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第 30 卷 第 4 期 农 业 工 程 学 报 Vol.30 No.4 2014 年 2 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Feb. 2014 279 低分子量岩藻聚糖酶法制备工艺 闫相勇，刘翼翔，凌绍梅，李 斌，吴永沛 （集美大学生物工程学院，厦门 361021） 摘 要：为了获得分子量集中，生物活性显著的岩藻低聚糖片断，该试验从九孔鲍肝胰腺中分离纯化出岩藻聚糖 裂解酶裂解岩藻聚糖。通过等电点法、硫酸铵分布盐析法及 Sephadex G-150 柱分离纯化出 2 种底物酶（岩藻聚糖 酶、-L-岩藻糖苷酶） ，同时采用黏度和还原糖法作为酶活的评价指标评价酶的作用特点。结果表明：等电点法中 pH 值 4.5、5.0 时的沉淀物酶活最高，且 pH 值 4.5 的沉淀物在硫酸铵质量分数为 30%时分离纯化出岩藻聚糖酶， 而 pH 值 5.0 的沉淀物在硫酸铵质量分数 40%时分离纯化出 -L-岩藻糖苷酶。此种工艺方法能得到 2 种岩藻聚糖 裂解酶，底物降解率为 8%15%，获得硫酸基团破坏性小的低分子量岩藻聚糖。因此，九孔鲍岩藻聚糖裂解酶可 作为酶法制备低分子量岩藻聚糖的工具酶，具有重要的开发应用价值。 关键词：酶；纯化；工艺；九孔鲍；岩藻聚糖裂解酶；岩藻聚糖 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2014.04.034 中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2014)-04-0279-07 闫相勇，刘翼翔，凌绍梅，等. 低分子量岩藻聚糖酶法制备工艺 J. 农业工程学报，2014，30(4)：279285. Yan Xiangyong, Liu Yixiang, Ling Shaomei, et al. Preparation technology of low molecular weight fucoidan by enzyme hydrolytic from Laminaria japonicaJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2014, 30(4): 279285. (in Chinese with English abstract) 0 引 言 九孔鲍（Haliotis diversicolor supertexta）为热 带、亚热带重要经济鲍种，是中国福建、台湾及广 东省海域主要的人工养殖种类之一，年人工养殖产 量达 7 000 t。在鲍深加工过程中，大量鲍内脏被丢 弃，造成资源和环境污染。Tanaka1和 Natalie2等 分别报道了鲍（Haliotis gigantea Gmelin，Haliotis rufescens，Haliotis corrugata）内脏中含有岩藻聚糖 裂解酶 （岩藻聚糖酶， -L-岩藻糖苷酶， 硫酸酯酶） ， 能裂解大分子岩藻聚糖成为 210 个岩藻糖构成的 岩藻低聚糖，酶解产物较天然岩藻聚糖展现出显著 的生物功效，故为提高九孔鲍内脏的经济利用价 值，很有必要对其内脏酶进行研究。 岩藻聚糖（Fucoidan）是一种水溶性硫酸化多 糖，主要存在于褐藻细胞壁基质中，是褐藻潮间带 一种黏液保护性多糖3。 由于其结构特征比较复杂， 如：单糖组成、硫酸根含量及位点、分子量、连接 收稿日期：2013-09-23 修订日期：2014-01-20 基金项目：国家海洋局公益项目（201205022-6）的部分内容；福建省 自然科学基金（12141002 ） ；集美大学科研基金（ZQ2012014） 。 作者简介：闫相勇，男，河南人，研究方向为农产品加工与贮藏。厦门 集美大学生物工程学院，361021。Email：yxy042304 通信作者：吴永沛（1956） ，男，广东人，教授，研究方向为食品 生物技术。厦门 集美大学生物工程学院，361021。 Email：wuypei 方式、糖基连接顺序等各不相同4，由此决定了岩藻 聚糖具有多种生物活性，如抗炎5，抗病毒6，抗凝 血7， 抗肿瘤8等， 而且证实口服给药无毒副作用9， 并且这些生物活性是陆生植物硫酸多糖类化合物 所无法比拟的。天然岩藻聚糖（来源于 Laminaria japonica）的高分子量约为 189 KDa10，高分子量 与高黏性在一定程度上阻碍了其作为药品的开发 应用11，因此需要降低其分子量来提高其生物活性 及人体的吸收利用率。有研究报道岩藻聚糖分子量 为 550 KDa，硫酸基团取代率在 20%以上时具有 较高的生物活性12-14。 岩藻聚糖的降解方法中酶法较温和，获取的片 断特异性较强，产物分子量集中，低聚糖分子结构 不受影响，生物活性显著15。本文研究采用九孔鲍 鱼的肝胰腺为原材料分离纯化出岩藻聚糖裂解酶， 建立酶法制备低分子量岩藻聚糖的工艺方法。 1 材料与方法 1.1 原料与试剂 九孔鲍内脏，福建省厦门市新阳洲水产工贸公 司提供；岩藻聚糖，本实验室从福建省人工养殖海 带（Laminaria japonica）中提取制备，其中岩藻聚 糖纯度为 86.7%，L-岩藻糖质量分数为 21.3%，有 机 SO42-为 32.5%； 岩藻聚糖标准品， 购于美国 Sigma 公司，来源于 Fucus vesiculosus，其中 L-岩藻糖质 农业工程学报 2014 年 280 量分数为 44.1%，SO42-为 26.3%；岩藻糖标准品， 购于美国 Sigma 公司；Sephadex G-150（分离范围 MW 530 KDa），购于北京索莱宝公司。 1.2 主要仪器设备 DS-1 型高速组织捣碎机（上海精密仪器厂）； PYX-CXG25 型电脑恒温层析柜（广东科力有限公 司）；BS224S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统 有限公司）；IEC-31R 台式高速冷冻离心机（美国 Thermo 公司）；Modulyod-230 冷冻干燥机（美国 Thermo 公司）；V-755B 紫外可见分光光度计（上 海元析仪器有限公司）；0.70.8 mm 乌氏黏度计 （上海申玻仪器公司）。DKB-2006 低温恒温水浴槽 （上海精宏实验设备公司）；WK-1600A 粉碎机（青 州精诚机械厂）。 1.3 试验方法 1.3.1 试验流程 九孔鲍肝胰腺称量加入磷酸盐缓冲液组 织捣碎机捣浆初级分离纯化（硫酸铵分段盐析 法、有机溶剂法、等电点沉淀法）取粗酶沉淀物 二次分离纯化(硫酸铵分段盐析)取酶沉淀物 再次分离纯化（Sephadex G-150）纯酶沉淀物 加入底物岩藻聚糖溶液控制温度、pH 值等反应 条件测定酶反应产物的量反应终止分离纯 化岩藻低聚糖。 1.3.2 鲍内脏粗酶液的提取制备 准确称取一定量的九孔鲍内脏肝胰腺，按 14 g/mL 的比例加入提取液16， 其中提取液包含磷酸盐 缓冲液（0.1 mol/L，pH 值 7.0）体积分数为 10%； 3 g/mL KCl 体积分数为 85%；0.154 mol/L MgSO4 体积分数为 5%。 组织匀浆捣碎， 于 4下浸提过夜。 粗酶提取液在 8 000 r/min，20 min 条件下离心去除 沉淀物，收集上清液于 4 条件下贮存备用。 1.3.3 鲍内脏粗酶的不同纯化方法比较 纯化过程中测定酶活力的相关定义： 酶活力单位：以底物黏度为指标：酶解反应 中每 30 min 底物岩藻聚糖溶液黏度值降低 0.01 个 单元为一个酶活单位（U）。以产物还原糖为指 标：酶解反应每 30 min 产物中还原糖每增加 1 g 作为一个酶活单位（U）； 总蛋白量：提取液中蛋白质总量（mg）； 酶的总活力：提取液中酶活力单位总数（U）； 酶的比活力：提取液中每 mg 蛋白质具有的酶 活力单位(U/mg)； 纯化倍数：纯化过程各阶段酶的比活力之比； 回收率：纯化过程各阶段酶总活力之比。 为探讨鲍内脏酶在初级纯化中酶活丧失最小 的纯化方法，根据蛋白质的电荷性质，采用以下 3 种常规方法进行分离纯化，并比较其纯化效果。 1）硫酸铵分段盐析法 硫酸铵可以破坏蛋白质与极性水分子结合所 形成的水化层，中和蛋白质表面的电荷，引起蛋白 质絮集沉淀。据此原理，准确量取 50 mL 粗酶液， 加入硫酸铵（颗粒度 200300 目）使粗酶液的硫 酸铵质量分数为 30%。4下静置 2 h，冷冻离心 （8 000 r/min，15 min）收集上清液。再次在上清液 中加入硫酸铵使其质量分数为 70%，操作条件同 上， 收集沉淀物并用30 mL乙酸缓冲液 （0.05 mol/L， pH 值 5.5） 进行溶解， 于 4条件下透析 （MW 8-14 KDa）23 次以除去硫酸铵盐。 2）有机溶剂法 亲水性有机溶剂能降低溶液中介质的介电常 数，使溶质分子间的静电引力增加，聚集沉淀；同 时水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水 的浓度，压缩了亲水性溶质分子表面原有的水化层 厚度，降低其亲水性，导致蛋白质脱水凝集。据此 原理，准确量取 3 等份 50 mL 的粗酶液，加入体积 分数分别为 40%、50%、66.7%的冷丙酮（20下 贮存） 于 4条件下浸置 2 h， 冷冻离心 （8 000 r/min， 20 min），收集沉淀物。而后用 30 mL 乙酸缓冲液 （0.05 mol/L，pH 值 5.5）溶解沉淀物，在 4条件 下保存备用。 3）等电点沉淀法 根据蛋白质表面离子化所带电荷的多少来分 离纯化九孔鲍内脏酶， 具体方法为： 取 7 等份 50 mL 鲍内脏粗酶液，分别用乙酸（0.02 mol/L）和 NaOH （0.02 mol/L）溶液调节鲍内脏粗酶液的 pH 值范围 为 3.09.0，在 4条件下浸置 2 h，其余操作方法 同 2），测定各沉淀物中岩藻聚糖裂解酶的活力。试 验中优先用黏度法定性测出岩藻聚糖裂解酶的等电 点范围，而后在此范围内再作进一步的细致探讨。 1.3.4 黏度测定 采用乌氏黏度计测定酶解液的黏度变化， 并换算 成相对黏度值，以此来评价鲍内脏酶的活力大小16。 酶解条件为 2 g/mL 底物在 38 下先水浴 10 min， 而后加入 5 mL 酶液反应 2 h，期间每 30 min 测定 酶解反应液黏度变化值。计算公式如下16： 黏度相对值=(TrTw)/(T0Tw)100% （1） 式中：Tr为反应结束流动时间，s；T0为反应开始时 流动时间，s；Tw为空白缓冲液流动时间，s。 1.3.5 酶解时间及底物浓度对酶活力的影响试验 为探讨酶解反应时间，设置反应总时间为 2 h， 间隔 20 min 测定酶解液黏度变化。 在此基础上探讨 第 4 期 闫相勇等：低分子量岩藻聚糖酶法制备工艺 281 底物浓度对酶活力的影响，设置底物质量浓度范围 0.24.0 g/mL，酶解条件同 1.3.4，测定酶解液黏度 变化。 1.3.6 柱层析纯化 采用 Sephadex G-150 柱（2.5 cm75 cm）分离 纯化岩藻聚糖裂解酶，以乙酸缓冲液（0.05 mol/L， pH 值 6.0）与 0.2 mol/L NaCl 配制成的混合液作为 洗脱液，流速 V=0.5 mL/min 进行等度洗脱。 1.3.7 标准曲线制作 1）还原糖含量的测定：采用 DNS 法17，以 L-岩藻糖（Sigma 出品）为标准品。 2）SO42-含量的测定：采用BaCl2-明胶比浊法18， 用干燥至质量不变的硫酸钠(AR)为标准品。 3）蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法19， 以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，或在 280 nm 处测定蛋白质吸光度值。 4）SO42-相对值的测定：酶解底物中 SO42-含量 /未酶解底物中 SO42-含量 1.3.8 数据处理方法 试验数据用 Excel 2010，origin 8.0 软件处理， 采用 SPSS V17.0 统计软件对数据进行单因素方差 分析（One-Way ANOVA）。 2 结果与分析 2.1 初级纯化方法对酶活的影响 结果如图 1 所示，表明 pH 值 5.0 沉淀物对底 物裂解能力较强，2 h 后酶解液的黏度下降了 12%。 由此可大致确定鲍鱼裂解酶的等电点范围为 pH 值 4.06.0，因此只需在此区间内具体探讨其最适等 电点。3 种蛋白质初级纯化方法效果如表 1，表明 等电点法（pH 值 4.5，5.0）所得到的提取物酶活回 收率较另外 2 种纯化方法高，同时对鲍粗酶亦进行 了初步纯化分离。 图 1 不同 pH 值条件下粗酶提取物水解岩 藻聚糖的黏度变化 Fig.1 Viscosity variation of fucoidan hydrolysed by crude enzymatic extracts prepared under different pH condidtion 表 1 不同岩藻聚糖裂解酶制备方法的效果比较 Table 1 Comparision of different preparation methods on the enzymolysis efficiency of fucoidan lyases. 硫酸铵分段盐析法 冷丙酮法 等电点沉淀法 冷丙酮体积分数 Volumetric concentration of cold acetone/ % pH 值 pH Value 粗酶液 Crude enzyme liquid 硫酸铵质量分数为 30%和 70% Ammonium sulfate concentration was 30% and 70%） 40 50 66.7 4.5 5.0 5.5 总蛋白量 Total proteins/mg 154.0 47.2 34.7 37.7 50. 7 33.8 33.0 56.5 总活力 Total activity/U 2 882.3 607.8 235.3 171.6 534.3 1 279.4 1 225.5 348.0 比活力 Relative activity/(Umg-1) 18.7 12.9 6.8 4.6 10.5 37.9 37.1 6.2 纯化倍数 Purification fold - 0.7 0.4 0.2 0.5 2.0 2.0 0.3 回收率 Recovery/% 100.0 21.1 8.2 6.0 18.5 44.4 42.5 12.1 注：采用酶解产物中还原糖的生成量作为酶活大小的衡量指标，酶解条件为：2 g/mL 底物岩藻聚糖 1 mL 预热 10 min 后加入 1 mL 酶液在 38水浴 条件下反应 2 h，以产物还原糖作为酶活力评价。 Note: Adopt the reducing sugar product in enzymatic hydrolysate to measure the enzymatic activity of fucoidan lyases. The enzymolysis condition was that 2 g/mL fucoidan was used as a substrate which was incubation at 38 for 10 min, and the reaction was started by addition of 1 mL of the enzyme solution; the mixture was incubated at 38 for 2 h, reducing sugar in product was adopted to evaluate the enzyme activity. 2.2 酶解产物 SO4 2-的保留率 由 2.1 节可知，选择 pH 值范围 4.55.0，此区 间内提取物中是否存在硫酸酯酶，且是否对底物岩 藻聚糖具有脱 SO42-作用， 故需要探讨各 pH 值下的 提取物酶活大小及底物中 SO42-保留情况。2 g/mL 底物岩藻聚糖 1 mL 预热 10 min 后加入 1 mL 酶液 在 38水浴条件下反应 2 h，离心收集上清液，用 透析袋（截留 MW3.5 KDa）在 4下透析上清液 23 次，以除去产物中游离的 SO42-，而后冷冻干 燥，测定 SO42-保留量，对照组采用失活的酶。结果 如图 2，表明 pH 值 4.06.0 范围内，底物中 SO42- 相对含量变化不显著（p0.05），可能此范围内未 有硫酸酯酶的存在。并且 pH 值 4.5、5.0 时的沉淀 物酶活较高，分别为 1 279.4，1 225.5 U，故岩藻聚 糖裂解酶的等电点在 pH 值 4.5，5.0 附近。 农业工程学报 2014 年 282 图 2 不同 pH 值下粗岩藻聚糖裂解酶提取物的酶活及其产 物中 SO42-保留率 Fig.2 Enzyme activity of crude fucoidan enzymic extractions and corresponding sulfate groups retention rate of hydrolysed fucoidans under different pH value 2.3 酶反应历程特点 为探讨最佳酶解反应时间，酶解过程中每间隔 20 min 测定酶解反应液黏度变化。结果如图 3，表 明在 60 min、 80 min 时， 酶解液黏度下降了 11.8%， 13.3%；80 min 之后反应液黏度值变化趋于平稳， 60 min 之后反应液黏度值已无显著变化 （p0.05） ， 故取 60 min 作为酶解反应时间。 注：质量分数为 2%底物岩藻聚糖 15 mL，酶液 5 mL（pH 值 4.5 沉淀的 蛋白酶，蛋白质量浓度为 4.3 mg/mL），在 38水浴下酶解 2 h，对照 组为将酶灭活。 Note: The reaction mixture contained 15 mL of 2% (mass fraction) fucoidan, 5 mL of the enzyme solution (the mass concentration of precipitating protease at pH value 4.5 was 4.3 mg/mL), which was incubation at 38 for 2 h, the control groups were the inactivated enzyme. 图 3 酶解过程中底物黏随时间的变化 Fig.3 Viscosity variation of fucoidan during enzymolysis process 2.4 底物浓度对酶促反应的影响 为探讨底物浓度对酶促反应的影响，消除底物 量对酶活释放的抑制。试验结果如图 4，当底物浓 度大于 1.0%时， 酶解底物基本处于饱和状态， 对酶 促反应影响较小。 注：质量分数为 2%15 mL 底物岩藻聚糖，5 mL 酶液（pH 值 4.5 沉淀物， 蛋白质量浓度为 4.3 mg/mL） 于 38条件下反应 1 h。 对照组为将酶灭活。 Note: The reaction mixture contained 15 mL of fucoidan, 5 mL of the enzyme solution( the mass concentration of precipitating protease at pH value 4.5 was 4.3 mg/mL), which was incubation at 38 for 1 h, the control groups were the inactivated enzyme. 图 4 底物质量分数对酶促反应的影响 Fig.4 Effect of substrte mass fraction on enzymatic reaction 2.5 硫酸铵分段沉淀法 由 2.2 可知岩藻聚糖裂解酶 pH 值为 4.5、5.0 时，得到的沉淀物酶活高，且产物中硫酸根保留率 高。故对 pH 值 4.5、5.0 处的沉淀物进一步采用硫 酸铵分段盐析法进行分离纯化。设置硫酸铵质量分 数为30%70%， 收集沉淀物于4环境中静置2 h。 对照组于同等条件下采用失活的酶。沉淀物用乙酸 缓冲液稀释溶解至 10 mL， 而后用透析袋 （MW 8 14 KDa） 浸没于相同乙酸缓冲液中以透析去除硫酸 铵盐。结果如图 5a 所示，pH 值 4.5 下沉淀物在硫 酸铵质量分数 30%时沉淀物酶活较高，为 3.17 U； 图 5b 中 pH 值 5.0 下沉淀物在硫酸铵质量分数 40% 处酶活较高，为 1.72 U。同时岩藻聚糖酶水解底物 中 SO42-相对含量为 90.3%，而 -L-岩藻糖苷酶为 86.9%，变化不显著（p0.05），可知在 pH 值 4.5、 5.0 处的沉淀物中不含硫酸酯酶。吴茜茜等20-21经 固体发酵法从 Fusarium sp. LD8、Dendryphiella arenaria TM94 中提取纯化出岩藻聚糖裂解酶，发 现其等电点分别为 4.5、4.4。早期的文献报道中， Tanaka1、Natalie 等2从鲍鱼肝胰腺中分离得到岩 藻 聚 糖 酶 （Fucoidanase ） 及 -L- 岩 藻 糖 苷酶 （-L-Fucosidase），且 Natalie 等发现岩藻聚糖酶是 一种内切型酶，其等电点为 4.5；而 -L-岩藻糖苷 酶为外切型酶，由此可推测，本试验中 pH 值 4.5 处沉淀物经质量分数为 30%硫酸铵分离纯化出的 酶为岩藻聚糖酶（Fucoidanase），而 pH 值 5.0 处 的为 -L-岩藻糖苷酶（-L-Fucosidase）。 2.6 柱层析纯化 试验结果如图 6a，可知管数 192276 为岩藻 聚糖酶（最高酶活为 0.43 U，试验组底物降解率为 14.76%，对照组为 2.83%），而管数 50112 为杂 蛋白峰。图 6（b）显示管数 3070 为 -L-岩藻糖 第 4 期 闫相勇等：低分子量岩藻聚糖酶法制备工艺 283 苷酶（最高酶活为 0.27 U，试验组降解率为 8.32%， 对照组为 2.05%） ， 其中管数 70110 为杂蛋白峰， 相对于纯化前的样品而言，这两种酶的酶活回收 率约为 16%，较纯化前的酶活有一定丧失。 图 5 硫酸铵分段盐析的酶活力和酶解产物的硫酸根质量分数 Fig.5 Enzymic activity of different fucoidan lyases purified by different concentration ammonium sulfate and corresponding sulfate groups content of hydrolysed fucoidan 图 6 岩藻聚糖裂解酶洗脱纯化及酶活力曲线 Fig.6 Eluted and enzymic activity curve of fucoidan lyases 3 讨 论 岩藻聚糖裂解酶来源广泛，主要分布于海洋无 脊椎动物（软体动物和棘皮动物）和海洋微生物， 一般包含岩藻聚糖酶， -L-岩藻糖苷酶和硫酸酯酶。 由于不同来源的岩藻聚糖裂解酶及底物岩藻聚糖 分子结构具有差异性，从而使底物岩藻聚糖的降解 率不同。Kitamura 等16从 Patinopecten yessoensis 肝胰腺中纯化出岩藻聚糖酶（WM 8485 KDa）的 酶解产物中低聚糖质量分数为 29.9%。Bilan 等23 从 Littorina kurila 肝胰腺中分离纯化出的岩藻聚糖 酶裂解底物岩藻聚糖（来源于 Fucus distichus）的 能力不显著（p0.05），原因是此酶不能裂解 2,4- 硫酸氢基-（14）-L-岩藻吡喃糖和 2-硫酸基- （14）-L-岩藻吡喃糖交替出现组成的糖苷键。 表明酶解反应中底物岩藻聚糖的成分构成、分子 量、连接方式等结构特征会影响岩藻聚糖裂解酶的 水解能力。 此外，鲍内脏中含有硫酸酯酶会水解结合在岩 藻聚糖上的硫酸基团，从而降低岩藻低聚糖的生物 活性。但硫酸酯酶是在底物裂解之前，还是底物裂 解成低聚糖后，或者是在酶解过程中对底物硫酸基 团开始起作用，这些问题是酶解过程中需要关注 的。 Bakunina23， Daniel 等24从扇贝 Pecten maximus 分离出的硫酸酯酶仅能水解岩藻吡喃糖 C2 位上的 硫酸基团，而对其他位置上的硫酸基团不起作用。 本试验结果表明等电点范围 pH 值 4.5-5.0 提取物的 酶 解 产 物 中 硫 酸 基 团 相 对 含 量 变 化 不 显 著 （p0.05），说明此 pH 值范围内的提取物中不包含 硫酸酯酶，或者硫酸酯酶不起作用。Tanaka1， 农业工程学报 2014 年 284 Natalie2， Kusaykin 等25对硫酸酯酶的研究时发现其 对底物岩藻聚糖亦无显著的脱硫作用， 且硫酸酯酶的 脱硫化不是酶解反应的先决条件， 此结论与本试验研 究结果相一致。但有报道表明，硫酸酯酶作用于酸化 处理过的岩藻聚糖时酶活较高， 同时有观点认为酶解 产物中出现的岩藻硫酸盐及低聚糖可能会诱导硫酸 酯酶的活性，但具体的激活机理仍然需要探究。由此 可见不同来源的岩藻聚糖裂解酶及不同分子结构的 底物岩藻聚糖，随机组合进行酶解反应时，会导致酶 解程度及酶解底物成分的不同， 因此需要探究相匹配 的酶-底物类型，来提高岩藻聚糖的裂解率。 4 结 论 本研究从九孔鲍 （Haliotis diversicolor supertexta） 肝胰腺中制备岩藻聚糖裂解酶，采用等电点法、硫 酸铵分布盐析法及 Sephadex G-150 分离纯化出岩 藻聚糖裂解酶和 -L-岩藻糖苷酶，采用黏度法评价 这 2 种酶的活力大小，分别为 0.43U，0.27U。试验 中鲍内脏粗酶对岩藻聚糖降解率为 2%3%，而分 离纯化后的岩藻聚糖裂解酶降解能力显著提高，降 解率达到 8%15%， 且硫酸根相对含量变化不显著 （p0.05），表明利用九孔鲍鱼内脏酶降解海带中岩 藻聚糖具有重要的开发应用价值，为商业化高效性 酶源及分离纯化提供了基础。 参 考 文 献 1 Tanaka K, Sachiko S. 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Preparation technology of low molecular weight fucoidan by enzyme hydrolytic from Laminaria japonica Yan Xiangyong, Liu Yixiang, Ling Shaomei, Li Bin, Wu Yongpei (College of Bioscience Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China) Abstract: In order to obtain fuco-oligosaccharides which possessed centralized molecular weight and remarkable bioactivity, an enzymic degradation method, due to its mild reaction conditions and no destructive effect on the structure of fucoidan, was adopted in this work. So the fucoidan lyases, derived from hepatopancreas of abalone (Haliotis diversicolor supertexta), were isolated and partially purified to hydrolyze fucoidans which were derived from Laminaria japonica. According to the electric properties of protein, an organic solvent method, an ammonium sulfate precipitation method and an isoelectric precipitation method were employed to isolate and purify the fucoidan lyases, and their purification effects were compared. First, for the isoelectric precipitation, the enzymic activity of precipitates at pH value 3.0 to 9.0 were measured with the viscometric method, aiming to shrink the isoelectric range of fucoidan lyases. The results showed that