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安徽农 业科学 。 J o u rna l o f A n h u i A s r i S c i 2 0 1 2, 4 0 ( 3l _ 1 - 1 3 0 6 责任编辑朱琼琼责任校对况玲玲 超声波处理对大白菜花 篱墟媾法藕纂因 的 影响 狄红梅 , 王学 府 , 曹 秋芬 , 孟玉 平 ( 1 晋中职业技术学 院, 山西榆次 0 3 0 6 0 0; 2 山西省农业生物技术研究中心, 山西太原 0 3 0 0 3 1 ) 摘要 目的 探索提 高花粉管通道法对大白菜转化率的途径。 方法 以大白菜品种 0 3 号和玉青的花粉为材料 , 对其萌发的缓冲液和 超声波处理的各参数进行筛选。 结果 大白菜花粉萌发的最佳缓冲液为蔗糖 2 0 0SL+硼酸 1 0 0 m s L+ 硝酸钙2 0 0m sL , 较理想的超 声波处理参数为功率 1 5 0 W、 工作时间 5 s 、 间隔时间5 s 、 处理次数 8 s ; 经浓度为2 0 0 m s L 的卡那霉素筛选, 获得 3株 T 。 代单株。 结 论 l 为进一步进行大白菜的基因转化奠定了基础。 关键词超声波; 大白菜; 花粉管通道法; 转基 因 中图分类号S 1 2 2 文献标识码A 文章编号o 5 1 7 6 6 1 1 ( 2 0 1 2 ) 0 3 0 1 3 0 4 0 3 I n flue n c e o f Ul t r a s o n i c Tr e at me n t o f Ch i ne s e Ca bb a g e Ge n e Tr a n s f o r ma tio n t h r o u g h t h e Po l l e n Tu b e Pa t h wa y DI Ho n g - me i e t a l ( V o c a t i o n a l a n d T e c h n i c a l C o H e g e o f J i n z h o n g ,Y u c i ,S h a n x i 0 3 0 6 0 0) Ab s t r a c t 0 b ie c t i v e 1 T h e R e s e a r c h a i me d t o e x p l o r e i mp r o v i n g t h e p e r c e n t c o n v e r s i o n o f C h i n e s e c a b b a g e t h r o u g h p o l l e n t u b e p a t h w a y f M e t h o d T h e C h i n e s e c a b b a g e v a ri e t y : D a b a i c a i N o 0 3 a n d Y u q i n g b e i n g t a k e n a s e x p e ri m e n t a l m a t e ri a l , t h e p a r a m e t e r s o f th e g e r m i n a t i o n p o l l e n t r e a t e d b v b u f f e r a n d u l t r a s o n i c wa s a n a l y z e d R e s u l t s Th e b e s t b u ff e r f o r c a b b a g e pol l e n g e r mi n a t i o n w a s the s u c ros e o f 2 o o L + b o ri c a c i d o f 1 0 0 msL +c a l c i u m n i t r a t e o f 2 0 0 mSL a n d t h e p r e f e f r e d p r o c e s s i n g p a r a me t e r s w a s the u l t r a s o n i c p o w e r o f 1 5 0 w, t h e w o r k i n g t i me o f 5 s e c o n d s the t i me i n t e r v a l o f 5 s e c o n d st h e p r o c e s s i n g t i me o f 8 s e c o n d s Un d e r t h e s e l e c t i o n c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 0 ms L o f Ka n a my c i n , 3 T 1 p l a n t s w e r e o b t a i n e d C o n c l u s i o n T h e e x p e ri m e n t l a i d the b a s i s f o r f u r t h e r g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n o f C h i n e s e c a b b a g e Ke y wo r ds Ul t r a s o n i c:Ch i n e s e c a b b a g e;Po l l e n t u b e p a t h wa y:Tr a n s g e n i c me t h o d 花粉管通道法是我国生物化学家周光宇首先创立的 。 它是利用植物授粉后花粉管生长所形成 的天然通道 , 以花粉 萌发的培养基作为缓冲液 , 使花粉携带外源 D N A ( 质粒) 进 入胚囊以达到遗传转化 目的的一种转基 因手段 。花粉管 通道法操作简单易行, 是将分子生物学技术直接应用于常规 育种的有效方法之一 _ 3 J 。白菜类蔬菜携带不易再生的 A A 基因组型 , 而针对 白菜类蔬菜难分化这一特点, 研究者们逐 渐将研究转向那些不借助组织培养的转化方法。近年来 , 真 空抽滤法、 子房注射法、 种子共培养法、 花粉管通道法等遗传 转化方法在白菜类蔬菜上的尝试皆取得了成功 , 但用超声 波辅助处理提高花粉管通道法的转化率, 在大 白菜上 尚未见 报道。该研究对加有质粒的大白菜花粉缓冲液进行了超声 波处理 , 并对其缓冲液和超声波处理的各参数进行了选择 , 为进一步进行基因转化奠定基础。 1 材料与方法 1 1 材料供试大 白菜品种为玉青和 o 3号, 取 自山西省农 科院蔬菜研究所。每 日上午 1 0 : 0 0时采集 2供试品种的花 粉, 自然干燥后储存于4冰箱内待用。 1 2 方法 1 2 1 花粉萌发的缓冲液。试验采用液体培养基 , 其成分 为蔗糖、 硼酸和硝酸钙 , 试验设计如下: 只用蔗糖, 浓度分为 1 0 0 、 1 5 0 、 2 0 0 、 2 5 0 g L 4个水平; 硼酸和硝酸钙分别设为 1 0 0 、 2 0 0 、 3 0 0 m g L , 进行完全随机区组设计 , 9个水平。对照只加 2 0 0 g L蔗糖 1 2 2 超声波处理。选择超声波处理功率、 处理时间、 间隔 基金项 目 作者简介 收稿 日期 山西省 科技 攻 关项 目( 0 2 1 0 3 4) ; 山西 省农 科 院科研 项 目 ( Y G x o 1 ) 。 狄红梅( 1 9 8 0 一 ) , 女, 山西大同人, 助教, 硕士, 从事园艺技 术的教 学与研 究工作 , E ma i l : d h m x i x i 1 6 3 c o rn。 2 01 1 8 1 8 时间及处理次数 4个参数作为试验因素, 试验设计如下 : 超 声波工作时间和间隔时间均设 5 s , 处理次数 5次, 功率分别 设为 5 0 、 1 0 0 、 1 5 0 、 2 0 0 、 3 0 0 、 4 0 0 、 5 0 0 W, 进行单因素随机区组 设计, 7个水平 , 对照为不经超声波处理的花粉。确定合适的 超声波处理功率为 1 5 0 W, 工作时间和间隔时间分别设为 5 和 8 S , 处理次数分别设为 5次和 8次, 进行完全随机 区组设 计, 8个水平 , 对照为不经超声波处理的花粉。 1 2 3 花粉萌发率和破碎率的测定 。 2 8下暗培养 , 2 h后 在光学显微镜下观察花粉萌发和破碎情况。花粉萌发的标 准 : 花粉管长度超过花粉粒直径。各处理均重复 3次, 每处 理观察 5 个视野。计算其萌发率和破碎率并进行生物统计 ( 萌发率 = 萌发花粉数 总花粉数 1 0 0 , 破碎率 = 破碎花 粉数 总花粉数 1 0 0 ) 。 1 2 4 抗卡那霉素的浓度筛选。将供试种子灭菌后播于铺 有浸湿滤纸的培养皿中, 附加卡那霉素浓度分别为 0 、 1 0 、 2 0、 3 0 、 4 0 、 5 0 、 1 0 0 、 2 0 0 、 3 0 0 mg L , 2 5下光照培养, 根据子叶及 真叶颜色变化 , 确定卡那霉素抗性的筛选浓度。然后将超声 波处理得到的 种子在筛选得到的卡那霉素溶液中浸种催 芽, 萌发后观察子叶及真叶颜色变化, 进行抗性筛选。 2 结果与分析 花粉管通道法遗传转化率很大程度上依赖于质粒是否 进入花粉粒及花粉的萌发率。花粉破碎率过高会影响花粉 萌发, 而破碎率过低 , 质粒进入花粉的几率就会大大降低 , 影响结荚率。只有达到适宜的萌发率和破碎率, 才可兼顾萌 发率和质粒导入的要求。因此, 选择合适的缓冲液及超声波 处理参数是非常必要的。 2 1 缓冲液的选择 2 1 1 不同蔗糖浓度对花粉萌发的影响。试验表明, 不同 蔗糖浓度之间对大白菜花粉萌发均有显著性差异, 随着蔗糖 4 O 卷 3 期 秋红梅等超声波处理对大白菜花粉管通道法转基因的影响 1 3 0 5 浓度不断增大, 花粉萌发率先提高后降低。在蔗糖 浓度 为 1 0 0 g r,时, 花粉不萌发 ; 当蔗糖浓度为 1 5 o g L 时, 萌发率升 高至 9 5 0 ; 当蔗糖浓度增大到 2 0 0 g L时 , 萌发率达到最 大, 为2 7 8 8 ; 当蔗糖浓度增大到2 5 0 g L 时 , 花粉萌发率又 降低到 1 9 8 0 。因此 , 笔者选用蔗糖浓度 2 0 0 L以进一步 筛选。 表 1 不同蔗糖浓度对花粉萌发的影响 2 1 2 不 同硼酸和硝酸钙配比对花粉萌发的影响。 表 2 结 果表明, 蔗糖浓度 2 0 0 g L时, 不同硼酸和硝酸钙浓度配比 下 , 花粉萌发率差异显著。其中, 硼酸 1 0 0 m g L , 硝酸钙 2 0 0 L的配 比, 使花粉萌发率达到最大 , 为 5 9 7 0 , 与对照相 比, 差异达到显著水平。因此 , 笔者选择蔗糖 2 0 0 g L+ 硼酸 1 0 0 m g L + 硝酸钙 2 0 0 m g L的缓冲液进行超声波处理。 表 2不同浓度硼酸和硝酸钙配比对花粉萌发的影响 -I 3 B O 3 ( m L ) + 萌发率 -I 3 B O ( m g L ) + 萌发率 C a ( N O 3 ) 2 ( mg L ) C a ( N O3 ) 2 ( m V , L ) 1 0 0+l 0 o , 3 2 6 o a b 2 0 0+1 0 0 4 8 5 8 3 0 0+1 0 o 4 0 40 b e 1 0 0+2 0 0 5 9 7 0 a 2 0 0+2 0 0 4 6 0 7 a b 3 0 o+2 o o 4 7 2 7 1 0 o+3 o o 4 6 o 5 a b 2 c O+3 o o 4 7 07 3 0 o+3 o 0 4 3 0 1 a b C K 2 9 5 4e 注 : 表 中不同小写字母表不 2个数据间差异显著 。 2 2 超声波处理 2 2 1 处理功率。表 3 结果表明, 当超声波工作时间、 间隙 时间和处理次数 , 随着功率的增大 , 花粉的破碎率显著增高, 而花粉的萌发率下降。在超声波工作时间为 5 s 、 间隙时间 为 5 s 、 处理次数为 5次的条件下, 为确保花粉有 5 0 左右的 萌发率, 笔者选用功率 1 5 0 w 进行下一步试验。 2 2 2 不 同时间和次数超声波处理 的花粉萌发率及破碎 率。表 4 结果表 明, 在功率 、 间隔时间、 处理次数不变时 , 随 着工作时间的延长, 花粉萌发率降低, 破碎率升高 ; 在功率、 工作时间、 间隔时间不变时, 随着处理次数增加, 花粉萌发率 降低 , 破碎率升高。 为确保花粉有较适 宜的萌发率和破碎 率 , 笔者选用功率 1 5 0 w、 工作时间5 s 、 间隔时间 5 s 、 处理次 数 8 s 。 表 3 不同功率超声波处理的花粉萌发及破碎率 注 : 表 中不同小写字母表示差异显著。 表 4 不 同时间和次数超声波处理的花粉萌发率及破碎率 注 : 表 中不同小写字母表,下差异显著 。 2 3 卡那霉素筛选 。 2 3 1 不同浓度卡那霉素对大白菜生长发育的影响。表 5 结果表明 , 不同浓度卡那霉素对大白菜 4和 6 d 龄根长的生 长发育都有显著影响。卡那霉素浓度越大, 大 白菜根长越 短 , 说明卡那霉素会限制大白菜根 的生长。不同浓度卡那霉 素对大白菜萌芽率无显著影响, 这与扬广东等 和奚亚军 等 的结果相似。不同浓度卡那霉素对大 白菜 4 d龄下胚 轴的生长发育无显著影响, 而对 6 d 龄下胚轴的生长发育存 在显著影响。 卡那霉素浓度

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