基于电导率的酒精发酵过程在线监测.pdf

第 27 卷第 10 期农 业 工 程 学 报Vol.27No.10 2011 年10 月Transactions of the CSAEOct. 2011349 基于电导率的酒精发酵过程在线监测 李冲伟 1,2，宋瑞清1，宋永2，李宏涛2，孙庆申2 （1. 东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2. 黑龙江大学生命科学学院微生物省高校重点实验室，哈尔滨 150080） 摘要：为了探讨电导率在酒精发酵过程在线监测的适用性，对酒精发酵过程中电导率与还原糖、酒精度、pH 值的变化 规律以及氯化钙和硫酸铵 2 种盐类对电导率的影响进行了研究。结果表明：电导率与还原糖和酒精度之间存在着一定的 逻辑关系，即在电导率下降阶段，电导率随着还原糖的降低而下降，随着酒精度的增加而上升。利用电导率的测量值间 接地反映还原糖和酒精度的变化；同时，电导率达到最低点时，酒精度和还原糖均符合酒精发酵终点的参数指标，可以 据此确定酒精发酵的终点。pH 值与电导率之间存在着一定的线性关系（发酵 60 h 前变化规律相同） ；氯化钙和硫酸铵 2 种盐类在一定范围内对电导率的变化不产生影响。因此，试验成果可用于酒精发酵过程的在线监测和发酵终点的判定。 关键词：发酵，酒精，监测，电导率，终点 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2011.10.061 中图分类号：Q819文献标志码：A文章编号：1002-6819(2011)-10-0349-05 李冲伟，宋瑞清，宋永，等. 基于电导率的酒精发酵过程在线监测J. 农业工程学报，2011，27(10)：349353. Li Chongwei, Song Ruiqing, Song Yong, et al. Online monitoring alcoholic fermentation based on electrical conductivityJ. Transactions of the CSAE, 2011, 27(10): 349353. (in Chinese with English abstract) 0引言 发酵是酒精企业生产过程中最关键的环节，直接影 响到产品的质量，而残余还原糖量是酒精发酵过程是否 结束最主要的参考指标。发酵过程何时结束，何时将发 酵液送至蒸馏车间，一直以来，人们都是采用从发酵罐 取样，在实验室进行指标的检测来确定，属于离线检测， 这样不仅错过了最恰当的排放时间，延长了生产周期， 同时每 4 h 测定 1 次还原糖的工作，浪费了发酵液，增加 了人力、物力和财力的消耗1- 2。近年来，国内外许多研 究者致力于利用仪器观察发酵过程中的动态和判断发酵 终点3- 5。左月明等6设计了一种能温度自动补偿和电容 自动补偿的电导率。赵涤飞，赵长新等7通过建立电导 率与发酵过程几个重要参数的数学模型，从而通过电导 率监测实现发酵过程的控制。朱艳英，王明利等8通过 传感器测定酒精度和糖度的输出信号，从而在线测量糖 度和酒精度。Julie Paquet, Christophe Lacroix 等9人以电 导率作为一种分析奶酪酵母发酵过程中工具，取得良好 效果。 随着酒精发酵终点的临近，酵母细胞大量死亡，细 胞膜的透性增加，这是细胞膜系统被破坏的表现之一。 细胞膜上存在着电位差，这种电位差是由细胞膜系统来 维持的。细胞膜系统被破坏后，细胞膜透性发生改变， 收稿日期：2010- 10- 10修订日期：2011- 08- 05 基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目专项资助（11541280） 作者简介：李冲伟（1977） ，男，黑龙江哈尔滨人，讲师，在读博士，主 要从事微生物中活性物质的分离提取。黑龙江黑龙江大学生命科学学院， 150080。Email: xjwxn 通信作者：宋瑞清（1964） ，女，黑龙江哈尔滨人，教授，从事真菌的 开发与利用。黑龙江东北林业大学林学院，150040。 Email: songrq1964 细胞内的电解质渗漏导致发酵液中电导率的变化10- 11。 本试验旨在研究酒精发酵过程中电导率与还原糖之间的 规律，酒精发酵终点前后电导率的变化以及发酵过程中 几种常用盐离子对电导率的影响，为酒精发酵的在线监 测寻找一个新方法，从而有效地克服传统的离线监测滞 后带来的弊端。研究结果将为发酵过程在线监测的实现 提供参考。 1材料与方法 1.1材料 酿酒干酵母：购买自江苏安琪的活性干酵母。 玉米粉：市售玉米粉碎过 40 目筛 a- 淀粉酶 （酶活 3700U/g） 、 糖化酶 （酶活 10 万 U/g） ， 葡萄糖、酵母膏、氯化钙、硫酸铵、磷酸氢二钾、硝酸 钾、琼脂、三氯乙酸（TCA）均为分析纯试剂。 高速万能粉碎机 FW100（天津市泰斯特仪器有限公 司） 、超声破碎仪 JY92- IIDN（宁波新芝生物科技有限公 司） 、电导率仪 EC214（北京哈纳科仪科技有限公司） 、 瑞士比欧不锈钢 3 升发酵罐、原子吸收分光光度计（日 本岛津 AA6500） 、奥林巴斯光学显微镜（北京普瑞赛司 仪器有限公司） 1.2方法 1.2.1酒精发酵工艺条件 酒精发酵工艺条件依据酒精企业生产工艺：取 40 g 玉米粉，加水比为 3.5:1 mL/g，012 h 发酵温度是 30 32，1288 h 发酵温度是 3234，每次取样前振荡， 淀粉酶用量为 5.6 g/L， 液化条件为 60缓慢搅拌 30 min， 100缓慢搅拌 90 min，糖化酶用量为 334 U/g，糖化条 件为 601 h，pH 值 4.0，酵母接种量为 3%，发酵时间 90 h。 农业工程学报2011 年 350 1.2.2酒精发酵过程中电导率与还原糖和酒精度的关系 由于需要多次取样， 采用 3 L 不锈钢发酵罐。 从制备 好的糖化醪接入酒母发酵 0 h 开始，每 4 h 测量发酵液中 的电导率、还原糖含量和酒精度，并绘制发酵过程中三 者的变化关系曲线。 还原糖含量的测定采用 3,5- 二硝基水 杨酸法12。电导率利用电导率仪 EC214 测定。酒精度测 定采用蒸馏法。 1.2.3两种辅料对发酵过程电导率的影响 考虑到电导率变化与溶液中带电离子的数量有一定 的关系，而酒精生产过程中，由于工艺的要求，通常需 要添加氯化钙和硫酸铵 2 种常用辅料， 2 种常用辅料的添 加必然会引起发酵液中总离子质量浓度的增加。因此， 需要考察这 2 种物质的添加量对发酵过程中电导率影响。 等量称取 3 份 40 g 玉米粉于 250 mL 三角瓶中， 按加 水比 3.5:1 (mL/g)加入蒸馏水。在液化时，第 1 份加入氯 化钙为 1.2 g/L（A 样）；第 2 份加入氯化钙为 2.8 g/L（B 样）；第 3 份加入氯化钙为 4.2 g/L（C 样），其他工艺 同 1.2.1。同样等量称取 3 份 40 g 玉米粉于 250 mL 三角 瓶中，按加水比 3.51(mL/g)加入蒸馏水，液化和糖化工 艺同酒精发酵工艺条件。在酒精发酵初期，第 1 份加入 硫酸铵为 0.5 g/L（a 样）；第 2 份加入硫酸铵为 1.0 g/L （b 样）；第 3 份加入硫酸铵为 2.0 g/L（c 样），其他工 艺同 1.2.1， 无机盐添加量的选择参见张志亮等13的方法。 1.2.4数据处理 采用软件 SPSS 11.5 进行统计分析，差异显著性分 析采用 t 检验法。 2结果与分析 2.1酒精发酵过程中电导率与还原糖和酒精度的变化 规律 通过每 4 h 测定 1 次发酵液的电导率、 发酵液中还原 糖含量和酒精度，绘制了三者之间的变化关系曲线。 从图 1 可以看出，60 h 之前，随着发酵过程的进行， 电导率下降，酒精度上升，还原糖下降；在发酵 60 h 时， 电导率达到最低点， 酒精度达到 11.5%， 还原糖达到 1.433 mg/mL 的时候，然后电导率突然变大，呈现上升趋势。 从电导率的变化曲线，可以直接反映出发酵情况，发酵 液中酵母变小或者提前死亡，都会导致电导率变化趋势 图 1发酵过程中电导率、酒精度与还原糖的变化曲线 Fig.1Changes of electrical conductivity, alcohol content and reducing sugar during fermentation 发生改变。当电导率达到测量的最低点时，酒精度和残余 还原糖均符合离线检测酒精发酵终点的参数指标要求，这 意味着发酵已经基本结束，完全可以进入蒸馏阶段。 2.2不同添加量的氯化钙对发酵过程中电导率的影响 2.2.1不同氯化钙质量浓度与电导率之间的关系 氯化钙作为一种辅料添加到糖化醪中，将引起发酵 醪中离子含量的增加，引起电导率的变化。由图 2 可知， 电导率与不同质量浓度的氯化钙之间存在着良好的线性 关系，并随着氯化钙质量浓度的增加而增大。 图 2氯化钙浓度与电导率的关系曲线 Fig.2Relationships between CaCl2concentrations and electrical conductivity 2.2.2不同氯化钙添加量对发酵液中电导率的影响 通过在淀粉糊化时添加不同量的氯化钙，制备了 A、 B、C 三种糖化醪进行发酵，考察不同氯化钙质量浓度对 发酵过程中电导率的影响。 表 1 中，tAB=0.6526，tBC=1.6075，tAC=1.3196，查 t 分布表，当 f=14 时，t0.05, 13=2.1448，比较可知，tAB，tBC， tAC均小于 t0.05, 13=2.1448，说明 3 种方法测定结果的差别 无显著性，即在发酵过程中，一定范围内不同添加量的 氯化钙对电导率的影响较小；但发酵结束后测得 A、B、 C 三种发酵醪酒精度分别为 10 ，12 ，13 ，从而得出， 在 1.24.2 g/L 范围内随着氯化钙质量浓度的增加，发酵 液中酒精含量有所增加。 表 1氯化钙质量浓度对发酵过程中电导率的影响 Table 1Effects of CaCl2concentrations on electrical conductivity during fermentation 时间/ h A/ (ms cm- 1) B/ (ms cm- 1) C/ (ms cm- 1) 差值 DAB 差值 DBC 差值 DAC 83.153.193.26- 0.04- 0.11- 0.07 162.782.812.83- 0.03- 0.05- 0.02 242.512.572.61- 0.06- 0.1- 0.04 322.442.392.370.050.070.02 402.312.342.33- 0.03- 0.020.01 482.242.272.21- 0.030.030.06 522.212.192.20.020.01- 0.01 562.142.092.110.050.03- 0.02 602.112.082.10.030.01- 0.02 642.232.212.250.02- 0.02- 0.04 682.342.332.360.01- 0.02- 0.03 722.372.412.42- 0.04- 0.05- 0.01 802.512.532.54- 0.02- 0.03- 0.01 882.532.542.55- 0.01- 0.02- 0.01 注：A 样为 1.2g/L 氯化钙，B 样为 2.8 g/L 氯化钙，C 样为 4.2 g/L 氯化钙。 第 10 期李冲伟等：基于电导率的酒精发酵过程在线监测 351 2.3不同添加量的硫酸铵对发酵过程中电导率的影响 2.3.1不同质量浓度硫酸铵与电导率之间的关系 不同质量浓度的硫酸铵溶液和电导率之间的关系如 图 3。 不同质量浓度的硫酸铵溶液与电导率存在着良好的 线性关系，并随硫酸铵浓度增大而增大。 图 3硫酸铵质量浓度与电导率的关系 Fig.3 Relationships between (NH4)2SO4concentrations and electrical conductivity 2.3.2不同硫酸铵添加量对发酵液中电导率的影响 通过添加不同量的硫酸铵， 制备 a、 b、 c 3 种发酵醪， 考察不同硫酸铵添加量对发酵过程中电导率的影响。 表 2 中，tab=0.5732，tbc=2.0012，tac=1.8219，查 t 分 布表，当 f=14 时，t0.05, 13=2.1448，比较可知，tab，tbc，tac 均小于 t0.05, 13=2.1448，说明 3 种方法测定结果的差别无 显著性，即在发酵过程中，不同添加量的硫酸铵对发酵 液的电导率影响较小，但是对发酵结束后酒精含量有一 定的影响，a、b、c 三种发酵醪的酒精度分别为 10 ，11 ， 9 ， 从而得出， 在一定范围内随着硫酸铵质量浓度的增加， 酒精产量有所上升，但硫酸铵质量浓度超过 1 g/L 时，酒 精产量反而呈下降趋势。 表 2硫酸铵质量浓度对发酵过程中电导率的影响 Table 2Effects of concentrations of ammonium sulfate on electrical conductivity during fermentation 时间/ h a/ (ms cm- 1) b/ (ms cm- 1) c/ (ms cm- 1) 差值 Dab 差值 Dbc 差值 Dac 83.183.123.260.06- 0.14- 0.08 162.832.792.860.04- 0.07- 0.03 242.572.512.620.06- 0.11- 0.05 322.412.432.36- 0.020.070.05 402.342.322.330.02- 0.010.01 482.282.242.250.04- 0.010.03 522.162.222.26- 0.06- 0.04- 0.1 562.132.142.13- 0.010.010 602.062.112.11- 0.050- 0.05 642.222.242.27- 0.02- 0.03- 0.05 682.352.352.370- 0.02- 0.02 722.392.382.430.01- 0.05- 0.04 802.552.562.53- 0.010.030.02 882.532.522.560.01- 0.04- 0.03 注：a 样为 0.5 g/L 硫酸铵，b 样为 1.0 g/L 硫酸铵，c 样为 2.0 g/L 硫酸铵。 2.4发酵终点时电导率突变的原因分析 在酒精发酵过程中，当残余还原糖接近 0.2%时，电 导率突然停止下降，反弹回升，这可能是由于发酵液中 离子浓度的增加所引起的，为了进一步证明电导率上升 和细胞膜系统的相互关系，做了 3 方面的试验。一是研 究细胞死亡后对电导率的影响。细胞死亡后，随着细胞 的自溶，细胞膜的通透性增加，细胞内外渗透压要逐渐 趋于平衡，会导致发酵液中离子含量增加。为了验证这 一假设，对细胞进行人为破碎，观察细胞破碎前后发酵 液中电导率的变化。采用化学渗透法14。二是考察电导 率变化前后 H 含量的变化。 每 4 h 测量 1 次电导率和 pH 值，pH 值测量采用酸度计，并绘制 pH 值与电导率的关 系曲线图15。三是利用原子吸收分光光度计测定电导率 突变前后发酵液中重要离子的含量变化。 2.4.1发酵过程中电导率最低点前后细胞形态 从显微镜下观察发酵 56 h（电导率最低点前 4 h）和 64 h （电导率最低点后 4 h） 的细胞形态， 如图 4a 和图 4b， 可以看出，发酵 56 h 细胞还比较饱满，大小均一，还有 部分出芽；相比之下，发酵 64 h 细胞大小不一，略有拉 长，细胞死亡较多，但并没有看到细胞壁有变化，这是 由于细胞壁的溶解需要更长的时间。 a. 56 h 细胞形态b. 64 h 细胞形态 图 4酵母细胞形态（放大 400 倍） Fig.4Yeast cell morphology after fermentation ( 400 times) 我们从 3 种人工破碎细胞的方法中优选了化学渗透 法三氯乙酸（TCA）处理。处理 30 min 来改变细胞 壁的通透性，预使细胞内的离子大量释放，引起发酵液 电导率的上升。发酵液处理前电导率 3.94 ms/cm，处理 30 min 后，电导率是 5.98 ms/cm，经过制片，镜检观察， 没有处理前的细胞数较多且完整，破碎处理后的细胞明 显变形。 2.4.2发酵过程中 pH 值与电导率的关系 在发酵过程中， 每 4 h 测量 1 次发酵液的电导率和 pH 值，绘制电导率与 pH 值的变化曲线。由图 5 可知， 随着发酵的进行，pH 值随电导率的下降而降低，在发 酵进行到 60 h 附近，电导率下降到最低点，pH 值也随 之下降到最低；60 h 后电导率突然升高，说明发酵液 中离子含量增加，可以看出 H 含量也发生了改变，溶 液中 H 含量在增加， 至于这部分 H出处还有待于进一 步研究。 农业工程学报2011 年 352 图 5发酵过程中 pH 值与电导率的变化关系 Fig.5Relationships between pH values and electrical conductivity 2.4.3电导率突变前后发酵液中 4 种主要离子质量浓度 的变化 利用火焰法原子吸收分光光度计测定电导率突变前 后发酵液中 K+、Ca2+、Na+、Mg2+4 种离子质量浓度的变 化，测定结果如表 3。 表 3电导率突变前后对应 4 种离子质量浓度的变化 Table 3Changes of four kinds of ion contents before and after burst of electrical conductivity 离子波长/nm火焰 发酵 56 h 质量 浓度/(mg L- 1) 发酵 64 h 质量 浓度/(mg L- 1) K+766.49空气- 乙炔1095.5418.75 Ca2+422.70空气- 乙炔2.5430.925 Na+589.59空气- 乙炔8682.5790.05 Mg2+285.25空气- 乙炔1.040.415 从表 3 数据可以看出，在发酵过程即将结束，即电 导率突变前后（正常发酵在 60 h 左右），发酵液中 K+和 Na+的质量浓度存在着较大的变化，其原因与细胞膜上的 离子泵输送能力遭到破坏有关，细胞内外原有的由各离 子构成的渗透压消失，由此可以推断，发酵液中电导率 的突然上升是由大部分细胞的死亡造成的，这样，通过 监测发酵液中的电导率的改变可以确定发酵结束的时 间。 2.5成本分析 采用该方法判断酒精发酵的终点，可以节省实验室 每 4 h 取样浪费的原料， 使酒精企业的生产成本投入降低 5%，增加企业的年利润 4%。而且，以电导率作为测量工 具，设备造价低，收效显著，具有广阔的应用前景。 目前，该成果在间歇酒精发酵生产中已经应用成功， 每发酵罐至少可以节省 15L 发酵醪，若以年产 10 万 t 酒 精厂（每个发酵罐 200 m3发酵醪酒精质量浓度平均按 11.5%计），每天至少可多产酒精 0.3 t。这一结果在今天 激烈的市场竞争和环境保护等方面，都具有非常重要的 意义。目前，对于连续酒精发酵的生产还需进一步研究。 3结论 1）从电导率与还原糖质量浓度和酒精度之间的试验 得出，发酵过程中三者的变化存在一定的逻辑关系，即 电导率的变化过程可以间接反映还原糖和酒精度的变化 趋势。 2）从电导率与还原糖质量浓度和酒精质量浓度之间 的变化曲线可以看出，当电导率达到最低点时，参余还 原糖质量浓度和酒精度均达到发酵结束时的指标要求， 可以此作为酒精发酵的终点，即从电导率曲线上就可以 确定发酵终点。 3）发酵终点前后发酵液中 4 种主要离子质量浓度的 变化，可以看出，发酵液中离子的质量浓度存在着明显 减少的变化趋势，K+减少了 61.78%，Na+减少了 91%， Ca2+减少了 63.6%，Mg2+减少了 60.1%。从细胞生物学角 度来讲， 4 种离子质量浓度的变化趋势与细胞内外离子质 量浓度并不相符，电导率下降上升的原因还有待于进一 步研究。 参考文献 1李冲伟，宋永，李燕利，等. 野生葡萄酒酵母的选育及其 发酵过程中电导率的研究J. 食品工业科技，2008，9： 7173. 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