耐盐乳酸菌的筛选和鉴定.pdf

广州食品工业科技 第三届益生菌益生元与健康研讨会专刊 Vol.20 增刊(总83) 1 文章篇号: 1 0 0 7 - 2 7 6 4 ( 2 0 0 4 ) 增刊- 0 0 0 1 - 0 1 耐盐乳酸菌的筛选和鉴定 郭迪 潘力 杨汝德 ( 华南理工大学生物科学与工程学院广州 5 1 0 6 4 0 ) 摘要 本实验从酱油厂提供的酱油原醅中分离筛选出耐盐乳酸菌,该菌在 18以上 NaCl浓度的条件下能够正常生长代谢初 步鉴定其为四联球菌属,可用于高盐稀醪酱油酿造目前国内尚无耐盐度达 18%的乳酸菌种, 该菌种的成功选育为国内首创 关键词乳酸菌耐盐筛选鉴定 Screening and Identification of the Salt-resistant Lactic Bacterium Guo DiPan LiYang Rude Biotechnology Department, South China University of Technology, Guangzhou 510640 Abstract: In the experiment, a salt-resistant lactic bacterium was screened and separated from the original sauce. The salt-resistant lactic bacterium is capable to metabolize as usual at a medium of 18 percent of salinity. The bacterium is preliminary identified as Tetragenococcus, that can be cultured during fermentation process in soy sauce. Keywords: Lactic bacteria; Salt-resistant; Screen; Identification 酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质 量和香味其工艺上需要在酱醅发酵过程中添加酵母 菌和乳酸菌 1 然而酱油的含盐度高达 18%这就需 要选育出耐盐菌种关于耐盐酵母的应用报道已有很 多而乳酸菌方面目前在国内菌种库内尚无耐盐度 达 18%的菌种我们作为酱油大国筛选出耐盐度达 18%的嗜盐乳酸菌的意义则显得十分重大 本实验主要对高盐稀态发酵工艺酱醅中嗜盐乳酸 菌进行分离筛选和鉴定 1 材料与方法 1.1 材料 酱醅由广东省食品进出口公司属下的福金香酱 油厂提供草酸铵结晶紫液革兰氏 A 液路哥尔 氏碘液 革兰氏 B液蕃红花红 沙黄生理盐水 1.2 仪器 XSP-3L 型显微镜上海精密BX51 型正置荧 光照相显微镜 日本 OLYMPUS超级应用型超纯水 器PURELAB PLUS美国 Pall CorporationOSD 反相碳 18 柱 BioPhotometer德国 Eppendorf Controller Pump德国 WatersPhotodiode Array Detector 德国 Waters电热恒温培养干燥两用箱 厦 门医疗 1.3 实验方法 1.3.1 分离筛选流程(如图 1) 图 1 分离筛选的流程图 1.3.2 筛选方法 十倍稀释法平板涂布法斜面之字划线法平 板四分法划线 1.3.3 鉴定方法 1.3.3.1 革兰氏染色法 2 1.3.3.2 过氧化氢酶接触酶测定 取一环琼脂斜面的培养物涂于干净载玻片上 然后加1 滴315H2O2若有气泡产生则为阳性反 应无气泡为阴性反应或将 315H2O2加到斜 面的菌苔上观察是否有气泡的产生 3 1.3.3.3 生化鉴定管使用方法 挑取待检菌革兰氏染色镜检将新鲜菌苔接种于 普通肉汤中 37培养 1824h 或用 0.85%无菌生理盐 水稀释至 5McFarland约 109cfu/ml各吸取 0.050.08ml约 12滴的肉汤培养物或菌悬液加入 每种微量生化管内 将已接种生化管套上无菌塑料帽 直立于三折吸塑短架内于3537培养箱中培养 1.3.3.4 高效液相色谱HPLC测量乳酸含量(图2) 富 集 鉴保 酱稀 释纯定 性 广州食品工业科技 第三届益生菌益生元与健康研讨会专刊 Vol.20 增刊(总83) 2 将测试样色谱图和同条件下标准样色谱图对比 观察相同保留时间下的乳酸特性吸收峰根据样品色 谱图中特性峰与标准样吸收峰的峰面积比求出样品中 的乳酸含量 C 1 8 反相柱柱温室温柱压1 5 0 0 p s i 流速:0.8ml/min,进样:20Ml,紫外检测波长:215nm 图 2 乳酸标准样高效液相色谱图H P L C 2 结果与讨论 2.1 耐盐乳酸菌的筛选 2.1.1 富集培养分离初筛(如图 3) 图 3 富集培养时 1 0 - 1平板的菌落形态 耐盐度能达 10以上的乳酸菌基本都在片球菌 属和四联球菌属这二个属内 3 而四联球菌的耐盐度 更高达18以上 所以我们分离筛选的目标在四联球 菌上四联球菌的菌落为乳白色成小圆点状显微 镜下观察菌体四联或成对极少成单这便是我们 初筛时的重要依据 用富集培养基取代分离培养基对酱油曲进行培 养在这样的条件下培养两天后平板上出现的菌落有 不少类似于乳酸菌将镜检为球菌的菌落挑出进行 液体培养然后从中筛选出具有四联形态的菌种 在挑出的 20 多个菌株中成功发现一株菌体形态 出现较多四联特征的菌株无论是菌落形态还是菌体 形态都与四联球菌非常相似对其进一步的研究 2.1.2 菌种的纯化复筛 将初筛菌种在含 1 5 % N a C l 浓度的液体培养基中培 养在培养过程中定期镜检观察菌种的生长状况 生长 4 天后, 进行平板涂布 之字形划线以及平板 四分法划线分离然后从经培养后的平板和斜面上挑 出镜检为四联球菌特征的菌落继续培养 如此反复直到确定其为单一菌株为止最后在 O L Y M P U S B X 5 1型正置照相显微镜下的观察如图 4所 示对菌种进行保藏 图 4 显微镜下照片 2.1.3 菌株的耐盐度及产酸情况 紧接着进行菌种耐盐度的测试该实验以液体培 养进行取 121820三个 NaCl 浓度进行测 试 连续七天检测其OD600值最后再以 HPLC 检测 样品的乳酸含量实验数据如图 5 2 . 7 2 1 . 5 4 4 1 . 4 8 1 0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 3 02468 天数 O D6 0 0值 12%NaCl浓度18%NaCl浓度20%NaCl浓度 图 5 三种盐浓度下菌种生长的情况 由图 5 可见该菌在三种 NaCl 浓度下都有一定 程度的生长其中以12NaCl浓度的生长情况最好 这说明了该菌虽然能够耐 20%的 NaCl 浓度但在低 盐度下更容易生长 乳酸是酱油酿造过程中重要的利用物质本实验 minites 广州食品工业科技 第三届益生菌益生元与健康研讨会专刊 Vol.20 增刊(总83) 3 对培养七天后的样品做了高效液相色谱HPLC来 检测其乳酸含量 其中盐浓度为 18%的 HPLC 图谱如 图 7所示 各盐度下检测乳酸含量情况如下图6所示 0 . 0 1 8 0 . 0 1 9 0 . 0 2 0 . 0 2 1 0 . 0 2 2 0 . 0 2 3 0 . 0 2 4 1 2 %1 8 %2 0 % 样品盐浓度 乳酸含量g / m l 图 6 不同盐度下筛选菌产乳酸含量 由图6可见各盐度下该菌都产生了一定量的乳 酸且乳酸含量相差并不大 图 7 1 8 % N a C l 浓度的样品 H P L C 图谱 以上盐度测试和乳酸含量的检测都说明该菌在高 盐度的条件下是能够生长的并能维持其正常的生长 代谢 2.2 耐盐乳酸菌的鉴定 2.2.1 菌落形态 待鉴定菌的菌落形态如右图中的平板所示成乳 白色油脂状在 30pH7.0的液体培养基和琼 脂平板或斜面上均能正常生长 2.2.2 革兰氏染色和过氧化氢酶测定 对所筛菌种做革兰氏染色成阳性反应利用电 子显微镜对菌种拍照如图 9图 10 图 9 电镜照片 从图 10可以看到实验所筛选出的菌种是球形 细胞四联或成对基于以上情况可初步认定该菌属 于革兰氏阳性兼性厌氧球菌并且接触酶鉴定结果为 阴性 现可以把菌种的范围进一步缩小在片球菌属和气 球菌属内 2.2.3 pH值对待鉴定菌种生长的影响 在片球菌与气球菌的鉴别上 pH值是一个重要的 区分因素 片球菌在pH5下能生长 而气球菌则不能 在 pH9.0 的情况则正好相反 本实验分别做了液体培养基初始 pH4.5 和 9.0 下的生长情况记录 图 8 筛选菌的菌落形态 图 1 0 电镜照片( 局部) 广州食品工业科技 第三届益生菌益生元与健康研讨会专刊 Vol.20 增刊(总83) 4 表 1 初始 p H = 4 . 5 时的生长记录 培养时间 初始培养基 pH4.5时OD600记录 1天 0.356 2天 0.401 3天 0.418 表 2 初始 p H = 9 . 0 时的生长记录 培养时间 初始培养基 pH9.0时OD600记录 1天 0.361 4天 1.108 6天 1.980 乳酸菌在其生长过程中会产生乳酸醋酸等有机 酸 从而降低培养基的 pH值 而当pH值降低到一定 程度后又会反过来抑制乳酸菌的生长 5 从表 2 可 看到在培养基初始 pH4.5 的情况下该菌种还能生 长但从第二天开始生长则变得比较缓慢所以 可得出结论待鉴定菌是可以在pH5.0下生长的 由于没能找到能有效维持液体培养基pH值在9.0 的缓冲溶液所以即使初始pH为 9.0但伴随着极 少数乳酸菌的生长代谢溶液 pH 值也将不断下降 从而使其逐渐变得适合该菌生长所以初始 pH9.0 的这组生长记录数据不能取用但我们可以从表中看 到从第四天到第六天OD600值有很大的提高验证 了前面培养基会逐渐变得适合菌种生长的推断 基于以上数据我们判断待鉴定菌为片球菌属 2.2.4 耐盐特性研究 片球菌属原包括 8 个种分别为有害片球菌 P.damnosus小片球菌P .parvulus意外片球菌 P .inopinatus糊精片球菌P .dextrinicus戊糖片 球菌P.pentosaceus乳酸片球菌P .acidilactici 嗜盐片球菌 P .halohilus马尿片球菌 P .urinaeequi 10耐盐性较好的就只有嗜盐片球菌和戊糖片球菌两 个种 6 然而兼性厌氧不耐酸的嗜盐片球菌在近几年中 根据 16SrRNA 序列的区别已重新分置于一新属 四联球菌属Tetragenococcus内它与片球菌的主 要区别见表 3 根据乳酸细菌的分属检索表格 3 中所描述 细胞 呈现球形且兼性厌氧细胞四联成对或链状时如 果不能生长于 18NaCl 中则属于片球菌属如果 能生长于18NaCl中 从葡萄糖主要产 L + 乳酸 则属于四联球菌属 在 2.1.3 中 我们已经从实验上论证了我们所筛选 出的菌株在 18%或更高的 NaCl 浓度中能够正常生长 代谢 基于以上内容描述和图片对照我们推断所筛选 出的菌种属于四联球菌属而近几年的研究表明四 联球菌属的大多数性质类似于原片球菌属但在某些 性质上则与气球菌更为相近这就不难解释表 2中的 生长情况了 图 1 1 戊糖片球菌 图 1 2 筛选菌( 未染色) 2.2.5 单一碳源利用实验 目前已报到的四联球菌属有2 个种嗜盐四 联球菌和盐水四联球菌这两个种都是从鱼沙司里分 离出来的他们的鉴别特征见下表 表 3 嗜盐四联球菌和盐水四联球菌的鉴别特征表 3 特征 嗜盐四联球菌 (T.halophilus) 盐水四联球菌 (T.muriaticus) 实验结 果 生长于 40?* 产酸自:L-阿拉伯糖 蔗糖 甘露醇 * 盐水四联球菌4 0 生长 4 5 不长 最适2 5 3 0嗜盐 四联球菌4 0 不长 最适温度3 0 3 5号表示9 0 % 显阳性 号表示 9 0 % 显阴性 实验结果与鉴别特征表所列的两种菌都有所出 入一方面是因为鉴定管的性质比较敏感环境的变 化也将对其产生影响另一方面与是一种实验 几率90%并不是必然发生的特性此外也不排 除人为操作失误导致染菌的可能甚至筛选出新菌株 的可能性也不是没有所以单从这些的结果上无法 对其做十分明确的归类 ( 下转第 1 4 页) 广州食品工业科技 第三届益生菌益生元与健康研讨会专刊 Vol.20 增刊(总83) 14 保持酸奶稳定性(如乳清析出)具有重要作用 因而添加 酪蛋白水解物能赋予酸奶更丰厚的口感改善酸奶质 地并提高稳定性 蛋白质种类和含量 脂肪含量是决定酸奶质构的重 要物质基础7从图7可以看出添加2%酪蛋白水解物 对酸奶的质构有一定影响但二者差异不是很大因 为在较小的添加量下酸奶的蛋白含量和组成并没有 太大改变脂肪含量也基本保持恒定因而质构没有 太大变化 3 结论 3.1 酪蛋白水解物具有明显促进酸奶发酵的作用 随 水解物添加量增加促进发酵程度提高1.5%2.0% 添加量的水解物对酸奶的促发酵效果接近 3.2 添加酪蛋白水解物改变了酸奶发酵过程中的 pH 下降速度 添加样在发酵前4h的 pH下降速度高于空 白样而发酵 4h后空白样的pH下降速度略快发酵 中期二者的 pH下降速度存在最大差距 3.3 不同水解程度的酪蛋白水解物 在对酸奶的促发 酵程度上 表现出随水解程度增加 促发酵程度提高 除 2h 水解物的促发酵程度较小外8h12h和 24h 三种水解物的促发酵能力基本相当 三者的凝乳时间 产酸速度发酵时间都接近 3.4 二者的质构比较表明添加 2%酪蛋白水解物对酸 奶的质构有所改善赋予酸奶更丰厚的口感改善酸 奶质地并提高稳定性 参考文献 1 顾瑞霞 谢继志编著.乳酸菌与人体保健 M.北京.科学出 版社19951-5 2 张蓉真等.大豆水解蛋白对乳酸菌增殖促进作用.中国粮油 学报199712640-43 3 赵新淮等.大豆蛋白水解物的乳酸发酵促进作用.东北农业 大学学报199829(1)102-104 4 李科德等.猴头菇抽提物对乳酸菌生长的影响.微生物学杂 志200020234-35 5 潘思轶等.酶解大豆蛋白对酸奶发酵酸度及流变特性的影 响研究.食品科学2003248 6 王芳等.菇浸提液对乳酸菌生长的作用.山西农业大学学 报20022159-161 7 Effect of milk supplementation and culture composition on acidification, textural properties and microbiological stability of fermented milks containing probiotic bacteria. International Dairy Journal. 11(2001)935-942 8 Dave, R.I., & Shah ,N.P.(1998).Ingredient supplementation effects on viability of probiotic bacteria in yogurt. Journal of Dairy Science 8111280