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耐低温草菇菌株的覆层平板法筛选 李玉祥,赵明文,季哲 (南京农业大学微生物学系,江苏 南京210095) 摘要:采用分割切块法测定了3个草菇菌株 (V01 、V02和 V03) 在低温下的致死时间。结果表明: V01、V02和V03 菌株在0、2和4 下的致死时间分别为24、48和32 h , 48、88和64 h , 96、192和144 h。用0101 %吖啶橙诱变草菇 菌株V01担孢子30 min ,致死率达7014 %;对诱变处理的担孢子萌发形成的菌体进行低温临界致死处理,杀死低温敏 感菌株,采用覆层平板法筛选出4株耐低温的草菇菌株。 关键词:草菇;临界冷致死时间;覆层平板法 中图分类号: Q933 文献标识码: A 文章编号: 10002030 (2004) 03005804 Low temperature resistent strain selection of Volvariella volvacea with cladding plate LI Yu2xiang , ZHAO Ming2wen , J I Zhe (Department of Microbiology , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China) Abstract: The critical cryolethal time of threeVolvariella volvaceastrains V01 , V02 , V03 under 0, 2and 4were found to be 24 h , 48 h , 32 h; 48 h , 88 h , 64 h; as well as 96 h , 192 h , 144 h , res pectively.The basidiospores of V01 were treated with 0101 % acridine orange at 25for 30 min and the killing ratio reached to 7014 %. After spore germinating on IPDA plates , the colonies were treated for the critical cryolethal time to kill the sensitive ones. With cladding plate method , four low temperature resistent strains were selected out. Key words:Volvariella volvacea; critical cryolethal time; cladding plate 草菇( V alvariella volvacea(Bull ex Fr) Sing)栽培起源于中国,是一种营养丰富、味道鲜美的食 用菌。草菇属于喜高温担子菌,子实体分化发育的最适温度为2832,低于26 时子实体发育受 阻。草菇菌丝对低温也很敏感,林声汉报道1在5 以下非结冰低温处理6 h即会受冷致死。李育岳 等2对草菇菌种的低温保藏进行了研究,认为草菇的厚垣孢子可以作为草菇菌种保藏的材料。陈明杰 等3 ,4对草菇低温自溶现象从遗传水平上进行了深入研究。但是,目前关于草菇对低温耐受性和低温出 菇的研究甚少。研究草菇的低温敏感特性,筛选耐低温和能在低温条件下出菇的菌株,将有助于草菇的 生产栽培。 1 材料和方法 111 供试菌株 草菇V01、V02、V03 ,均为南京农业大学微生物研究室保藏菌株。 112 培养基 IPDA固体培养基: 200 g马铃薯煮汁, 20 g葡萄糖, 115 g K2HPO4, 015 g MgSO47H2O , 15 g琼 脂,水1 000 mL。IPDA半固体培养基:琼脂用量减至7 g ,其他相同。 113 低温致死临界值的测定 将长满V01、V02和V03菌丝的斜面分别放入0、2和4 冰箱中,每隔一定时间取出一支斜面, 收稿日期: 20030730 作者简介:李玉祥(1956 ) ,副教授,主要从事真菌遗传学研究。E2mail : lyx njau1edu1cn 南京农业大学学报 2004 , 27 (3) : 5861 Journal of Nanjing Agricultural University 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 并将斜面菌种分割成均匀大小的接种块,接种于平板上。32 培养,观察接种块上菌丝体恢复生长的 情况。 114 诱变剂 0104 molL - 1吖啶橙水溶液用 0145m微孔滤膜过滤器过滤, 4 避光保存。 115 V01担孢子萌发率和诱变致死率的测定 用血球计数器计数孢子悬液浓度,系列稀释后涂布平板, 32培养5 d后计数形成的菌落数 (CFU)。计算孢子萌发率(菌落数/孢子总数 100 %)。 116 草菇担孢子诱变及耐低温突变菌株的筛选 常规方法5收集草菇担孢子,用无菌生理盐水制备1107mL - 1孢子悬液 ,加入1/ 10体积的0104 molL - 1吖啶橙水溶液 ,混匀后25 静置30 min ,离心洗涤(5 000g, 10 min) 2次后悬浮于生理盐水 中。把诱变处理的草菇担孢子悬液涂布于IPDA固体培养基平板上, 32 培养。待孢子萌发形成大量 菌落后低温处理,处理时间为冷致死时间。处理后每平板加入10 mL IPDA半固体培养基,使小菌落埋 于半固体培养基中制成覆层平板, 32 培养。待上层培养基表面长出菌落后,移入斜面培养。 2 结果与分析 211 3个供试菌株的低温致死临界值 低温处理后的草菇斜面母种移接于IPDA固体培养基平板上, 32 培养,未被低温致死的菌体会 恢复生长并形成新的菌落。随着低温处理时间的延长,部分菌体失去活性,而不能在平板上继续生长形 成菌落。到一定时间后,所有接种菌体都不能恢复生长,此被认为是低温冷致死临界点。 从表1可见, 0 低温处理8 h对V01菌株无杀伤作用,处理12 h开始有杀伤作用,随着作用时间 的延长,杀伤作用增强,处理24 h以上,所有接种物死亡。V02菌株表现出较强的耐低温特性, 0 处理16 h无杀伤作用, 20 h开始表现出一定的杀伤作用, 48 h以上菌体全部死亡。同样条件下, V03 处理32 h以上,菌体全部死亡。 表2显示: V01菌株在2 低温处理12 h无杀伤作用, 48 h菌体全部死亡; V02菌株处理40 h无 杀伤作用, 88 h菌体全部死亡; V03菌株处理32 h无杀伤作用,处理144 h菌体全部死亡。 表3显示: 4 低温处理24 h对V01菌株无杀伤作用,处理96 h菌体全部死亡; V02菌株处理72 h无杀伤作用,处理192 h菌体全部死亡; V03菌株处理48 h无杀伤作用, 144 h菌体全部死亡。 表1 0 处理草菇菌株存活情况 Table 1 Survival of Valvariella volvacea strains treated at 0 菌株 Strains 处理时间/ h Treating time 4812162022242832364896 V01+ + + 11/ 15+ 8/ 15+ 7/ 18+ 3/ 16+ 1/ 15- V02+ + + + + 12/ 16+ 10/ 16+ 8/ 16+ 4/ 15+ 3/ 15+ 1/ 17- V03+ + + + + 13/ 15+ 11/ 16+ 7/ 15+ 3/ 16+ 1/ 15- 注:“+ +”:所有接种块都能恢复生长;“+ /”:只有部分接种块能恢复生长,分子表示能够恢复生长的块数,分母为接种的总块 数;“-”所有接种块均不能恢复生长。 “+ +”: All inoculum were survival ;“+ /”: Part of inoculum were survival , numerator shown number of survival and denominator shown number of inoculum;“-”No inoculum were survival.The same as in Table 2 and 3. 表2 2 处理草菇菌株存活情况 Table 2 Survival of Valvariella volvacea strains treated at 2 菌株 Strains 处理时间/ h Treating time 1624324048566472808896 V01+ + + 13/ 25+ 7/ 16- V02+ + + + + 12/ 16+ 8/ 15+ 4/ 16+ 3/ 15+ 3/ 15- V03+ + + + 13/ 16+ 4/ 15+ 1/ 15- 95第3期 李玉祥等:耐低温草菇菌株的覆层平板法筛选 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 表3 4 处理草菇菌株存活情况 Table 3 Survival of Valvariella volvacea strains treated at 4 菌株 Strains 处理时间/ h Treating time 24487296120144168192 V01+ 5/ 15+ 1/ 15- V02+ + + + 13/ 15+ 10/ 15+ 2/ 15+ 1/ 15- V03+ + + 13/ 15+ 4/ 15+ 1/ 15- 212 耐低温菌株筛选 用IPDA平板培养草菇菌体,待菌丝长满平板(图1 1) 后,加入约10 mL融化后冷却至45 左 右的半固体IPDA培养基,使气生菌丝埋入固体培养基中,凝固后32 培养48 h ,菌丝开始穿过半固 体培养基层长到表面(图1 3) 。长好菌丝的V01平板,放0 处理24 h ,气生菌丝倒伏呈匍匐状(图 12) ,加入半固体IPDA培养基后, 32 培养6 d ,无气生菌丝长出表面,表明菌丝体已受低温影响而 死亡(图1 4) 。 将突变处理的V01担孢子涂布平板, 32 培养,孢子萌发后形成大量小菌落(图1 5) 。将此平 板放0 冰箱低温处理24 h ,取出后加覆层半固体培养基, 32 培养34 d ,有部分菌丝穿过半固体 培养基层并形成菌落(图1 6) 。随时挑出这些菌落移接于斜面培养,挑出4个可能耐低温的菌株。 图1 覆层平板法筛选耐低温菌株 Fig11 Selection of low temperature resistant strains with cladding plate (1 1 长满V01菌丝体的平板; 21 低温处理后气生菌丝倒伏呈匍匐状; 31 长满菌丝的平板加入半固体培养基,培养后整个覆层培养 基表面均匀长出气生菌丝; 41 长满菌丝平板低温处理后,加覆层培养基32 培养6 d ,无气生菌丝长出; 51 诱变处理后的担孢子萌发 形成的大量菌落; 61 担孢子萌发形成的菌落,低温处理后加半固体覆层培养基,培养后形成的菌落。 11Mycelium growth on the plate without treatment ; 21Crawl mycelium on the plate after low temperature treatment ; 31Upper layer medium cladded on grown mycelium , mycelium appear on the medium surface again after incubating for 6days under 32; 41Grown mycelium treated with low temperature , then add upper layer medium , incubating for 6days under 32, but no mycelium growth; 51Many coloniesfrom induced basidiospores appeared; 61Colonies from induced basidiospores treated with low temperature then add upper layer medium , after incubating for 6 days , only a few colony appeared. ) 将挑出的4株菌株进行耐低温性能测试。结果如表4所示,这4个菌株对0 低温的耐受性都高于 其亲本V01。亲本菌株在0 处理28 h即被致死,突变株V0121和V0124在0 低温处理48 h仍可恢 复生长, V0122菌株在0 可保持活性达42 h , V0123菌株在0 处理32 h被致死。 表4 诱发突变株耐低温特性 Table 4 Low temperature resistant of induced mutants 菌株 Strains 处理时间/ h Treating time 2426283032343638404244464850 V0121+- V0122+- V0123+- V0124+- V01+- 注:“+”:处理后的菌体能恢复生长;“-”:处理后不能恢复生长。“+”: Survival after treatment ;“-”: Without survival after treatment. 06 南 京 农 业 大 学 学 报 第27卷 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 213 耐低温菌株的出菇试验 以稻草为主要培养料对筛选的耐低温菌株V0121和V0124进行了栽培实验。栽培结果显示, V0121 和V0124菌株在较低温度条件下结实能力比出发菌株好。在25 条件下,出发菌株难以形成子实体, 而V0121和V0124菌株都能出菇,生物学效率可达18 %。 V0121 V0124 图2 V0121和V0124菌株在25 出菇 Fig12 Fruiting of strayis V0121 and V0124 under 25 3 讨 论 比较表1、表2和表3所示数据,可以看出同一菌株随着温度升高,菌体因低温致死的时间延长, 不同菌株对低温的敏感性也不同。V01菌株对低温最为敏感,而V02具有较高的抗低温特性。实验结 果还显示,低温处理时间越短,其恢复生长的时间也越短,表明菌体受损伤程度低;随着低温处理时间 延长,菌体恢复生长所需的时间延长,表明菌体受损伤程度有累积效应。草菇是一种特殊的低温敏感担 子菌,其营养体在非结冰低温条件下(0)即会受低温杀伤。低温处理超过临界致死时间,菌体不 可逆死亡。 草菇属于同宗结合的担子菌, 76 %的担孢子萌发形成的菌株具有结