山茱萸籽总黄酮的响应曲面法优化微波辅助提取工艺的研究.pdf

Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术 2012年第7期 山茱萸 （Cornus officinalis Sieb. et Zucc. ） 为山茱 萸科落叶灌木或小乔木， 是一种常用的名贵中草药。 山茱萸性味酸、 涩、 微温， 归肝肾经， 具补益肝肾、 涩 精固脱之功效1。目前， 对山茱萸果肉的化学成分已 有较多研究， 发现山茱萸肉中含有环烯醚萜苷、 有机 酸、 鞣质以及维生素、 氨基酸和挥发油等多种药用及 营养保健成分2-4； 但对山茱萸籽的相关研究报道较 少。黄酮类化合物具有止咳、 平喘、 祛痰、 抗炎、 调节 免疫、 抗衰老及保护心血管的作用5-6。目前， 黄酮类 化合物的提取方法主要有溶剂提取法、 微波提取法、 超声波提取法、 酶解法、超临界流体萃取法、 双水相 萃取分离法和半仿生提取法等。微波辅助提取法具 有选择性高、 提取时间短、 易挥发性成分的提取率高 以及不需要特殊分离步骤等优点7， 但尚未见到山茱 萸籽总黄酮微波辅助提取的研究报道。本实验采用 响应曲面优化法 （RSM ） 对微波辅助提取山茱萸籽总 黄酮的工艺条件进行了研究， 同时以芦丁为对照品， 采用紫外-分光光度法对山茱萸籽总黄酮的含量进 行测定，旨在为开发利用山茱萸籽这一丰富的天然 药物资源提供参考依据。 1材料与方法 1.1材料与仪器 山茱萸果核购于西安百姓大药房，水分含量 刘瑞林，詹汉英，张志琪* （药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西师范大学化学化工学院，陕西西安710062） 摘要：目的：利用微波辅助提取技术对山茱萸籽总黄酮的提取工艺进行研究。 方法：以芦丁为对照品，采用紫外-分 光光度法测定山茱萸籽中总黄酮的含量，以总黄酮含量为考察指标，采用响应曲面优化法（RSM）优化山茱萸籽总黄 酮的提取工艺。 结果：优化的山茱萸籽总黄酮微波辅助提取工艺参数为：微波功率350W，乙醇体积分数50%，液料比 20mL/g，提取时间13min。在此最佳条件下，山茱萸籽总黄酮的一次提取率为6.68%。结论：山茱萸籽含有较高的总黄酮 含量，所确定的提取工艺提取率高、速度快、操作简便。 关键词：微波辅助提取，山茱萸籽，总黄酮，响应曲面法（RSM） Optimization of microwave-assisted extraction of total flavonoids from Cornus officinalis seed by response surface methodology LIU Rui-lin，ZHAN Han-ying，ZHANG Zhi-qi* （Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education， School of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi Normal University， Xi an 710062， China ） Abstract： Objective：A microwave-assisted extraction（MAE）method was studied for the extraction technology of total flavonoids from Cornus officinalis seed. Method：The total flavanoids contents of Cornus officinalis seed was determined by using ultraviolet-spectrophotometry method with rutin as reference substance. Using the content of total flavonoids in dry extract as a major evaluating factor，the best combination of extraction parameters was obtained with response surface methodology（RSM）. Results：The best extraction parameters were as follows：microwave power 350W；alcohol concentration 50%；solvent to sample ratio 20mL/g；extraction time 13min. Under these best conditions，the extraction yield of Cornus officinalis seed total flavonoids was 6.68%. Conclusion：The Cornus officinalis seed contain much higher total flavonoids content，and the technology had many advantages such as high yield，high speed，simple operation and so on. Key words： microwave-assisted extraction； Cornus officinalis seed； total flavonoids； response surface methodology （RSM ） 中图分类号：TS201.1文献标识码：B文 章 编 号：1002-0306（2012）07-0228-04 收稿日期：20110629*通讯联系人 作者简介：刘瑞林（1987-），男，硕博连读研究生，主要从事天然药物 化学有效成分研究。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（20875060）。 山茱萸籽总黄酮的响应曲面法 优化微波辅助提取工艺的研究 228 工 艺 技 术 Vol.33,No.07,2012 2012年第7期 0.3%， 产地为河南； 芦丁天津一方科技有限公司， 含量99%； 亚硝酸钠、 氢氧化钠、 硝酸铝、 石油醚、 无 水乙醇均为分析纯。 FW400A高速万能粉碎机北京科伟永兴仪器 有限公司； XO-SM200超声微波组合反应系统南京 先欧仪器制造有限公司； RE-52A旋转蒸发仪上海 亚荣生化仪器厂； FA电子分析天平上海恒平科学 仪器有限公司； ZK-82A电热真空干燥箱上海实验 仪器厂有限公司； TU-1900双光束紫外可见分光光 度计北京普析通用仪器有限责任公司。 1.2实验方法 1.2.1样品预处理将山茱萸籽粉碎后过60目筛， 精确称取10g样品装入滤纸筒中， 封口处加少许脱脂 棉， 细线扎紧， 置于索氏浸提管内， 高度不超过虹吸 管， 以无水乙醚为脱脂剂， 于45水浴锅中脱脂20h， 充分除去样品中脂类和脂溶性色素后，将滤纸包取 出， 先用电吹风吹干， 再置烘箱中60烘2h备用。 1.2.2山茱萸籽总黄酮提取工艺流程山茱萸籽脱脂 粉末乙醇浸提回流抽滤得滤液定容测定溶液吸光度 1.2.3提取实验设计本实验在单因素实验结果基 础上， 选取微波功率、 乙醇体积分数、 液料比以及提 取时间4个主要影响山茱萸籽总黄酮提取率的因素， 每个因素选取高、 中、 低三个水平， 各实验组的编码 与取值见表1， 共27个实验点， 其中24个为析因点， 3 个为零点， 零点实验进行3次， 作误差估计。 按照响应 曲面法中的Box-Behnken设计方案 （表2 ） ， 依次进行 实验， 以山茱萸籽总黄酮提取率 （Y ） 为响应值， 对实 验结果进行分析， 建立二次多项式数学模型： Y=0+ 3 i=1 iXi+ 3 i=1 iiXi2+ 2 i=1 3 j=i-1 ijXiXj 其中， Y为山茱萸籽总黄酮提取率预测响应值， Xi和Xj为自变量， 0为常数项， i为线性系数， ij为交 互项系数， ii为二次项系数。 1.2.4标准曲线的制作精确称取芦丁标准品20.0mg， 用质量分数75%的乙醇溶液于100mL容量瓶中定容。 准确吸取标准品溶液0.0、 0.2、 0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0、 3.0、 4.0mL于10mL棕色容量瓶中，分别加入0.4mL质 量分数为5%的NaNO2溶液， 摇匀、 放置6min 后加入 0.4mL质量分数10%的Al （NO3）3溶液， 摇匀静置6min 后加入4mL质量分数4%的NaOH溶液， 放置15min， 用 75%乙醇稀释至刻度， 10min后以75%乙醇为空白， 在 200700nm扫描， 考察最大吸收波长范围， 并在最大 吸收波长下分别测定不同浓度的芦丁的吸光度， 平 行实验三次。 以吸光度为纵坐标， 总黄酮含量为横坐 标， 绘制标准曲线。 1.2.5山茱萸籽总黄酮提取精密称取脱脂山茱萸 籽粉约5.0g， 置于250mL反应瓶中， 加入一定比例体 积分数的乙醇提取溶剂， 按照图1所示， 连接好回流 装置， 按照响应曲面法中的Box-Behnken设计方案进 行实验 （表2 ） ， 按所设计的不同实验条件提取山茱萸 籽总黄酮， 并回流冷凝， 过滤洗涤得滤液， 滤液浓缩 定容于250mL容量瓶中。精密吸取0.5mL该试液于 10mL容量瓶中，按照标准曲线制备方法在最大吸收 波长处测定其吸光度， 并计算总黄酮的含量。 1.2.6样品的测定采用硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化 钠法8， 准确移取0.5mL供试样品溶液， 置于10mL棕 色容量瓶中， 按上述1.2.4方法测定。 以试剂空白作参 比， 根据标准曲线计算样液总黄酮提取率。 总黄酮提取率 （% ） =2m1/ （m总103） 100% 其中， m1= （y-0.02 11.094） 10V提取液； m总为所取原料 质量， g。 2结果与讨论 2.1最大吸收波长的确定 按照1.2.4的方法， 在200700nm波长处对芦丁标 准溶液进行紫外光谱扫描，得到如图2的扫描图， 结 果发现最大吸收波长约为510nm。 2.2标准曲线的制作及其回归方程 以芦丁标准溶液的浓度 （mg/mL ） 为横坐标， 以吸 光度为纵坐标， 绘制芦丁标准曲线 （见图3 ） ， 并进行 线性回归， 得回归方程为： y=11.094x+0.02， 其中： x为 芦丁溶液浓度， y为吸光度； R2=0.9995，线性范围为 0.0040.08mg/mL， 其线性关系良好。 2.3响应曲面实验结果与分析 2.3.1回归模型方程的建立及显著性检验根据响 表1响应面分析因素与水平 Table 1Variables and levels of the three-variable， three-level Box-Behnken design 编码水平 X1微波功率 （W ） X2乙醇体积 分数 （% ） X3液料比 （mL/g ） X4提取时间 （min ） -18030105 0240502010 1400703015 图1山茱萸籽总黄酮的微波辅助提取装置 Fig.1The Cornus officinalis seed total flavonoids microwave-assisted extraction device Cooler Microwave oven Flask Powder and solvent 微波辅助提取装置 图2芦丁的紫外吸收光谱 Fig.2The rutin UV absorption spectrum 5 4 3 2 1 0 Abs 200300400500600700 nm 229 Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术 2012年第7期 应曲面法Box-Benhnken设计 （BBD ） ， 共27个实验点 进行实验，山茱萸籽总黄酮的提取率见表2。使用 Design-expert software 7.1.3 Trial （State-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA ） 软件进行数据分析， 以山茱萸 籽总黄酮的提取率为响应值，得到的多元二次回归 模型方程为： Y=-16.178+0.024X1+0.299X2+0.609X3+0.846X4- 4.766E-005X1X2-1.828E-004X1X3+3.531E-004X1X4+ 2.413E-003X2X3+8.750E-004X2X4-7.000E-004X3X4- 3.242E-005X12-3.381E-003X22-0.017X32-0.038X42 该模型的回归分析见表3。 根据模型的P0.05， F模型= 70.52F0.05（14.3 ） =8.71， 说明实验所选用的二次多项 模型具有高度的显著性；失拟项用来检测回归模型 与实际实验值拟合程度的好坏， 如果失拟项显著， 说 明对响应值有影响的还有其它因素。总黄酮提取率 的失拟项P=0.11180.05，表明失拟不显著。由此可 见，该模型能够较好地描述各因素与响应值之间的 真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺 条件。 该回归模型的调整确定系数为R2Adj=0.9740， 即 该模型能解释97.40%响应值的变化，模型拟合程度 良好， 实验误差小， 说明应用响应曲面法优化山茱萸 籽总黄酮的提取模型条件是可行的。 此外， 还可以 明显看出， X1、 X2、 X3、 X4、 X1X3、 X1X4、 X2X3、 X12、 X22、 X32 和X42具有统计学意义 （P0.05 ） ， 即微波功率、 乙醇体 积分数、 液料比、 提取时间的一次项， 微波功率与液 料比的交互项、 微波功率与提取时间的交互项、 乙醇 体积分数与液料比的交互项， 微波功率、 乙醇体积分 数、 液料比、 提取时间的二次项均对山茱萸种籽总黄 酮的提取率有显著影响。 2.3.2响应曲面分析根据模型方程绘制响应曲面 图、标准残差图及模型预测值/实验值拟合曲线图， 结果见图4 （A-H ） 。 从响应曲面图中可以明显地看出 各独立变量之间的交互作用对响应值的影响。从标 准残差图及模型预测值/实验值拟合曲线可直观地 看出所建立模型与实验值的拟合情况。 图4A为微波功率和乙醇体积分数对山茱萸籽总 黄酮提取率的影响， 当液料比为201mL/g、 提取时间 为10min时， 图中乙醇体积分数对山茱萸籽总黄酮提 取率的影响比较显著， 其曲线呈上升趋势， 且变化幅 度较大，但在乙醇体积分数为50%处提取率开始缓 慢下降。 微波功率的曲线较平缓， 表明其对提取率影 响较小。从等高线图中可以看出微波功率与乙醇体 积分数的交互作用对山茱萸籽总黄酮提取率的影响 不显著。 由图4A可确定最佳水平范围： 微波功率320 400W， 乙醇体积分数50%60%。 表2BBD实验设计和实验结果 Table 2Box-Behnken design and observed responses 实验号X1X2X3X4 Y提取率 （% ） 实验值预测值 1803020103.263.09 24003020105.675.39 3807020103.473.67 44007020105.275.36 5240501052.652.80 6240503053.043.15 72405010154.994.80 82405030155.245.01 980502053.153.09 10400502054.514.52 11805020154.344.45 124005020156.837.02 132403010103.663.75 142407010102.973.06 152403030103.033.07 162407030104.274.30732.64 184005010105.285.22 19805030103.493.50 204005030104.874.91 21240302053.163.24 22240702053.623.33 232403020154.754.99 242407020155.565.44 252405020106.476.56 262405020106.636.56 272405020106.586.56 图3芦丁标准曲线 Fig.3Rutin standard curve 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 A 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 mg/mL 表3拟合回归方程的方差分析结果 Table 3Analysis result of variance （ANOVA ） for the fitted quadratic polynomial model 方差来源 自由度平方和均方FP 模型1444.153.1570.520.0001* X1111.9811.98267.90 0.0001* X210.220.224.950.0460* X310.230.235.140.0427* X4111.1711.17249.89 0.0001* X1X210.0930.0932.080.1748 X1X310.340.347.650.0171* X1X410.320.327.140.0203* X2X310.930.9320.820.0007* X2X410.0310.0310.680.4241 X3X414.900E-003 4.900E-0030.110.7463 X1213.673.6782.160.0001 X2219.769.76218.16 0.0001* X32114.7214.72329.14 0.0001* X4214.904.90109.63 0.0001* 失拟项100.520.0527.810.1188 纯误差20.0136.700E-003 总和2644.69 确定系数R2=0.9880； 调整确定系数R2Adj=0.9740； 变异系数 CV=4.78% 注： P值0.05， 对应因素对响应值的影响显著。 230 工 艺 技 术 Vol.33,No.07,2012 2012年第7期 图4B为乙醇体积分数50%、 提取时间10min时液 料比和微波功率对山茱萸籽总黄酮提取率的影响， 从图中可以看出，液料比对山茱萸籽总黄酮提取率 的影响比较显著， 其曲线呈现先增大后减小的趋势。 微波功率的曲线较平缓， 表明其对提取率影响较小。 由此可确定最佳的水平范围液料比为2025mL/g， 微 波功率320400W。 图4C为微波功率和提取时间对山茱萸籽总黄酮 提取率的影响， 提取时间、 微波功率的二次项对山茱 萸籽总黄酮提取率的影响十分显著。从等高线图中 可以看出微波功率与提取时间的交互作用对山茱 萸籽总黄酮提取率的影响极显著。从图中可确定最 佳的水平范围为微波功率320400W，提取时间10 15min。 图4D为乙醇体积分数和液料比对山茱萸籽总黄 酮提取率的影响， 乙醇体积分数、 液料比的二次项对 山茱萸籽总黄酮的提取率的影响十分显著。从图中 可确定最佳的水平范围为乙醇体积分数50%60%， 液 料比为2025mL/g。 图4E为乙醇体积分数和提取时间对山茱萸籽总 黄酮提取率的影响，从图中可确定最佳的水平范围 为乙醇体积分数50%60%， 提取时间1015min。 图4F为液料比和提取时间对山茱萸籽总黄酮提 取率的影响，从图中可确定最佳的水平范围为液料 比为2025mL/g， 提取时间1015min。 图4G与4H分别为标准残差图与模型预测值/实 验值拟合曲线图， 从图4G可以看出， 响应值与实验值 拟合较好 （0.05pF ） 。 从图4H可以看出， 实验值与预 测值几乎在一条直线上，表明模型能够较好地描述 各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该模型 确定最佳提取工艺条件。 通过对模型方程求导计算，得到山茱萸籽总黄 酮提取的最佳条件为： 微波功率353.29W， 乙醇体积 分数50.53%， 液料比19.76mL/g， 提取时间13.05min。 在此最佳条件下，山茱萸籽总黄酮的一次理论提取 率为7.21%。考虑到实际操作的便利， 将提取工艺参 数修正为微波功率350W， 乙醇体积分数50%， 液料比 20mL/g， 提取时间13min， 3次平行实验得到的实际平 均得率为6.78%， 其相对标准偏差小于2%。 3结论 本文采用响应曲面优化法对微波辅助提取山茱 萸籽总黄酮的工艺进行了优化，在所确定的工艺条 件下山茱萸籽总黄酮的一次提取率达到6.68%， 其含 量介于山茱萸肉总黄酮含量的3.84%8.61%9-10。说 明山茱萸籽具有较好的药用、 保健功能； 此外， 该方 法萃取时间短、 提取率高， 表明响应曲面优化微波辅 助提取工艺条件更科学、 有效， 该研究为山茱萸籽的 开发利用提供了一定的参考。 参考文献 1国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部）M.北京： 中国医药科技出版社，2010：26. 2周京华，李春生，李电东.山茱萸有效化学成分的研究进展 J.中国新药杂志，2001，10（11）：808-812. 3徐丽珍，李慧颖，田磊.山茱萸化学成分的研究J.中草药， 1995，26（2）：62-65. 4 Du WF，Hao C，Wang MY. 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