阿维菌素发酵染菌问题的探讨.pdf

第4 6 卷第 l 0 期 至 科技与开发 农 药 AGR0CHEM I CALS 、 bI 4 6 NO 1 0 oc t 2 0 0 7 阿 维 菌 素 发 酵 染 茵 问 题 的 探 讨 昔 雪 菊 郝 常 明 ( 1 济宁职业技 术学 院 山东 济宁 2 7 2 0 0 0 ；2 山东胜利生 物T程有 限公 司 ， 山东 济 宁 2 7 2 0 7 3 ) 摘要 ： 从染菌的时间、 类型 、 范围i方面探讨了阿维菌素发酵染菌的原因， 提出了发酵过程中杂菌的检查方 法， 分别从菌种制备 、 空气净化、 培养基灭菌 、 管路配置 、 系统死角清理等方面明确了防止发酵染菌的措施， 得 丁斜面菌种 、 种子罐 、 发酵罐不同时期染菌后的补救措施 j 关键词 ： 阿维菌素 ； 发酵 ； 染 菌； 原因分析 ； 检查方法 ； 防止补救措施 中图分类号： T Q4 5 3 5 文献标志码： A 文章编号： 1 0 0 6 - 0 4 1 3 ( 2 0 0 7 ) 1 0 - 0 6 5 9 - 0 4 E x p lor i n g o f Ba c t er i a l i n f e c t i o n i n Av e r me c t i n F e r me n t a t i o n H U A N G X u e - j u ， H A O C h a n g - m in g ( 1 J i n i n g Vo c a t i o n a l T e c h n o l o g y Co l l e g e ， J i n i n g 2 7 2 0 0 0， S h a n d o n g ， Chi n a ； 2 S h a n d o n g S h e n g l i Bi o e n g i n e e r i n g Co ， Lt d ， J i n i n g 2 7 2 0 3 7 ， S h a n d o n g ， Ch i n a ) Abs t r ac t ：Th e c a u s e of i n f e c t i on i n t he pr o c e s s o f a v e r me c t i n pr o du ct i o n wa s s t udi e d f r om i n f e c t e d t i me ， s c o pe a nd ba c t er i a l t y pe The t e s t me t h od t o c h e c k t h e i nf e c t i on c a us e d b y ot h e r b a c t e r i a wa s a l s o r a i s e d Th e wa ys t o pr e v e nt i nf e c t i o n wa s a s c e r t a i ne d f r om p r e pa r a t i o n o f mi c r o bi a l s t r a i n， a i r p urific a t i o n ，me d i u m di s i nf e c t i o n，d u c t wo r k de pl oy me n t a n d s y s t e ma t i c d e a d a n g l e c l e a n i n g Me a n w h i l e ， a d j u s t me n t me a s u r e w a s s u mma r i z e d i n d i f f e r e n t i n f e c t e d p e ri o d s u c h a s mi c r o bi a l s t r a i n，s e e d po t a nd ye a s t i ne s s Ke y wo r ds ：a v e r me c t i n； f e r me n t a t i o n；i nf e c t i on； a na l y t i ca l r e a s o n； de t e c t i o n me t h o ds ； pr e v e n t i ve me a s u r es an d r e me di a b l e me a s u r e s 阿维菌素( a v e r t m e c t i n s ) 是由日本北里大学大村智等和 美国Me r c k 司开发的具 有杀虫 、 杀螨 、 杀线虫活性的十 六元大环内酯类抗生素， 是阿维菌素A组分与B组分的混 合物 ， 由灰色链霉放线 菌经发酵产生 。 由于其具有广 谱 、 高效 、 抵御抗性 、 持效期 长 、 对动植物 安全 、 在光照 条件下或在土壤微生物作用下迅速降解成无活性的化合物 等特点 ， 其分子碎片最终作为碳源被植物和微生物分解利 用 ， 因此阿维菌素作为一种新型抗生素 ， 已经成为农用和 兽用的高效生物源杀虫剂 。 。其衍生物已商品化 的有伊 维菌素( i v e r me c t i n ) 、 埃玛菌素( e ma me c t i n ) 、 道拉菌素 ( d o r a me c t i n ) 、 埃珀利诺菌素( e p r i n o me c t i n ) 和色拉菌素 ( s e l a me c t i n ) 。 阿维菌素发酵要求纯种培养 ， 不仅斜面 、 种子 、 培养 基 以及发酵罐 、 管道等须经严格消毒除去各种杂菌 ， 而且 通人的空气也需经过无菌处理 ； 并需保持机械搅拌系统 、 发酵废气排放系统 、 补料和取样 系统的无菌操作 。只 有这样 ， 才能确保生产不受杂菌污染 ， 从而保证生产菌的 旺盛生长 。发酵染菌能给生产带来严重危害 ， 轻者影响 产量或产品质量， 重者导致倒罐 ， 甚至停产 ， 防止杂菌污 染是阿维菌素发酵l丁厂的一项重要工作内容。本文结合 企业实际生产情况 ， 谈谈阿维菌素发酵染菌原因的分析 、 检查方 法 、 防止措施和染菌后 的补救 措施 。 1 阿维菌素发酵染菌原因的分析 1 1根据染菌的时间分析 早期染菌 ， 很可能是 由于种子带杂菌 ， 操作不 当， 培 养基或设备灭菌不彻底所致； 中后期染菌， 多数是 由于空 气系统带人 、 设备渗漏 、 中间补料或取样操作不当等原因 引 起 的 。 1 2根据染菌的类型分析 染有耐热性芽孢杆菌 ： 多数是 由于培养基灭菌不彻底 或设备存 在死角 所致 。 染有 小球菌 、 酵母 菌等不耐热 菌 ： 主要是空气过滤系统不严 ， 阀门渗漏 ， 蒸汽冷凝水进 入等原 因。染有霉菌 ： 多数是由于灭菌不彻底或无菌操 作不 严所 致 。 1 3根据染菌的范围分析 1 3 1 大批发酵罐均发生染菌 若发生在早期 ， 很可能是 由于种子带杂菌所引起 。若 发生在 中后期 ， 且污染的是同一种菌 ， 很可能是空气系统 除菌不严 ， 过滤效率低 ， 空气带菌所致 ； 或者中间补料系 统 、 油( 消沫剂) 管路系统发生问题所造成的。通常同一产 品的几个发酵罐其补料系统往往是共用的， 倘若补料灭菌 不彻底或管路渗漏， 就有可能造成这些罐同时发生染菌现 收稿 日期： 2 0 0 6 1 2 - 2 5 ， 修返日期 ： 2 0 0 7 0 4 1 0 作者简介 ： 黄雪菊( 1 9 6 6 一 ) ， 女 ， 山东嘉祥人 ， 副研究员， 硕十， 从事生物农药研究。T e l ： 0 5 3 7 2 2 8 4 9 7 9 E - ma i l 维普资讯 6 6 0 农 药AG R O C HE M1 C AL S 第4 6 卷 象。 另外 ， 采用培养基连续 灭菌系统时 ， 那些用连续灭 菌进料的发酵罐都 现染菌， 可能是连消系统灭菌不彻底 所造 成 的 。 1 3 _ 2 个别发酵罐连续发生染菌 多数是由于设备 问题造成的 ， 如阀门的渗漏 、 罐体的 破损或法兰垫片老化等所引起。设备的腐蚀磨损所引起 的染菌会“ i 现每批发酵的染 时间向前推移的现象： 1 3 3 个别发酵罐偶 尔染菌 个别发酵罐偶尔染菌的原因最为难查 ， 各种染菌途径 都可能引起。女 接种 、 刮斜 面制备菌悬液等操作过程无 菌控 制不好 ， 培养基 、 设备 、 管道灭 菌不彻底等 ， 均可使 单个罐发酵 失败 。 2 阿维菌素发酵染菌的检查方法 检查杂菌的方法要求准确可靠和快速 ， 这样才能在短 时间内发现阿维菌素发酵过程是否污染杂菌 ， 分析染菌的 原因与途径。 目前生产上常用的检查方法有显微镜检查 法” 、 平板划线检查法 、 肉汤培 养检查法 。 2 1显微镜检查法 2 1 1 取 样 取样 口预先用蒸汽充分灭菌 ， 再取无菌的空 角瓶， 于取样 口取样， 取样时防止阿维菌素发酵液溅到棉塞上， 取样后迅速 塞上棉 塞： 2 1 _ 2 观察 可直接涂于载玻片上观察菌种的形态特征， 应在菌液 未十前观察 ， 若发现与发酵菌丝不 形态的微小球菌 、 不 动长杆菌 、 游动杆 菌等 ， 说明已感染杂菌 ； 也 可用染色涂 片法进行制片观察 ， 常用的染色液有石炭酸复红液 、 结晶 紫液 、 美蓝 液 、 刚果红 染液 、 路格 碘液 等 。 2 _ 2 平板划线培养检查法 2 - 2 1 培养基 培养基为营养琼脂( 琼脂 、 蛋 白胨 葡萄糖 、 牛 肉膏 、 酵母膏 、 氯化钠 ， p H 7 2 7 4 ) ， 将其配好后1 2 1 o C 湿热灭菌 2 5 3 0 mi n， 然后冷却 11 4 5 5 0 o c倒入培养肌 ， 冷却后 置于3 7恒温箱内无菌培养2 4 h ， 挑m无菌落 现的平 板 备 用 。 2 2 2培养观察 将要检查 的样品划线接种 ， 置于3 7 q C 恒温箱内培养 2 4 h 后观察 。如发现有霉菌 ， 黄色 、 白色等非无色透明有 粘连性的菌落 现 ， 说 明已染菌 。 2 3 肉汤培养检查法 2 3 1培养基配制 将 培 养 液 ( 蛋 白 胨 、 牛 肉膏 、 氯 化 钠 、 葡 萄 糖 ， p H 7 2 7 4 ) 倒入 角瓶内， l 2 1 湿热灭菌2 5 3 0 mi n ， 冷 却 备 用 。 2 3 2 培 养 将i角瓶置于3 7 摇床 ， 振荡士 ； 养2 4 h ， 若无浑浊， 即可用于空气无菌检查 2 3 3 无菌检查 在确 保无菌条件下 ， 将空气 引入瓶内 ， 也可 连续 通 气 ， 然后于 3 7 q C 振荡培养 ， 观察有无浑浊现象发生 ， 若 现 浑浊 ， 则说 明空气带 芮 ： 以上 3种 方法各 有优缺 点 ， 微镜 检查法 简便 、 快 速 ， 能及时发现杂菌 ， 但由于镜检取样少， 视野的观察面 也小 ， 因此 不易检 H J 早期杂菌 。平板划线法 的缺点是需 经较长时间培养( 一般要过夜) 才能判断结果 ， 且操作较繁 琐 ， 但它要比显微镜检查法能检 更少的杂菌 一般情 况下 ， 斜面种 子 、 摇 瓶 、 种子罐 、 发酵罐的菌液常用镜检 配合平板划线检查 ； 对于无菌空气 ， 常用 肉汤培养检查。 3 阿维菌素发酵染菌的防止措施 3 1防止菌种带菌 优 良的菌种是保证生产 常进行的关 键 ， 在菌种纯 化 、 复壮 、 优选 、 扩大培 养过程 中， 应严 格控制 ， 确保无 杂菌污染。斜面种子制备过程中， 如果存在母( 子) 斜面培 养基灭菌不彻底， 或菌种操作人员在局部1 0 0 级的无菌室 中进行母( 子) 斜面接种及制备种子悬液时无菌操作不规 范 ， 或斜面种子培养环境不洁净等现象 ， 就会造成斜面种 子带菌而导致种子罐染菌 。 根据种子制备丁艺 、 种子罐体基本结构及放线菌的特 性 ， 笔者在阿维菌素生产过程中摸索出预防为主、 突出关 键操作 、 重在 T艺和环境管理 的解决方法 。 3 1 1 预 防 为主 从保藏菌种到一级罐种子 ， 操作环节多， 参与操作的 人员 也多 ， 一旦染菌 ， 不易查找染 菌原 因 要想从根本 上消除染菌 ， 只有采取预防为主的办法 ， 树立 全员无菌意 识 ， 杜绝操作失误 和技术管理 不善引起 的染菌。 根据无 菌要求 、 设备特征和灰色链霉放线菌特性 ， 制定科学的岗 位S OP， 并严格 落实。 3 1 _2 严格控制关键操作 一 级种子制备过程中的各环节的操作人员技术是否过 硬 ， 对防止种子罐染菌具有非常重要的意义， 尤其是斜面 种子 、 一级种子制备的操作人员 ， 需要具备深厚的理论基 础和丰富的实践经验 。 斜面种子制备需要解决的关键技术问题 ： 菌种制备过 维普资讯 第 l 0期 黄青菊 ， 等 ： 阿维菌 素 发酵染菌 问题 的 _ 鱼 璺 I 程中首先要保证配制的培养基没有较大颗粒 ， 培养基灭菌 时要保 证蒸汽流动 ， 并做到压力计和温度计的准确一致 性 ， 防止假 形成 。 为防止灭 菌后培 养基二 次染 菌， 应 尽量做到培养基即灭菌即使用。无菌操作时保证无菌窒 前彻底灭菌 ， 所 器具不带菌 。操作时无菌物 品在上 风处 ， 带菌( 或可能带 芮) 物 品在 卜J 处 ； 操 作人员少说 话 ， 避 免咳嗽 、 打 喷嚏 及其他大 幅度动 作 。 一 级种子接种( 零磅按种) 时需要解决 的关键技术 问 题 ： 接 种前关 闭 一级种子罐 】 窗 ， 使用消毒液( 如过 氧 乙酸) 喷雾 灭菌； 打开接币 叶 帅 冒 前要 7 5 的酒精擦拭按种 帽。接种时倒种速度要快 ， 并保证种子瓶和接种 口处于 火焰保护之 F； 接种过程中排风阀门应天 才 j ， 同时向罐内 少量通 入无 菌风 ， 维 持 压 ? 3 1 3 加强工艺管理 、 固定操作人 员 种子制备过程巾关键环节的环境洁净度不够以及操作 人员更换频繁 、 配合不熟练和责任心不强等是造成一级种 子罐染蔺牢偏高的主要原 虽然有 岗位S O P ， 但每个人 的操作手法存 在细微差别 ， 这是在长期 T作 中 自然形成 的， 不易察觉和改变， 而某些不规范 的操作很容易导致染 菌 ， 再加上操作人员不是6 占 j 定搭配 ， 操作项 目也不固定 ， 往往使这种隐患暴露不f 来 ， 染菌后也 分析不 真正原 太 l 此 ， 应加 强操作 的 专、 化 ， 即在斜 面种 子制备 、 一 级种子无菌培养基制备和接种 个环节中应L 古 l 定操作人 员和操 作内容 ， 实行 条龙操作管理 。 3 1 4 加强环境管理 无苘室管理 ： 无菌室属局部 1 O 0 级 沽净区 ， 其管理除 按照GMP 有关 洁净 区的要求进行外 ， 还应做到两方面 ： 一 是每次无菌室使厢后用紫外线照射3 0 mi n ， 并用0 1 的 新洁尔灭及过氧乙酸等消毒液对环境及物品消毒 ； 二是每 隔一定时问对无菌室进行甲醛+高锰酸钾熏蒸 。 斜面培养问管理 ： 斜面培养间是母( 子) 斜面培养的场 所 ， 在培养过程中瓶塞上往往会附着尘埃 ， 而在接种 、 刮 斜面制备菌悬液等无菌操作过程中拔瓶塞时 ， 灰尘很容易 落进瓶 内， 造成种子带菌。 要想实现斜面种子无 杂菌 ， 保持斜面培养问的清洁是非常关键 的。应当把斜面培养 间当作亚无菌区进行管理 ， 每 日坚持用于净湿抹布擦拭斜 面培养问的地面及墙面； 在充分消除对培养种子影响的情 况下定期用消毒液如0 1 的新沽尔灭 、 5 来苏尔等对斜 面培养问进行消毒 ； 定期用 紫外线 照射 消毒。 一 级种子罐区环境管理 ： 目前常用压差接种法和零磅 接种法进行一级种子罐接种 。 当采用零磅法接种时 ， 由 于罐压瞬时为零 ， 外界空气就有可能从设备的泄漏处( 如 轴封等) 及接种 口进入罐内造成染菌。因此 ， 保持一级罐 接种 区的洁净度也是减少染 菌的有效方法 。应 当做到 ： 一 级种子罐最好有单独的区域同其他生产区隔离 ； 保持一 级种子罐区的环境卫生 ， 一级种子罐区门窗 日常应处于密 闭状态 ， 每次接种前3 0 mi n 消毒液喷雾消毒； 环境定期 片 j 8 1 0 m L m 甲醛和4 5 g m 高锰酸钾熏蒸消毒1 2 - 1 6 h 。 3 2防止空气带菌 阿维菌素发酵需连续不断地通入大量无菌空气 ， 所以 过滤介质的效能与染菌有直接关系。应定期打开空气过 滤系统中所有设备的排 污阀， 及时排掉水 、 油等污物 ， 以 免影响空气除菌效果。 严格按操作规程 ， 定期对无蔺空 气系统进行彻底灭菌 。在罐体灭菌结束后降温通入空气 的切换过程 中， 一定要使无菌空气的压力高于种子罐 、 发 酵罐 的罐 ， 以防止培养液倒流进入空气过滤系统 。 对 种子罐和发酵罐进罐之前的空气管道上安装的罐前高效过 滤器 ， 应当使用尘埃粒子计数器等检测仪器和生物鉴定方 法义 寸 过滤器是否失效进行准确 、 及时的判断， 并根据检测 结果适时对 高效过滤器滤芯进行更换 。 3 3 防止培养基灭菌不彻底 阿维菌素培养基颗粒过大会导致灭菌不彻底 ： 培养基 配制时应充分搅拌 ， 并在输料管道上安装管道过滤器 ， 以 防止 大颗粒 固形物进入种子罐造成培 养基灭 菌不彻底。 投料前 ， 应将无机盐等块状物预先溶好再投入罐 内， 而淀 粉 、 高温淀粉酶 、 酵母 粉 、 酵母膏等投料后 ， 应将罐 内壁 及各 附件上附着物冲洗到料液中， 避免罐内壁或附件上形 成 堆 积 物 。 灭菌过程产生泡沫导致灭菌不彻底 ： 阿维菌素培养基 中含有较多的黄豆饼粉， 存灭菌生温至9 0左右时容易产 生泡沫， 泡沫严重时会顶罐甚至逃液 ， 此时灭菌操作较 f 4 难 ， 不易灭透 。 所以应在培养基 巾加消泡剂 ， 或在操作 上予 以控制 消除产生的泡沫 ， 彻底 灭菌。 培养基灭 菌操作不到位导致灭菌不彻底 ： 阿维菌素培 养基在灭菌过程中 ， 对预热时间 、 蒸汽阀门的开度 、 灭菌 温度 、 灭菌 力等 ， 都有严格要求 ， 一个环节 现 问题 ， 就容 易导致染菌。保证灭菌温度与罐 相一致 ， 如温度 在1 2 1 1 2 3， 罐 应在o 1 1 o 1 3 MP a 。灭菌开始时， 将罐 内冷空气及低温的二 次蒸汽排除干净 ； 当罐温达到 1 O 0 o c， 几路同时进蒸汽时 ， 合理调整各路的进汽阀， 保 证与培养基相接触的管道大进蒸汽， 与培养基不接触的管 道小进蒸汽 ， 防止出现假压， 确保各路进 汽口的蒸汽有足 够的压力 ， 保持3 0 mi n 以上的灭菌时间， 充分灭菌 。灭 菌结束后 ， 立即关 闭所有阀门 ， 及时通入无菌空气保 ， 防止因罐 内蒸汽冷凝形成负压而吸气染菌 。 3 4 合理配置管路、 彻底消除死角 发酵设备流程及管线应力求简单 ， 尽量缩短输送距 离 ， 不得有多余的管道和阀门， 并注意每个罐应设有独立 维普资讯 6 6 2 农 药AG R O C HE MI C A L S 第4 6 卷 的排气 、 下水管路 ， 避免相互影响 ； 罐体和有关管路应有 利于蒸汽进行灭菌 ； 对于接种 、 取样 、 补料 等操作管路要 有单独的灭菌系统 ， 以便在发酵罐灭菌后或发酵过程中单 独 进行 灭菌 。 死角是微生物隐藏而蒸汽难于消毒的位置 ， 是杂菌感 染 的主要部位 。消灭管路死角 ， 管件连接尽量采用焊接 连 接法 ， 但 焊缝必须 光滑 ， 转 弯处应 保持一定 的弧度 。 消灭罐体 死角 ， 设 法使罐 内焊缝光滑 ， 法兰垫 片不宜过 大或过小 ， 定期清除罐内的积垢 ， 防止罐底 污垢 积聚形 成死角。除注意加强发酵罐 的清洗外 ， 还应降低移液管 高度及适 当降低搅拌桨 叶的安 装高度 ， 避免罐底积垢 。 此 外 ， 还 应注意 消除 阀门 、 法兰连接 等的死角 ， 垫 片安 装要适 中 ， 温度计 、 p H探头插座焊接要光滑 ， 不 得存在 死 角 。 4 阿维菌素发酵染菌后的补救措施 4 1斜面染菌 如是斜面菌种即已染菌 ， 则将此批斜面菌种处理掉 ， 重新选用优良的斜面菌种进行接种 。 4 2 种子罐染菌 若 在种子罐染菌 ， 则不论前期还 是后期 ， 都 应立 即 实罐灭菌后倒罐 。因为此时若仍继续培养 ， 只会让杂菌 占据优势并几乎导致 1 0 0 的发酵失败 ， 给生产造成更大 的 损 失 。 4 3发酵罐前期染菌 4 3 1发酵前期轻度染茵 根据所染菌型 的不同及各种菌 型的适宜生长环境 ， 表1 给出了部分菌型生长最适温度 、 p H及致死温度 、 致死 时间范同。结合阿维菌素发酵菌 的适宜生长条件 ， 采取 调整发酵温 度 、 搅拌 转速 、 通 气量 、 P H等措施 ， 从而抑 制杂菌的生长繁殖 ， 确保阿维菌素发酵菌的生长优势 ， 使 发酵转入正常后再恢 复常规的培养条件。也可补加部分 培养 液 ， 重新 实罐 灭菌 ， 然后 重新接 种 。 表1 部分菌型生长最适温度 、 pH及致死温度、 致死时间范 围 4 3 _ 2发酵前期 出现严重染茵 若发酵液 中营养成分仍较高 ， 先实罐灭菌 ， 待温度降 到发酵温度后重新接种发酵； 若发酵液营养成分较低， 补 加培养液 ， 进行实罐灭菌 ， 重新接种 ； 若发酵液营养成分 很低 ， 无 法补救 ， 则实罐 灭菌后 倒罐 。 4 4发酵中后期染菌 4 4 1发酵 中后期轻度染菌 适 当调整发 酵温度 、 搅拌转 速 、 通 气量 、 P H等 ， 加 强 发酵操作管理 ， 适 当提 前放罐。 4 4 _ 2发酵 中后期严重染菌 若发酵液 粘度达到一定要求 ， 残余碳 、 氮源 已经不 多 ， 则应立 即放罐 ， 以免进一步恶化 ， 造成更大损失 ， 并 对 空罐进 行彻 底的清洗 ， 灭菌 ； 如果染菌后发酵液中的 碳 、 氮源还较多 ， 提早放罐会影 响后处理 ， 导致过滤 、 浸 提 困难 ， 产品质量不合格 ， 此时应先设法使碳 、 氮源消耗 后 ，