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中国卫生检验杂志 2 0 0 6年 l 2月 第 l 6卷 第 l 2期C h i n e s e J o u rna l o f H e a l t h L a b o r a t o r y T e c h n o l o g y , D ec 2 0 0 6; V o l 1 6 N o 1 2 1 4 5 3 气相色 谱测定 甜蜜 素改良 方 法的 研究 余涛, 叶 坚 ( 广东省肇庆市疾病预防控制中心, 广东肇庆5 2 6 0 2 0 ) 【 化学测定方法】 摘要】 目的: 探讨气相色谱测定甜蜜素的改良方法。方法: 利用正庚烷作为提取液, 并对衍生化反应进行改进, 避免使 用冰浴 , 样品最后于气相色谱仪进行分析定量。结果: 甜蜜素含量在 0 5 0 m g 1 0 m l 范围内, 标准曲线线性关系良好 , r = 0 9 9 9 5 ; T y 法的相对标准偏差为 2 1 一 6 1 ; 样品的加标回收率为 9 1 9 一1 0 3 6 ; 检测结果与国标方法比较无显 著性差异( P 0 0 5 ) 。结论: 本方法采用低毒的正庚烷作为提取液, 并对衍生化反应进行改进, 不但快速、 简便, 满足检测 要求 , 并且对保障实验操作人员的身体健康有积极的作用。 关键词】 甜蜜素; 色谱法; 气相 色谱 中图分类号】 0 6 5 7 7 1 文献标识码】 A 文章编号】 1 0 0 4 8 6 8 5 ( 2 0 0 6 ) 1 21 4 5 30 2 甜蜜素是一种被广泛使用的人工合成甜味剂, 国家规定 使用最高限值为 0 6 5 8 0 g k g , 是各地食品监督监测机构经 常性检测项 目。现行国家标准检验方法 G B T 5 0 0 9 9 72 0 0 3 中第一法 一 气相色谱法是采用正己烷作为提取液 , 也有文献 报道采用四氯化碳、 二硫化碳 作为提取液。但以上几种 提取液均有较强毒性, 正己烷、 四氯化碳、 二硫化碳职业接触 限值分别为 1 8 0 、 2 5 、 1 0 m g m _j 【 , 在实验过程中不免对实验操 作人员存在较大的毒害。也有文献报道采用顶空法, 顶空法 虽然避免了使用有机溶剂, 但是操作繁琐 , 且需要特定顶空设 备。本文则采用正庚烷作为提取液, 并对衍生化反应进行改 进, 简化操作步骤 , 避免使用冰浴。正庚烷职业接触限值为 1 00 0 mg m 3 j ,其毒性远 比正已烷、 四氯化碳、 二硫化碳低, 对保障实验操作人员的身体健康有积极的作用, 而且精密度、 回收率均符合分析要求, 现报告如下: 1 材料与方法 1 1 仪 器与试 剂 岛津 G C一1 7 A气相色谱仪( 具 F I D检测器) ; 迷你振荡 器 ; 甜蜜素标准( 纯度为 9 9 5 ) ; 亚硝酸钠为分析纯; 氯化 钠为分析纯 ; 硫酸为优级纯; 衍生化试剂为 5 0 L亚硝酸钠、 1 0 0 g L硫酸 。 1 2色谱条件 A c一1 非极性毛细管柱( 3 0 m0 3 2 r tl i n 0 2 5 ) ; 汽 化室 2 5 0 C; 柱 温 8 0 C; 检测 器 2 8 0 C; 柱 流量 2 5 m l m i n ; 空 气 5 0 k p a ; 氢气 6 0 k p a ; 分流进样、 分流比1 : 2 0 ; 进样量 1 。 1 3标准曲线制备 精密称取甜蜜素标准品 1 0 0 0 g于 1 0 0 m l容量瓶中, 加 水定容至刻度, 摇匀, 制成 1 0 0 m g m l甜蜜素标准溶液。准 确吸取0 、 1 0 0 、 2 0 0 、 3 0 0、 4 0 0 、 5 0 0 m l 甜蜜素标准溶液于 1 0 0 m l 比色管中, 加水至 2 0 , 加 5 m l 1 0 0 g L硫酸 , 然后先 准确加入 1 0 II I l 正庚烷, 再加5盯 d 5 0 L亚硝酸钠, 室温下放 置 3 0 m i n并经常振摇, 最后加 5 g氯化钠摇匀, 于振荡器摇匀 作者简介 余涛( 1 9 7 6一) , 男, 本科, 主管技师, 主要从事理化 检验工作。 1 mi n , 待静止分层后吸出正庚烷层离心分离 , 于气相色谱仪进 样 1 , 每个浓度进样 6次, 以峰面积对应标准浓度绘制标准 曲线。 1 4样 品测 定 称取 2 0 0 g饮料于 1 0 0 m l比色管中, 固体样品蜜饯则取 2 0 0 g研磨均匀的样品于 1 0 0 m l 容量瓶中加水定容后并经常 振摇 , 两小时后过滤 , 准确 吸取 2 0 0 m l 滤液于 1 0 0 m l比色管 中, 以下操作同标准曲线, 最后进样 1 , 以保留时间定性 , 峰 面积定 量。 2 结果与讨论 2 1 提取液的改进 目前国标方法提取液为正己烷, 也有文献报道采用四氯 化碳、 二硫化碳作为提取液。但是以上几种提取液不但毒性 较强, 而且沸点都偏低 , 正已烷、 四氯化碳、 二硫化碳的沸点分 别为 6 8 7 、 7 6 8 、 4 6 3 C, 在实验过程中容易挥发损失, 造 成检测结果偏离。从保障实验操作人员身体健康的角度考 虑, 正庚烷的化学性质与正己烷相近, 而毒性远比正己烷低 , 而且沸点为 9 8 4 C, 挥发性小 , 因此本文采用正庚烷作为提取 液进行测定 , 且取得 良好的效果 。 2 2衍生化反应的改进 国标方法衍生化反应采用冰浴, 样品进行衍生化反应后, 低沸点衍生物环己醇亚硝酸酯必须稳定在冰浴中, 然后再用 提取液提取, 样品的衍生化过程相对繁琐。本文则对衍生化 反应过程 中试剂的加入顺序进行改进 , 先加入 5 m l 1 0 0 g L 硫酸, 再加入 1 0 I n l 提取液正庚烷封着液面, 最后才加入 5 m l 5 0 g L亚硝酸钠, 然后室温中进行衍生化反应。通过提前加 入提取液既可以有效地使容易挥发的衍生物环己醇亚硝酸酯 溶解于正庚烷中而避免损失, 也同时避免使用冰浴。 2 3色谱条件的选择 本文分别采用 A C一1非极性毛细管柱、 A C一5弱极性毛 细管柱进行测定。在 A C一1 非极性毛细管柱 , 柱温 8 0 C的条 件下, 峰形尖锐良好, 含酒精类饮料 中常见干扰物质如乙醇、 异丁醇 、 异戊醇等均未造成干扰。 同时考虑到正庚烷的沸点 ( 下转第 1 4 8 7页) 维普资讯 中国卫生检验杂志 2 0 0 6年 1 2月 第 1 6 卷 第 1 2期C h i n e s e J o u r n a l o f H e a l t h L a b o r a t o r y T e c h n o l o g y , D e c 2 0 0 6 ; V o l 1 6 N o 1 2 1 4 8 7 检出的菌株经嘉兴市疾病预防控制中心 鉴定: 6 2 8号、 7 3 2 号、 9 7 3号 、 9 7 6号为 Ol 群霍乱弧菌稻叶型 1 6 2 9号为 O l群霍 乱弧菌小川型, l 1 0 4号 、 1 6 8 2号为 O 1 3 9群霍乱弧菌。 2 2 3 药敏试验检出的6 2 8号、 7 3 2号、 9 7 3号、 9 7 6号、 1 6 2 9 号 O 1群霍乱弧菌对庆大霉素、 新霉素、 诺氟沙星、 环丙沙星、 氯霉素、 J 。 胺卡那、 卡那霉素、 先锋噻肟、 强力霉素、 弧菌抑制 剂 O 1 2 9 ( 1 0 p - g或 1 5 0 p - g ) 敏感 , 对红霉素 、 多粘菌素 B 、 复方 新诺明中度敏感, 对磺胺 甲基异 口恶唑、 链霉素、 乙酰螺旋霉 素、 痢特灵耐药; l 1 04 号、 1 6 8 2号 O 1 3 9群霍乱弧菌对庆大霉 素、 新霉索 、 诺氟沙星、 环丙沙星、 氯霉素 、 先锋噻肟、 强力霉素 敏感, 对红霉素 、 丁胺卡那、 卡那霉素中度敏感 , 对磺胺 甲基异 口恶唑、 链霉素、 多粘菌素 B 、 乙酰螺旋霉素、 复方新诺明、 痢特 灵均为耐药。对 O 1 2 9 ( 1 O g或 1 5 0 P -g ) 呈抗性。 3 讨论 2 0 0 5年从 3 0 8 4例肠道门诊腹泻病人中分离出 7株霍乱 弧菌, 检出率为 0 2 3 , 其中4株为 O 1群霍乱弧菌稻叶型, 1 株为 0 l 群霍乱弧菌小川型, 2株为 Ol 3 9群霍乱弧菌, 在培养 特性及生化反应上各菌株非常相似, 需依靠血清凝集试验及 O 1 2 9弧菌抑制剂敏感试验加以鉴别。所以提醒我们检验工 作者在分离培养、 生化反应、 血清学鉴定时, 要认真仔细 防止 漏报、 错报, 为霍乱疫情检测提供正确可靠的科学依据。 药敏试验结果检出的5株 O l群霍乱弧菌和2株 O 1 3 9群 霍乱弧菌对庆大霉素、 新霉素、 诺氟沙星、 环丙沙星、 氯霉素、 先锋噻肟、 强力霉素、 强 力霉素敏感, 可为我们在 医疗工作中 选择治疗霍乱病人的药物提供指导作用。 7株检出菌株有 0 1群稻叶型、 O1 群小川型及 O1 3 9群霍 乱弧菌, 病人分布在 4个乡镇 发现最早病例时间为9月 l 7 日, 最后一例病例为 l O月 1 1口, 说明本县能引起人类腹泻的 霍乱弧菌呈现多样性 , 分布 比较广泛, 为散发性, 且有季节性。 霍乱的流行性和季节性取决于产毒素霍乱弧菌在水体不同的 微生物环境的活存情况 。霍乱弧菌如何在全球传播以及在 疫区霍乱季节性流行高峰的原因等尚不清楚 I 。鉴于本县霍 乱菌株的检出情况, 须高度重视霍乱流行病学监测 , 从 2 0 0 6 年 开始 , 将定期对海产品、 水产品及水体等环境进行霍乱弧菌检 测, 县级医院及有关乡镇卫生院将常年开设肠道门诊 对病人 有泻必检。总之, 控制霍乱的流行, 一定 要本着早发现, 早治 疗及早采取预防措施的原则, 将疫情控制在萌芽状态 参考文献 1 俞树荣 微生物学和微生物学检验 M 第2版 北京: 人民卫生 出版社 , 2 0 0 1 2 0 2 2 周祖术, 何浙生 霍乱弧菌的生态学及其检测 J 国外医学 一 流 行病学传染病学分册 , 2 0 0 5 , 3 2 ( 3 ) : 1 8 81 8 9 ( 收稿 日期 : 2 0 0 6 0 41 9) ( 上接第 1 4 5 3页) 为 9 8 4 C, 相对比较高, 为了保证进样液能够在短时间内全部 气化, 气化室的温度设定为 2 5 0 2 2 。 2 4 线性 范围与检 出限 本方法在甜蜜素含量0 5 0 m g 1 0 m l 范围内线性关系良 好, 相关系数 r =0 9 9 9 5 。以噪声的 3倍计算, 最低检 出量为 1 g , 按 液 体 样 品 取 样 2 0 0 g计 算 , 最 低 检 出浓 度 为 0 0 5 m g k g , 固体样 品取 样 4 0 g计算, 最 低 检 出浓度 为 0 2 5 mg k g 。 2 5 精密度与准确度 取蜜饯类固体样品和饮料类液体样品两种具有代表性的 样品各 5份, 按本文方法进行 6次测定, 计算 R S D值。并在两 种样品中分别加入 1 0 0 m g甜蜜素标准进行 6次测定 , 计算 加标回收率。试验结果表明 R S D为 2 1 一6 1 , 回收率为 9 1 9 1 0 3 6 , 结果见表 1 。 表 1 方 法的精密度与 回收率试验 ( n= 6) 2 6 检 测结果比对 分别用本法和国标方法测定样品中甜蜜素 , 测定结果 见 表 2 。根据配对数据 t 检验 , t =0 6 1 3 t 0 ” ;2 3 6 5 , t O 0 5 两种方法检测结果并无显著性差异。 表 2本法与国标方法检测结 果比对 3 小 结 本方法通过对衍生化反应的改进, 具有操作快速、 简便 、 精密度

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