苦瓜杀虫及抑菌活性组分物质的制备.pdf

第 2 0 卷第 5期 2 O 0 7 年 1 O月 山 东 科 学 S HA N D0 NG S C I E NC E Vo 1 2 0 No 5 Oc t 2 0 0 r 7 文章编号 ： 1 0 0 2 - 4 0 2 6 ( 2 0 0 7 ) 0 5 0 0 1 8 0 3 苦瓜杀虫及抑菌活性组分物质的制备 王贻莲 ， 陈燕平 ， 杨合 同 ， 李纪顺 ， 汪钟信 ， 司升云 ( 1 山东省科学院中日友好生物技术研究中心， 山东 济南 2 5 0 0 1 4 ； 2 烟台检验检疫实验中心， 山东 烟台 2 6 4 0 3 0 ； 3 华中农业大学 ， 湖北 武汉 4 3 0 0 7 0 ； 4 武汉市蔬菜科学研究所， 湖北 武汉 4 3 0 0 6 5 ) 摘要： 采用生化方法从苦瓜种子中提取得到苦瓜籽油、 凝集素备提物、 苦瓜籽粗蛋白和苦瓜凝集素 4种活性组 分 ， 其中凝集素备提物、 苦瓜籽粗蛋白和苦瓜凝集素得率分别为： 2 1 6 、 3 0 6 、 O 3 7 。旨在寻找苦瓜中有 效杀虫及抑菌活性物质。 关键词： 苦瓜籽油； 凝集素备提物； 苦瓜籽粗蛋白； 苦瓜凝集素 中图分类号： Q 9 4 6 文献标识码 ： A Re s e ar c h o n Ex t r a c t i o n a n d Pu r i fic a t i o n o f Ac t i v e Co mp o n e n t s wi t h t h e To x i c i t y a n d I n h i b i t i o n Fu n c t i o n f r o m M o r i o d i c a c h a r a n t i a L W ANG Yi l i a n 。 ，CHEN Ya n p i n g 2 ，YANG He t o n g 。，L I J i s h u n ，WA N G Z h o n g x i n 。 ， S I S h e n g y u n 4 ( 1 B i o t e c h n o l o g y R e s e a r c h C e n t e r ， S h a ndo n g A c a d e m y o fS c i e n c e s， J i n a n 2 5 0 0 1 4 ， C h i n a ； 2 Y a n t a i E n t r y - E x i t I n s p e c t i o n a n d Q u a r a nt i n e B u r e a u ， Y a nta i 2 6 4 0 0 0 ， Chi na ； 3 Hu a z h o n g A g r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y，Wu h a n 43 0 0 7 0，Ch i na ； 4 W u h a n I nst i t u t e f o r V e g e t a b l e S c ie nce s， W u h a n 4 3 0 0 6 5 ， Chi na ) A b s t r a c t ： T h e s e e d s o f Mo r io d ie a c h a r a n t i a L ( b a l s a m p e a r )w e r e c h o s e n a s o b j e c t s f o r t h i s r e s e ar c h F o u r e x p e rime n t a l s u b s t a n c e s o i l o f b als am p e ar ，MCL e x t r a c t i o n， p r o t e i n e x t r a c t i o n an d pu r i fic a t i o n MCL， we re refin e d f r o m t h e s e e d s b y b i o c h e mi s t r y a p p roa c h e s Th e r a t e o f the MCL e x t r a c t i o n， p rot e i n e x t r a c t i o n an d p u rifi c a t i o n MCL r e a c h e d 2 1 6 3 0 6 。 0 3 7 res pe c tiv e l y Th e p u r p o s e o f the p a p e r i s t o s e a r c h the a c t i v e c o mp o n e n t s t h the t o x i c i t y an d i n h i b i t i o n f u n c t i o n f r o m Mo r i o diea c h a r a nti a L Ke y wO r d s： o i l o f b als am pe ar ；MCL e x t r a c t i o n ：p rot e i n e x t r a c t i o n； p u ri fic a t i o n MCL 苦瓜 ( Mo r i o d ie a c h a r a nti a L ) 是葫芦科苦瓜属一年蔓生草本植物 ， 具有降血糖、 抗癌 、 抗肿瘤 、 免疫调节和 抗菌等多种生物活性。 目前 ， 国内外对苦瓜的研究多集中在其降血糖功能因子和医用药物开发上 ， 而对其在 农业生产中的杀虫和抑菌作用的研究和报道甚少。由于化学合成农药易产生严重的“ 三 R ” 问题， 天然的植 物性杀虫 、 杀菌剂的研究 日益受到重视。将苦瓜作为植物性杀虫 、 杀菌剂应用在农业生产中， 既可提高苦瓜 的价值 ， 又可为植物源农药发掘新原料。本文采用多种生化方法从苦瓜种子中提取得到苦瓜籽油、 凝集素备 收稿 13期 ： 2 0 0 7 - 0 5 0 4 作者简介 ： 王贻莲 ( 1 9 7 8 一) ， 女， 硕 士， 主要从 事生物防治研究 ， e - m a i l ： y il i a n w a n g 1 6 3 C O B 。 维普资讯 第 5 期 王贻莲， 等 ： 苦瓜杀虫及抑菌活性组分物质的制备 1 9 提物 、 苦瓜籽粗蛋 白和苦瓜凝集 素 4种活性组分 ， 旨在寻找苦瓜 中有效杀虫及抑菌活性 物质 ， 进而为苦瓜抗 虫性及抑菌作用机理的研究和植物杀虫剂及杀菌剂 的仿生合成提供初步的理论依据。 l 材料与方法 1 1 供试材料 苦瓜 Mo r i o d i c a c h a r a n t i a L ( 青皮长生大苦瓜) 种子， 市售。挑选籽粒饱满的种子 ， 洗净晾干备用。 1 2 主要试剂 聚乙二醇( P E G ) J a p a n 进 口分装 ， 上海化学试剂站分装厂 ； 琼脂糖凝胶 S e p h a r o s e 4 B 生化试剂 ， 中国医药( 集团) 上海化学试剂公 司； 羧甲基纤维素 D E 2 3 w h a t m a n 进 口分装 ， 上海化学试剂站分装厂 ； 半乳糖 生化试剂 ， 上海试剂二厂。 1 3 苦瓜籽油的制备 苦瓜种子洗净去壳 ， 取种仁磨碎后用定性滤纸包好 ， 置于索式脂肪抽提器 的抽提管 中， 以乙醚作 为溶剂 进行脱脂。抽提 6 h后， 用吸管吸取抽提管中的抽提液 ， 滴于干净的滤纸上 ， 检查是否到达脱脂终点 。脱脂完 毕后 ， 将盛醚瓶 中的乙醚挥发干净 ， 得到的苦瓜籽油盛于棕色试剂瓶 中备用 。收集滤纸包 中的脱脂苦瓜种仁 粉 ， 干燥后以备用于凝集素备提物 、 苦瓜籽粗蛋白和苦瓜凝集素的制备 。 1 4 凝集素备提物的制备 5 0 g 脱脂苦瓜种仁粉 ， 用 2 5 0 m L含 0 1 5 m o l L N a C L的磷酸( P B S ) 缓 冲液 ( 5 m m o l L ， p H值为 7 2 ) 于 4 提 取两次 ， 每次 1 2 h ， 离心去渣 ， 合并两次上清液加人 0 8 倍体积冷丙酮l 】 ， 1 0 0 0 0 r rai n离心 1 5 ra i n ， 取沉淀物 ， 冷 冻干燥成凝集素备提物冻干粉 ， 保存于 一2 0 冰箱 中备用。 1 5 苦瓜籽粗蛋白的制备 称取脱脂苦瓜种仁粉 ， 加 1 0 倍 的 5 0 m m o L L硼酸钠缓冲液( p H值为 8 2 ， m L数 g 数 =1 0 ) ， 在 4 C 提取 4 8 h 。提取液经 1 0 0 0 0 r m i n离心 1 5 mi n ， 取上清液加( N H ) 2 S O 至 8 0 饱和度D ， 在 4 C 搅拌 3 h ， 经 1 0 0 0 0 r m i n 离心 1 5 m i n后得到沉淀。沉淀物冷冻干燥后即得苦瓜籽粗蛋白制剂 ， 保存于 一2 0 C 冰箱 中备用。 1 6 苦瓜凝集素 ( Mo m o r d i c a C h a m n t i a L e c t i n ， MC L ) 的制备 1 6 1 苦瓜凝集素( MC L ) 的分离提取 取脱脂苦瓜种仁粉 3 0 g ， 置于 3 0 0 m L生理盐水 中浸提 5 h以上 ， 提取液经 1 0 0 0 0 r m i n离心 1 5 m i n ， 取上清 液加人 0 8 倍体积冷丙酮 ， 沉淀 2 h ， 离心( 1 0 0 0 0 r m i n ) 出沉淀物 ， 溶于 p H值 7 2 ， 5 m m o l L P B S中， 用酸化的 S e p h a r o s e 4 B 亲和层析柱进行亲和层析， 用 0 2 m o l L 半乳糖洗脱( 半乳糖用 p H值 7 2 ， 5 m m o l L P B S 配制， 洗 脱流速为 l m L m i n ) ， 核酸蛋 白检测仪进行检测。取含有 M C L的洗脱液 ( 凝血活性检测) ， 经 D E 2 3离子交换 层析 ， 采用 00 5 m o l L N a C L梯度洗脱 ， 收集有凝血活性 的洗脱峰流分 ， 经透析( 截 留分子量为 1 2 0 0 0 ) 、 浓缩 ( P E G 2 0 0 0 ) 、 冷冻干燥， 得到均一的高活性 M C L _ 4 ， 保存于 一 2 0 C 冰箱中备用。 1 6 2凝血 活性检 测 注射器中预先加人抗凝血剂 ( 2 E D T A) 润湿， 从动物体 内取血 。玻璃离心管 中预先加人抗凝血剂( 2 E D T A) ， 然后迅速将取到的血加人到玻璃离心管 中( 标准为 ： 1 0 m L血 中加人抗 凝血剂 5 0 ) ， 混匀后 ， 离心 ( 4 0 0 0 r m i n ) 1 0 ra i n 。用微量取液器移走上清液( 血浆) 和中间的一层( 白细胞) ， 保留下层的红细胞。加人与其 等体积的生理盐水 ， 盖紧离心管盖子 ， 混匀 ， 离 t , ( 4 0 0 0 r ra i n ) 1 0 ra i n ， 用以上同样方法重复处理两次 ， 保 留下层 的红细胞 。加人生理盐水 ， 稀释成 0 5 的浓度。在 “ V” 板孔 中先加人苦瓜凝集素 的洗脱 液( 5 0 ) ， 再加人 5 0 L 的经过上述处理的红细胞处理液， 振荡混匀。在 4 0 C ( 恒温培养箱中) 条件下反应 3 0 m i n ， 检查是否出现 砖红色絮状沉淀。如有砖红色絮状沉淀出现 ， 表明洗脱液为苦瓜凝集素。 维普资讯 2 0 山东科学 2 0 0 7往 2 结果与分析 直接粉碎后的苦瓜种仁粉颜色为浅黄色 ， 经索式脂肪抽提器彻底脱脂后 ， 色素大部分随溶剂乙醚回流到 抽提液 中。将抽提液中的乙醚挥发干净 ， 即得到苦瓜籽油 ， 苦瓜籽油为浅黄色澄清透 明的油状液体 。将脱脂 后的种仁滤纸包烘干 ， 得到的脱脂苦瓜种仁粉为 白色， 收集后称重 ， 得率为 6 4 2 8 。 以脱脂苦瓜种仁粉为材料 ， 提取得到的凝集素备提物 、 苦瓜籽粗蛋 白、 苦瓜凝集素均为白色粉末状 ， 得率 分别为 ： 2 1 6 、 3 0 6 、 0 3 7 。 以洗脱体积为横坐标 ， 吸光度( A 2 8 0 ) 为纵坐标作 曲线图 ， 得到苦瓜凝集素的 S e p h a r o s e 4 B亲和层析洗脱 曲线和羧 甲基纤维素 D E 一 2 3离子交换层析洗脱 曲线 ， 如图 1和图 2 。在亲和层析 中得到两个洗脱峰组分， 经 凝血实验检测， 峰 2 为含有苦瓜凝集素的洗脱峰组分； 在离子交换层析中， 同样得到两个洗脱峰组分， 其中峰 2 为主要的洗脱峰 ， 经凝血实验检测 ， 峰 2为苦瓜凝集素的洗脱峰。峰 1的组分物质待查。 宝 图 1 S e p h r o s e 4 B亲和层析洗脱曲线 F i g 1 El u t i o n p r o fil e o f a ff i n i t y c h r o ma t o g r a p h y o n s e ph r o s e 4B 0 7 0 6 昌0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 洗脱体积 ( m L ) 注： 峰 2 为苦瓜凝集素洗脱峰 T h e s e c o n d p e a k i s p e a k o f M C L 图 2 D E一2 3离干交接层析洗脱曲线 F i g 2 E l u t i o n p r o fi l e o f i o n - e x c h a n p e c h r o r r m t o g r a p h y b y D E 2 3 3 讨 论 凝集素是一类凝集细胞或沉淀糖复合物的非免疫来源的蛋 白。在动植物体内已发现了多种多样 的凝集 素， 其生物学作用涉及到许多重要的生理和病理活动， 如受精、 发育、 细胞增殖、 分化， 内环境稳定、 免疫应答、 感染、 炎症、 癌细胞转移及与血栓形成有关的心脑血管病等 。本研究发现苦瓜凝集素备提物( 0 6 7 m g m L ) 对小麦赤霉病菌和棉花黄萎病菌的抑菌率分别为 6 9 1 2 和 6 4 8 6 。 龚大春_ 6 曾报道 ， 苦瓜种子蛋 白对致病菌金黄色葡萄球菌 、 猪源致病性大肠杆菌、 鸡源致病性大肠杆菌 都有抑菌作用 ， 而对消化道 、 呼吸道常在菌抑菌作用不明显。本研究发现苦瓜籽粗蛋 白( 6 6 7 n a g m 1 ) 对苹果 炭疽病菌的抑菌率达 6 8 6 1 。表明苦瓜种子不