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D -核糖发酵过程参数的研究与控制 高淑红, 邱蔚然 ( 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海, 200237) 摘 要 以7L 自控发酵罐进行D -核糖发酵实验, 对D -核糖发酵过程参数进行优化, 发现对数生长后期接种, 溶氧控制在 40%左右, 以葡萄糖酸补料并调节 pH 值在 7. 2 左右, 可使罐的发酵单位由 45g/ L 提高至 65g/ L 左右。 关键词: D -核糖; 枯草芽孢杆菌; 发酵 作者简介: 高淑红( 1975) , 女, 硕士。 通讯作者: 邱蔚然。 发酵法生产 D -核糖国内外已有许多报 道, 但多数是关于菌种选育及小试摇瓶培养 报道。D -核糖发酵过程控制, 除 D. Wulf1 的文章外, 几乎很少报道。 本实验室通过选育枯 草芽孢杆菌的 T KT 缺陷型突变株, 获得了 D -核糖的高产 菌株, 并进行了培养基的优化2。本文在此 基础上, 对 D -核糖的发酵过程参数进行研 究, 进一步提高了 D -核糖的产量, 使罐的发 酵单位从 45g/ L 提高至 65g/ L。 1 材料与方法 1. 1 菌种 枯草芽孢杆菌莽草酸缺陷型突变株 D - 202, 本实验室保藏菌种。 1. 2 培养基 种子培养基( g/ L) : 山梨醇 20. 0, 玉米 浆 22. 0, 磷酸氢二钾 3. 0, 磷酸二氢钾 1. 0, pH 7. 0 7. 2。 发酵培养基 ( g/ L) : D -葡萄糖 60. 0, 葡 萄糖酸钙 60. 0, 玉米浆 22. 0, 硫酸锰 0. 5, 硫 酸铵 5. 0, pH 7. 0 7. 2。 斜面培养基( g/ L) : D -葡萄糖 10. 0, 牛 肉膏10. 0, 酵母膏5. 0, 蛋白胨10. 0, NaCl 5. 0, pH 7. 0 7. 2。 1. 3 分析方法 菌浓度的测定: 稀释 10 倍后于 660nm 处测光吸收值 A; 葡萄糖的测定: 葡萄糖试剂盒测定法( 卫 生部上海生物制品研究所) ; D -核糖的测定: 苔黑酚法3。 2 结果与讨论 2. 1 种子的培养 2. 1. 1 种子生长曲线 首先对菌种的种子生长情况进行研究。 实验于 34e , 250r/ min 培养一级种子, 于不 同时间测定种液的 A660 和 pH 值, 以此作出 生长曲线如图 1 所示。 图 1 种子生长曲线 由图 1 可以看出, 菌体在 0 8h 处于迟 滞期, 菌浓基本没有变化。该菌株迟滞期较 )19) 第 30 卷 第 4 期 2000 年 12 月 工 业 微 生 物 Industrial Microbiology Vol.30 No. 4 Dec. 2000 长, 这体现出营养缺陷型菌株的特征。至 10h 后, 菌体进入对数生长期, pH 开始下降。 至18 20h 后, 达到稳定期, pH 基本在 6. 0 左右。此后, 菌体绝对生长量无太大变化。 至生长后期, 菌体量有所下降, 表现为菌体自 溶, pH 迅速升高。 2. 1. 2 种龄对 D -核糖发酵的影响 文献报道, 发酵时接入对数生长期种龄 的种子较好, 尤以对数生长后期最佳。因此, 实验分别选取对数生长前期, 中期, 后期和末 期种龄的种子接种, 对比不同种龄对 D -核糖 生产的影响。实验结果示于表 1 中。 表 1 种龄对 D -核糖发酵的影响 种龄菌浓pHD -核糖( g/ L) 前期( 13h)0. 326. 528. 5 中期( 14h)0. 546. 540. 8 后期( 18h)0. 786. 545. 6 末期( 22h)0. 807. 044. 8 由表 1 中数据可知, 对数生长前期接种, D -核糖产量较低。而对数生长中期接种, D - 核糖产量提高, 但仍没有达到最佳接种种龄。 进入对数生长后期以后接种, D -核糖的产量 最高。这与文献报道相符。因此, 发酵时取 对数生长后期种龄的种子接种最佳。 2. 2 发酵过程的控制 2. 2. 1 pH 值的控制 实验用 7L 自控发酵罐进行发酵试验, 装料 5L, 起始 pH7. 5( 灭菌前) , 接种量 5% , 通风 1vvm, 搅拌转速 450r/ min, 37e 发酵 3d, 其发酵过程曲线如图 2 所示。由图中可 以看出, 发酵前期菌体大量生成, pH 迅速升 高, D -核糖开始积累, 且 12h 后开始迅速生 成。此时 D -葡萄糖的消耗速度也快。但至 24h 后, pH 升至很高值( 7. 7) , 过高的 pH 影 响了菌体的生长, 致使菌体过早自溶, 发酵提 前结束( 48h 左右) 。因此, 在发酵过程中需 对 pH 加以控制, 以使菌体在最佳 pH 值范围 内生长发酵。 图 2 自然 pH 值时发酵过程曲线 实验选取 7. 0 和 7. 2 两个水平对发酵过 程进行控制( 以 1 mol/ L HNO3调节 pH) 。 实验结果示于图 3。 比较 pH 在 7. 0 和 7. 2 时的情况, 可发 现 pH 控制在 7. 0 时, 葡萄糖的利用率低, 虽 然发酵前期 D -核糖的生产速度较快, 但发酵 图 3 pH 值控制 7. 0 和 7. 2 时发酵过程曲线 )20) 第 4 期工 业 微 生 物第 30 卷 图 4 不同酸调节 pH 值 后期 D -核糖积累速度缓慢, 且略有下降。当 pH 控制在 7. 2 时, 葡萄糖的利用率高, 且有 利于菌体内 D -核糖生产酶系的合成或保持 酶系的最大活力, D -核糖的产量高1。 控制 pH 在 7. 2, 用不同的酸进行调节。 结果如图 3 和图 4, 其中图 3b, 图 4a 和图 4b 分别用HNO3,HCl 和葡萄糖酸调节 pH。 由上述数据可知, 调节 pH, 以葡萄糖酸 效果最好。这是因为, 葡萄糖酸一方面作为 pH 调节剂, 使发酵液的 pH 维持稳定, 有利 于菌体的正常生长与发酵。另一方面, 葡萄 糖酸作为前体, 使 D -核糖的产量明显提高。 因此 D -核糖发酵可以考虑葡萄糖酸补料。 但由于葡萄糖酸抑制菌体的生长, 因此其浓 度不宜过高, 采用连续补料方式补充葡萄糖 酸, 既可解除葡萄糖酸的抑制, 又可补充生产 D -核糖的前体。该数据还表明, 发酵配方中 的氮源已能满足发酵的要求。因此, 发酵过 程中不必补充氮源。 2. 2. 2 过程溶氧的控制 按照 D -核糖发酵的原理可知, D -核糖属 需氧发酵。在需氧发酵中溶氧是重要的控制 参数。对于 D -核糖发酵来讲, 过程中溶氧需 维持在何种水平, 需用实验加以确定。 实验用转速及通风量调节发酵过程中溶 氧的水平, 使溶氧分别维持在 20% , 40%, 70% 左右。实验结果如图 5 所示。 图 5 溶氧对 D -核糖产量的影响 由图 5 可看出, D -核糖发酵属中等程度 的好氧发酵, 溶氧过高或过低都不利于 D -核 糖的生产。分析其原因: 溶氧过低, 限制了枯 草芽孢杆菌的正常生长, 不利于菌体发酵。 加大通气量, 提高溶氧, 提高戊糖磷酸途径氧 化支路的代谢流从而使 D -核糖产量提高。 但当溶氧过高时, 由于转速过高, 通风量大, 这些可能对菌体的生长不利, 故而溶氧过高 或过低均不利于 D -核糖的生产。 按照上述选定的操作参数发酵试验。试 验结果示于图 6。 由图 6 可以看出, 发酵前期耗氧量大, 16h 后溶氧可降至 20% 左右。这是因为发酵 前期菌体迅速生长, 氧气的供给速度小于耗 氧速度。进入对数生长期以后, 溶氧基本在 30% 40%之间, 表现为供氧与需氧之间的 )21) 第 4 期高淑红, 等. D -核糖发酵过程参数的研究与控制第 30 卷 图 6 发酵过程曲线( 37e 培养, 通风 1vvm, 转速 450r/ min) 平衡。发酵 40h 以后, 由于葡萄糖酸的利用 速度降低, 对氧的利用也随之降低。表现为 后期溶氧又有回升趋势。至发酵末期, 对氧 的消耗已经不大, 最终回升至 80%左右。 通过观测发酵过程溶氧, 可以掌握发酵 各个阶段的需氧情况, 了解菌体生长代谢是 否正常, 并在生产过程中加以控制, 以期获得 良好的发酵结果。 3 结 论 通过研究枯草芽孢杆菌 D -202 的接种种 龄, 发酵过程 pH 及溶氧对 D -核糖发酵的影 响, 可以得出如下结论: 接种种龄以对数生长后期较好。对 数生长后期接种时 D -核糖产量比对数生长 前期接种提高近 40% 。 发酵过程中应对 pH 加以控制, 考虑 到菌体的生长及保持最大的葡萄糖酸激酶活 力, pH 最好控制在 7. 2左右。 D -核糖发酵属中等程度的好氧发酵, 溶氧过高或过低, 均对 D -核糖发酵不利。发 酵过程中溶氧最好控制在 40% 左右, 搅拌转 速 450r/ min, 通风 1vvm。 在发酵过程中对 pH, 溶氧进行了控 制, 并用葡萄糖酸调节 pH 和补料, 可使 D -核 糖的罐产量由 45g/ L 提高至 65g/ L, 产量提 高 30% 左右。 参考文献 1 De Wulf P, Vandamme E J. Production of D- riboseby fermentation.Appl.Micro.Biotechnol. , 1997,48: 141 148. 2 De Wulf P, Vandamme E J. Specific organic acids enhance the D- ribose productivity of a transketolase- defective Bacillus subtilis strain.J. Chem. Technol. Biotechnol. , 1997, 70: 311 315 3 高淑红, 邱蔚然, 丁庆豹等. D- 核糖产生菌的选育 及其发酵的研究. 华东理工大学学报, 2000, 26( 1) : 37 40 4 Miller G. L, Golder R. H, Miller E. E, Determination of Pentoses, Analy. Chem. , 1951, 23( 6) : 903 905 Study and control of the parameters in the D -ribose fermentation GAO Shu -hong, QIU We- i ran ( State Key Laboratory of Bioreactor Engineering ECUST, Shanghai, China 200237) Abstract Using a 7 -liter sel- f controlled fermentator, the effects of the main parameters such as inoculation, pH, and dissolved oxygen on the fermentation of D -ribose by Bacillussubtilis D -202 were studied.The results indicated that by controlling pos- t exponentially phase inoculum, gluco