苦瓜提取物中降血糖皂甙的筛选.pdf

第2 7 卷第3 期 2 0 0 8 年5 月 食品与生物技术学报 J o u r n a lo fF o o dS c i e n c ea n dB i o t e c h n o i o g y V 0 1 2 7N o 3 M a y 2 0 0 8 文章编号：1 6 7 3 - 1 6 8 9 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 0 4 5 0 5 苦瓜提取物中降血糖皂甙的筛选 石雪萍1 ，姚惠源2 ，张卫明1 ( I 南京野生植物综合利用研究院，江苏南京2 1 0 0 4 2 ；2 江南大学食品学院，江苏无锡2 1 4 0 3 6 ) 摘要：苦瓜皂甙经过提取，正丁醇和乙酸乙酯萃取，把苦瓜提取物按照极性分为3 个组分，分别 为：乙酸乙酯相( M C E A ) ，正丁醇相( M C E B ) 和水相( M C E C ) 。动物实验表明，对正常小鼠和糖 尿病小鼠，M C E - B 具有较显著的降血糖作用，而M C E - A 和M C E - B 降糖效果不明显。组分分析表 明，苦瓜正丁醇萃取相含有4 5 5 1 的皂甙成分。 关键词：苦瓜；降血糖；皂甙；筛选 中图分类号：T S2 0 2 。S6 4 2 5文献标识码：A S c r e e n i n go ft h eH y p o g l y c e m i cS a p o n i n sf r o m t h eM o m o r d i c aC h a r a n t i aL E x t r a c t S H IX u e - p i n 9 1 Y A OH u i y u a n 2 Z H A N GW e i r u i n 9 1 ( 1 N a n j i n gI n s t i t u t ef o rC o m p r e h e n s i v eU t i l i z a t i o no fW i l dP l a n t ，N a n j i n g2 1 0 0 4 2 。C h i n a ；2 S c h o o lo ff o o dS e i e n c ea n dT e c h n o l o g y ，J i a n g n a nU n i v e r s i t y ，W u x i2 1 4 1 2 2 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：I nt h i sm a n u s c r i p t ，t h r e ef r a c t i o n sw e r eo b t a i n e df r o mt h ee t h a n o le x t r a c to fm o m o r d i c a c h a r a n t i aL a c c o r d i n gt ot h ep o l a r i t y T h e nt h e h y p o g l y c e m i ca c t i v i t y t e s to ft h e s e t h r e e f r a c t i o n sw e r ec a r r i e do u to nt h en o r m a Ia n dd i a b e t i cm i c e T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h en b u t t a l f r a c t i o n ( M C E B ) h a ds i g n i f i c a n th y p o g l y c e m i ce f f e c to nt h en o r m a la n dd i a b e t i cm i c e T h e c o m p o s i t i o na n y s i ss h o w e dt h a t4 5 51 s a p o n i n se x i s t e di nt h i sf r a c t i o n K e yw o r d s ：M o m o r d i c ac h a r a n t i aL ；h y p o g l y s c e m i c ；s a p o n i n s ；m i c r o p o r o u sa b s o r p t i o nr e s i n 苦瓜( M o m o r d i c ac h a r a n i aL ) 为葫芦科苦 瓜属一年生草本植物，性味苦寒，具有清热解毒滋 养强壮、降血糖等功效 1 。从苦瓜果实和种子中分 离得到多种苦瓜皂甙和蛋白质，分别具有降血糖、 抗肿瘤和堕胎作用 2 _ 3 。 近年来，随着人们生活水平的提高，对苦瓜的 营养保健价值也有了更深的认识，发现苦瓜不仅有 很高的营养价值，而且有许多食疗保健作用，尤其 是苦瓜作为一种治疗糖尿病的特效营养保健品已 经备受人们的关注。目前，关于苦瓜治疗糖尿病的 报道很多H 啕 ，但是大部分还处于初步研究阶段，关 于苦瓜降血糖的活性成分，目前研究最多的是苦瓜 多肽 10 | ，其它的降血糖成分还在进一步探索研究之 中。一些资料报道苦瓜皂甙具有降血糖功能 1 卜1 2 ， 但具体的成分还没有完全研究清楚。针对这一研 究现状，作者主要是沿着苦瓜皂甙提取的工艺路 线，对苦瓜乙醇提取物中的各极性部分进行筛选， 以动物实验中血糖指数作为观察指标，来追踪苦瓜 中活性最强的组分，为进一步研究此成分的降血糖 作用提供了理论基础。 收稿日期：2 0 0 7 0 5 1 7 作者简介：石雪萍( 1 9 7 4 一) ，女，河南南阳人，工学博士，助研，主要从事营养与食品功能因子研究E m a i l ：s t b d w y a h o o e o m e n 万方数据 4 6食品与生物技术学报 第2 7 卷 1 材料与方法 1 1 材料与仪器 苦瓜( 含果实和种子) ：收集于江苏溧阳；体积 分数9 5 乙醇，无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇 等均为分析纯，由上海国药试剂厂提供；四氧嘧啶 ( A l l o x a n ) ：购于美国S i g m a 公司；薄层硅胶板：山 东烟台芝罘江友胶业经营部提供；实验动物：昆明 种小鼠，购于无锡山禾药业公司，体重1 8 2 0g ，雌 雄兼有。 T o u c h I I 型血糖测定仪：美国强生公司产品； R E 一5 2 A A 型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂生 产；循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公 司产品；L 一型离心机：涟水电讯电机厂生产。 1 2 苦瓜中不同极性皂甙成分的提取分离 苦瓜干粉碎，称重，加2 0 倍体积分数9 0 的乙 醇7 0 下3 次提取，每次3h 。过滤得到苦瓜乙醇 提取液。浓缩后取一部分真空干燥，备用( M C E ) 。 其余的蒸发至浸膏状。然后将浸膏分散至乙酸乙 酯一水( V 。乙黢乙醣，；V c 水) = 1 ：1 ) 溶液中萃取5 次， 合并乙酸乙酯相蒸干备用( M C E A ) 。水相分配于 正丁醇一水溶液中( V 。正丁醇) ：V 。水) 一1 ：1 ) ，萃取5 次，至正丁醇相几乎没有颜色，合并正丁醇相，浓缩 干燥备用( M C E _ B ) 。其它水相部分浓缩蒸干 ( M C E C ) 。这样苦瓜乙醇提取物就按照极性分为3 个组分：M C E A ，M C E B 和M C E C 。小鼠灌胃时， 每个极性部位分别配成4 0m g m L ( 4 0m g 为总皂 甙质量) 的溶液或悬液。 1 3 皂甙检测 1 3 1 定性检测将样品浓缩后点于G F z 。硅胶 板，展开剂系统为V ( 氯仿) ：V c 甲醇) ：V c 水) 一7 ：3 ：1 ( 正丁醇相) ，1 5 ：3 ：l ( 乙酸乙酯相) ，5 ：3 ：1 ( 水 相) 。展开后的薄板，吹干展开剂，在1 0 硫酸一乙 醇溶液中浸湿后，立即放入1 0 5 烘箱烘烤1 5 m i n ，在点有M C E A 样品的薄板边沿，可以看到一 些紫色的斑点，说明该相中含有部分苦瓜皂甙；点 有M C E B 样品的薄板上清晰地看到有紫色的谱 带，说明该组分含有大量的苦瓜皂甙；点有M C E C 的薄板下方，有少量的紫色斑点，说明M C E - C 相也 有少量的皂甙。T L C 方法定性鉴定得出结论：3 种 组分中均含有皂甙成分。 1 3 2定量检测 总皂甙测定：香草醛一高氯酸显 色 13 | ，以人参皂甙R b ，作为对照品，5 6 0i l m 下测吸 光度值。 得到标准曲线为：Y = 0 0 0 46 X 一0 0 3 14 ，R 2 = o 9 9 64 ；总糖测定用葡萄糖作对照，苯酚一硫酸法 得到标准曲线为Y 一0 0 0 72 X + 0 。0 0 04 ，R 22 0 9 9 93 。 1 4 实验性四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立 小鼠适应饲养一周，实验前禁食不禁水1 2h 。 四氧嘧啶用生理盐水配制，然后按照剂量2 0 0m g k g 腹腔注射5 四氧嘧啶水溶液，破坏小鼠胰腺p 细胞。注射后4h 自由饮用质量分数1 0 的葡萄 糖溶液。7 2h 后，测定空腹血糖 ” 。取血糖值高于 1 0m m o l I 。的动物用于实验。模型动物具备I 型 糖尿病特征。 1 5 动物试验设计 1 5 1 剂量试验糖尿病小鼠4 0 只，随机分为4 组，分别为：低剂量组，中剂量组，高剂量组，模型对 照组。正常小鼠1 0 只作为空白对照组。苦瓜乙醇 提取物( M C E ) 分别按照剂量1 0 0m g k g 、3 0 0r a g k g 和5 0 0m g k g ( 相当于总皂甙量) 灌胃，其他生理 盐水灌胃，每日1 次，连续l 周。l 周后，空腹1 2h ， 测定其血糖值。 1 5 2 餐后血糖试验正常小鼠和糖尿病小鼠各 4 0 只，均随机平分成实验组和对照组，实验组1 次 性苦瓜不同极性组分的苦瓜皂甙样品灌胃，测定给 药后2h 、4h ，测血糖值。 1 5 3 一周血糖试验正常小鼠和糖尿病小鼠各 4 0 只，均随机分为实验组和对照组，实验组一次性 以一定剂量的不同苦瓜皂甙提取物灌胃，对照组以 相同剂量的生理盐水灌胃，每天1 次，7d 后禁食1 2 h ，测定其空腹血糖。 1 5 4 血糖测定取动物尾静脉血用葡萄糖氧化 酶法测定血糖，仪器为美国强生o n e - t o u c h 血糖测 试仪及专用试纸。尾部静脉取血，滴于血糖测定仪 上，4 5s 后读数，即为试验动物的血糖值。 1 5 5 试验数据处理一检验法n 。 2结果与讨论 2 1 苦瓜中皂甙的提取 苦瓜成分的提取具体工艺如图l 所示。 2 2 各种提取液中总皂甙的含量测定 将提取物M C E - A 、M C E - B 、M C E - C 取适量，挥 ( 蒸) 干溶剂，按照1 3 2 中的方法，测定每种提取 组分里面的皂甙含量，结果见表1 。 从表l 结果可以看出，苦瓜乙醇提取物中各个 极性组分都有不同含量的皂甙。其中正丁醇( 中极 性) 组分含量最多，其次是乙酸乙酯( 低极性) 组 分，而水相中苦瓜皂甙含量最少。 万方数据 第3 期石雪萍等：苦瓜提取物中降血耱皂甙的筛选4 7 苦瓜干 上 研磨 乙醇提取 上 滤液旋转蒸发至浸膏状， 加石油醚萃取脱脂 石油醚层水层( M C E ) I 加乙酸乙酯萃取 ( 室温，5 次) 乙酸乙酯相 ( M C E A ) 水层 正丁醇萃取 ( 室温，5 次) 正丁醇相 ( M C E - B ) 水相 ( M C E - C ) 图l苦瓜皂甙提取工艺流程 F i g 1 T h ee x t r a c t i o np r o c e s so ft h es a p o n i n sf r o mm o - m o r d i c ac h a r a n t i aL 表1 苦瓜乙醇提取物中各极性组分中总皂甙的含量 T a b 1T o t a ls a p o n i n so ft h ed i f f e r e n tp o l a r i t yo ft h ee t h a n o l e x t r a c tf r o mm o m o r d i c ac h a r a n t i aL 组分皂甙质量分数 M C E I - A M C E I _ B M C B C 3 4 5 8 4 5 5 l 1 2 2 2 2 3 剂量试验 由表2 可以看出：不同剂量的苦瓜乙醇提取物 对糖尿病小鼠都有降血糖作用。当剂量为3 0 0r a g k g 时，降血糖作用最强( P 0 0 1 ) ，继续增加剂量， 血糖下降不明显。因此选用3 0 0m g k g 作为治疗 糖尿病的最佳剂量。 表2 苦瓜乙醇提取物的降血糖试验结果 T a b 2 T h eh y p o g l y c e m i cr e s u l t se t h a n o l i ce x t r a c to fm o m o r d i c ac h a r a n t i aL 薤I ”表示0 0 1 藤_ 6 0 5 ，说明有差异；“* * ”表示 P O 0 1 ，说明差异显著。 2 4 不同组分的降血糖试验 2 4 1 餐后血糖实验 1 ) 不同组分苦瓜皂甙对正常小鼠餐后血糖的影响。 正常小鼠4 0 只，随机分为4 组，3 组为实验组，1 组 为对照组。实验组分别按照剂量3 0 0m g k g 不同 极性组分的苦瓜皂甙灌胃，测定小鼠灌胃后2h 、4h 时的血糖值，结果见表3 。 表3 苦瓜皂甙对正常小鼠餐后血糖的影响 T a b 3 E f f e c to fs a p o n i n sw i t hd i f f e r e n tp o l a ro i lb l o o dg i n c o s ei nn o r n l a lm i c e 灌胃组别 血糖浓度( r e t o o l L ) 0h2h4h 注：与对照组相比( 1 ) ，( 2 ) 。( 4 ) ，( 5 ) ，0 0 1 P 0 0 5 ，说 明有差异；( 3 ) P o 0 1 ，差异显著。 由表3 和图2 看出，苦瓜皂甙不同组分都可以 使正常小鼠的餐后血糖浓度降低，其中M C E B 作 用最强，其次是M C E C 。 时同h 图2 苦瓜皂甙对正常小鼠降血糖作用趋势图 F i g 2 T h et r e n do ft h ee f f e c to ft h es a p o n i n so nt h e b l o o dg l u c o s eo ft h en o r m a lm i c e 2 ) 苦瓜皂甙对糖尿病小鼠餐后血糖的影响。糖尿 病小鼠4 0 只，随机分为4 组，3 组为实验组，1 组为 对照组。实验组分别按照剂量3 0 0m g k g 不同组 分的苦瓜皂甙灌胃，测定病鼠灌胃2h 、4h 后的血 糖值，结果见表4 。 表4 苦瓜皂甙对糖尿病小鼠餐后血糖的影响 T a b 4T h et r e n do ft h ee f f e c to ft h es a p o n i n s 帅t h eb l o o d g l u c o s eo ft h ed i a b e t i cm i c e 灌胃组别 血糖浓度( r e t o o l L ) 0h2h4 h M C E _ A 组 1 6 4 7 1 3 6 1 5 2 1 土1 3 61 4 5 7 士1 5 5 M C E - B 组1 7 2 5 + 3 2 91 2 4 0 + 2 1 7 ”1 0 7 8 + 1 2 8 2 M C E - C 组 1 7 6 7 2 4 31 5 0 4 1 6 11 3 5 6 2 3 9 3 ) 对照组 1 6 7 9 1 7 41 6 5 2 1 6 5 1 5 4 5 士3 5 1 注：与对照组相比，( 1 ) ，( 3 ) 为0 0 1 P b 0 5 ，说明有差 异，( 2 ) 为P 0 0 1 说明差异显著。 一1，一。吕吕v，磐舞嗣 万方数据 4 8食品 与 生物技术学报第2 7 卷 3 专 目 曼 画 馨 鲁 图3 苦瓜皂甙对糖尿病小鼠降血糖作用趋势图 F i g 3 T h et r e n do fe f f e c to ft h es a p o n i n so nt h eb l o o d g l u c o s eo fd i a b e t i cm i c e 由表4 和图3 看出，苦瓜提取物不同组分对糖 尿病小鼠的降血糖实验表明：M C E B 可使糖尿病小 鼠餐后血糖显著降低，M C E - C 也可降低其餐后血 糖，而M C E - A 的降血糖效果不明显。M C E 对正常 小鼠和糖尿病小鼠的血糖作用在0 2h 下降比较 快，2 4h 之间下降平缓。 2 4 2 一周血糖实验将苦瓜乙醇提取物中的组 分分为3 个极性组分：M C E A ，M C E B ，M C E - C 。 按照3 0 0m g k g ( 总皂甙生药量) 的剂量糖尿病小鼠 灌胃，空白对照组小鼠以相同剂量的生理盐水灌 胃，一周后测定其空腹血糖，结果见表5 。 表5 不同极性组分的降血糖试验结果 T a b 5T h ee x p e r i m e n t a lr e s u l to ft h eh y p o g l y c e m i ca c t i v i t y o fd i f f e r e n tp o l a rf r a c t i o n 注：“* ”表示0 0 1 P o 0 S ，1 丽旷百享算；“ R - * ”表示 P O 0 1 ，说明差异显著。 表5 的试验结果表明，M C E B 对正常小鼠和糖 尿病小鼠都具有降血糖作用，对糖尿病小鼠降血糖 作用明显( P 0 0 1 ) 。M C E C 对糖尿病小鼠具有 降血糖作用，但是对正常小鼠降血糖作用不明显 ( o 0 1 P 0 0 5 ) 。M C E A 对正常小鼠和糖尿病 小鼠均无明显的降血糖作用。 2 4 3 M C E - B 中主要成分推测 由试验2 2 和2 3 可知，M C E A 、M C E _ B 、 M C E C 中都含有皂甙成分，这说明并不是所有的 皂甙都具有降血糖的功效。M C E _ C 中的降血糖成 分可能是水相里面的蚕豆甙起作用D s 。为了进一 步分离纯化M C E - B 并探讨组分的分子结构，首先 对M C E B 的组成进行分析，结果见表6 。 表6M C E - B 的成分分析 T a b 6C o m p o n e n ta n a l y s eo fM C E - B 成分质量分数 水分 碳水化合物 总蛋白 总皂甙 其它 7 8 9 3 7 6 0 3 4 2 4 5 5 1 6 5 8 从表6 中皂甙的成分分析可以看出，M C E B 中 除了含有大部分皂甙成分之外，还含有碳水化合 物、蛋白质等杂质。其中除了皂甙外主要的成分为 碳水化合物。这就为以后的实验提供了依据。由 于M C E B 最初是从苦瓜醇提物中分离出来的组 分，因此这部分碳水化合物主要应是小分子糖类， 在以下的苦瓜皂甙分离纯化步骤中，要想分离出苦 瓜皂甙单体，必须先将这一部分小分子糖类除去。 3结语 通过对苦瓜乙醇提取物的降血糖动物实验得 出结论：苦瓜乙醇提取物具有降血糖活性，且最佳 剂量为3 0 0m g ( k g d ) 。 对苦瓜乙醇提取物继续按照极性进行分组，得 到3 个极性组分。对这3 个极性组分进行动物实 验，结果表明：苦瓜乙醇提取物正丁醇萃取相对正 常小鼠和四氧嘧啶糖尿病小鼠均有降血糖作用；水 相对正常小鼠作用不明显，对四氧嘧啶糖尿病小鼠 具有降血糖活性。乙酸乙酯相对正常和糖尿病小 鼠降血糖活性均不显著。 正丁醇相分析表明：其中成分除了含有皂甙 外，还有较多的碳水化合物成分。 万方数据 第3 期石雪萍等：苦瓜提取物中降血糖皂甙的筛选4 9 参考文献( R e f e r e n c e s ) ： 1 江苏新医学院中药大辞典( 上) M 上海：上海科技出版社1 9 8 5 ：1 2 8 1 2 李时珍本草纲目 M 北京：中国医药出版社1 9 8 8 ：2 8 ，1 6 3 A h m e dEA d e g h a t e E f f e c t so fM o m o d i c ac h a r a n t i af r u i tj u i c eo ni s l e tm o r p h o l o g yi nt h ep a n c r e a so ft h es t r e p t o z o t o c i n - d i a b e t i cr a t J D i a b e t e sR e s e a r c ha n dC l i n i c a lP r a c t i c e ，1 9 9 8 ，4 0 ：1 4 5 1 5 1 4 B i y a n iMK ，B a n a v a l i k a rMM ，S u t h a rAC ，e ta 1 A n t i h y p e r g l y c e m i ce f f e c t so ft h r e ee x t r a c t sf r o mM o m o r d i c ac h a r a n t i a J J o u r n a lo fE t h n o p h a r m a c o l o g y ，2 0 0 3 ，8 8 ：1 0 7 1 1 1 5 R e y n a l d oR o s a l e s ，R i e a r d oF e r n a n d o A ni n q u i r yt Ot h eh y p o g l y c e m i ca c t i o no fm o m o r d i c ac h a r a n t i aa m o n gt y p e2d i a b e + t e sp a t i e n t s I - J P h i l i p p i n eJ o u r n a lo fI n t e r n a lM e d ，2 0 0 1 ，7 ( 8 ) ：2 1 3 6 A h m e dI ，L a k h a n iMS ，G i l l e t tM ，e ta 1 H y p o t r i g l y e e r i d e m i ca n dh y p o c h o l e s t e r o l l e m i ce f f f e c t so fa n t i d i a b e t i cm o m o r d i c ac h a r a n t i a ( K a r e l a ) f r u i te x t r a c ti ns t r e p t o z o t o c i n - i n d u c e dd i a b e t i cr a t sI - J D i a b e t e sR e s e a r c ha n dC l i n i c a lP r a c t i c e ， 2 0 0 1 ，5 1 ：1 5 5 1 6 1 7 B a i z i dAS h i b i b ，L i a k o tA l lK h a n ，R a f i q u rR a h m a n 。H y p o g l y c a e m i ca c t i v i t yo fc o c c i n i ai n d i c aa n dm o m o r d i c ac h a r a n t i ai n d i a b e t i cr a t s ：d e p r e s s i o no ft h eh e p a t i cg l u e o n e o g e n i ce n z y m e sg l u c o s e - 6 一p h o s p h a t e sa n df r u c t o s e - 1 ，6 - b i s p h o s p a t a s ea n d e l e v a t i o no fb o t hl i v e ra n dr e d - c e l ls h u n te n z y m eg l u c o s e - 6 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e J B i o c h e mJ ，1 9 9 3 ，2 9 2 ：2 6 7 2 7 0 8 侣丽红，赵余庆苦瓜中降血糖活性成分的提取分离与鉴定 J 中药材，2 0 0 4 ，2 7 ( 1 2 ) ：9 2 2 9 2 3 L vLH ，Z h a oYQ I s o l a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no ft h eh y p o g l y c e m i ca c t i v i t i e sf r o mt h em o m o r d i c ac h a t a n t i aL J J o u r n a l o fC h i n e s eM e d i c i n a lM a t e r i a l s ，2 0 0 4 ，2 7 ( 1 2 ) ：9 2 2 9 2 3 ( i nC h i n e s e ) 9 S r i v a s t a v aY ，V e n k a t a k r i s h n a B h a t tH ，V e r m aY ，e ta 1 A n t i d i a b e t i ca n da d a p t o g e n i cp r o p e r t i e so fm o m o r d i c ac h a r a n t i a e x t r a c t ：a ne x p e r i m e n t a la n dc l i n i c a le v a l u a t i o n J - P h y t o t h e r a p yR e s e a r c h ，1 9 9 3 ( 7 ) ：2 8 5 2 8 9 1 0 B 纳格，s 麦迪彻拉，S D 沙玛O r a l l ya c t i v i t yf r a c t i o no fm o m o r d i c ac h a r a n t i a ，a c t i v ep e p t i d e st h e r e