他 处理 p H值下 的残余酶活力与之 比较 ， 计算相对酶 活性 ， 结果见图4 。由图4可知， 米酒凝乳酶具有较 强的酸稳定性 ， 酶活性在 p H值 3 0 7 0之间比较 稳定。当在 p H值 7 0的条件下处理 6 0 mi n时 ， 凝 乳酶活性仍在 5 0 以上； 当 p H值 8 0处理 6 0 m i n 时 ， 凝乳酶活性几乎丧失 ， 仅存 9 。 一 、 一 划 嫂 逡 莨 ， 一 越 娌 盛 霞 O 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 2 O 3 O 4O 5 0 6O 温度 ( ) 图3 米酒凝乳酶的热稳定性 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 O 2 5 C a离子 浓度 对米 酒凝乳酶 活性 影响 钙离子的添加可 以缩短凝乳时间， 增加凝乳 的 硬度。在 K一酪蛋白的酶促水解阶段不需要钙离子 的参与， 但添加钙离子 ， 通过钙离子与氢离子之间的 交换而降低了反应底物乳的 p H值 ， 间接增加 了酶 促反应的速率 。 取 5 ml 1 0 0 g L脱脂 乳， 分别加 入 0 1 、 0 2 、 0 4 、 0 6 、 0 8 、 1 0 g L的 C a C 1 2 ， 测定 C a n浓度对米 酒凝乳酶活性的影响( 图5 ) 。由图 5可见： 在 C a C I 质量浓度为 0 0 4 g L的范围内， 随着 c a n浓度的 提高 ， 米酒凝乳酶活性逐渐增大， 当 C a C 1 质量浓度 为0 4 0 6 L时， 米酒凝乳酶活性最高； C a C 1 质 量浓度继续增加时， 米酒凝乳酶活性逐渐下降， 凝乳 时添加 C a C 1 的最佳质量浓度约为 0 4 L 。 一 、 - 娌 避 莨 O O 8 O 6 0 4 0 2 0 0 0 2 04 0 6 0 8 1 0 C a C l 含量 ( g 几 ) 图5 Ca 2 浓度对凝乳酶酶活的影响 3 结 论 通过乙醇沉 淀法从米酒 中得到 的凝乳酶粗提 ( 下转第7 3页) 加O l 江苏农业科学2 0 0 8年第 5期 一7 3一 膜荚黄芪和蒙古黄芪的 R A P D指纹图谱分析研究 吴松权，朴炫春 ，吴基 日，全雪丽 ( 延边大学农学院， 吉林龙井 1 3 3 4 0 0 ) 摘要： 利用 R A P D标记对膜荚黄芪和蒙古黄芪进行了指纹图谱的研究。采用 B S A法从 1 0 0个 1 0碱基随机 引物筛选出7个在膜荚黄芪基因池和蒙古黄芪基因池中表现多态性的引物。单株检测表明， 引物 O P C 0 6具有膜 荚黄芪特异性， 在检测的膜荚黄芪个体中均能扩增出 1条 7 1 0 b p左右的特异带， 而在蒙古黄芪的单株 中未见扩 增特异带， 因此， 将该膜荚黄芪扩增特异性条带命名为 O P C 0 6- 7 10 。试验表明， 利用 R A P D标记可在分子水平上达 到快速、 准确、 可靠地鉴定膜荚黄芪和蒙古黄芪的目的。 关键词： 膜荚黄芪；蒙古黄芪；R A P D指纹图谱 。 中图分类号：s 5 6 7 2 文献标志码：A 文章编号： 1 0 0 21 3 0 2 ( 2 0 0 8 ) 0 5 0 0 7 3 0 2 正品黄芪 ( r a d i x a s t r a g a l i ) 是豆科( L e g u m i n o s a e ) 黄芪属 ( A s t r a g a l u s ) 植 物膜荚黄芪 A s t r a g a l u s m ,e m b r a n a c e u s( F i s c h )B g e 和 蒙 古 黄 芪 A s t r a g a l u s m e mb r a n a c e u s (F i s c h ) B g e v a r mo n g h o l i c u s ( B g e ) H s i a o 的干燥根 。二者的化学成分有差异导 致其药效不同， 二者在植 物形态特征和生物学特征 方面也有明显 区别 ， 但其根和种子外形 比较相近， 肉 眼难以区别 I 2 。因此 ， 近年来药材市场 上出现 了 两种黄芪根 和种子混杂现象 ， 扰乱 了中草药市场。 R A P D标记广泛应用于植物种质资源的鉴定与评价 等方面研究 J 。本研究拟应用 R A P D分子标记技 收稿 13期 ： 2 0 0 80 4一O 1 基金项 目： 吉林省科 技项 目( 编号 ： 2 0 0 4 0 5 5 3 ) 。 作者简介： 吴松权( 1 9 7 2 一) ， 男， 黑龙江鸡西人， 硕士， 副研究员， 主 要从事植物遗传育种研究。E m a i l ： a r s w s q y b u e d u c n 。 术构建膜荚黄芪和蒙古黄芪的指纹图谱， 为在分子 水平上快速、 准确、 可靠地鉴定膜荚黄芪和蒙古黄芪 提供技术支撑 。 1 材料与方法 1 1 供试材料 于 2 0 0 5年 6月在延边大学农 学院 中草药圃内 采集新鲜幼嫩的膜荚黄芪和蒙古黄芪植物叶片， 保 存在 一 7 5冰箱 中备用( 表 1 ) 。 1 2 方 法 1 2 1 R A P D分析采用吴松权等 方法。 1 2 2 膜荚黄芪和蒙古黄芪基因池的建立采用 B S A法 3 ， 将表 1中的 7个膜荚黄芪和 7个蒙古黄 芪个体 D N A分别等量混合 ， 分别组成膜荚黄芪基 因 池和蒙古黄芪基因池。 ( 上接 第 7 2页) 物， 其最适反应温度为6 0 c 【 = ， 但此温度条件下凝乳酶 的酶活稳定性较差 ， 处理 6 0 m i n酶活力仅存 1 5 。 因此， 在实际干酪生产过程中， 为了防止高温使乳清 蛋白变性 ， 凝乳温度一般控制在 4 0 5 O。p H值主 要影响凝乳酶活性 ， 从而影响凝乳反应最初阶段的反 应速度。凝乳酶属于酸性蛋白酶， 其最适反应 p H值 在 4 5 5左右 ， 在此范围内酶活具有较高的稳定性 ； 在乳中添加 0 4 g L的 C a C 1 ： ， 可间接增加酶促反应 速率 ， 缩短凝乳时间 ， 增加凝乳的硬度。 参考文献： 1 彭志英食品生物技术 M 北京： 中国轻工业出