黑木耳多糖提取工艺的优化.pdf

2 0 0 7 年5 月 农 业 机 械 学 报 第3 8 卷第5 期 黑木耳多糖提取工艺的优化 刘大纹 李铁柱 孙 永海 * I 摘要1 利用超微粉碎技术结合超声波协 同纤维 素酶提取黑 木耳 多糖， 提高 了黑木耳 多糖的溶 出率 。建立 了 温度 、 p H值 与黑木耳粗多糖溶 出率的回归方程 ， 获得 了超 声波协 同纤维 素酶酶解黑 木耳工艺 的最佳参数 为： 超声 波频率 2 0 k Hz 、 超声波功率 2 0 w、 酶解温度 4 1 8 8 C、 p H 值 4 6 1 、 时 间 1 6 0 rai n 。 关键词 ：黑木耳多糖提取工艺优 化 中图分类号 ： T S 2 0 1 1 文献标识码 ： A Opt i mi z a t i o n o f Ex t r a c t i o n Te c hn o l o g y o f J e w S Ea r P0 l y s a c c ha r i d e Li u Da we n Li Ti e z hu Sun Yo ng h a i ( 1 T o n g h u a Pr o f e s s i o n a l S k i l l C o l l e g e 2 J i l i n U n i v e r s i t y ) Ab s t r ac t Th e c e l l wa l l o f J e w S e a r i s b r o k e n b y t h e c e l l u l a s e e n z y ma t i c h y d r o l y s i s wi t h u l t r a s o n i c t e c h n o l o g y a f t e r p r o c e s s e d b y s u p e r mi c r o mi l l ， wh i c h ma k e s i t s p o l y s a c c h a r i d e g o e s t h r o u g h t h e b r o k e n c e l l i n t o h y d r o l y t i c l i q u i d，a s a r e s u l t ，mo r e J e w S e a r p o l y s a c c h a r i d e wi l l b e g a i n e d Th e pa r a me t e r s o f t h e e x pe r i m e nt we r e o p t i mi z e d b y t he e xp e r i me nt a l d e s i g n m e t ho d a n d a r e gr e s s e q u a t i o n o n t e mp e r a t u r e ，p H a n d J e w S e a r p o l y s a c c h a r i d e d i s s o l v i n g r a t e wa s d e v e l o p e d b y s t a t i s t i c a n a l y s i s o f t h e q u a d r a t i c g e n e r a l r o t a r y d e s i g n Th e o p t i mi z e d p a r a me t e r s o f J e w S e a r po l ys a c c h a r i d e e xt r a c t i on b y t he c e l l u l a s e e nz yma t i c hy dr o l ys i s wi t h u l t r a s o ni c t e c hn ol o gi e s we r e ob t a i ne d， whi c h a r e u l t r a s o ni c f r e q ue nc y o f 2 0 kHz， ul t r a s o ni c p owe r o f 2 0 W ， e n z y ma t i c hy dr o l ys i s t e mpe r a t ur e o f 4 1 88 C ，p H4 61 a nd pr o c e s s i ng t i me of 1 6 0 mi n Ke y wo r d s J e w S e a r ，P o l y s a c c h a r i d e，Ex t r a c t i o n t e c h n o l o g y，Op t i mi z a t i o n 引言 黑木耳属于担子菌纲， 细胞壁关键组分几丁质 和 p 一 葡聚糖 ， 质地坚韧不易被人体消化， 所以黑木耳 细胞壁内所含有的其他多种有效成分也很难透过细 胞壁被人体所吸收n 。 破碎黑木耳细胞壁 ， 使黑木耳 细胞内富含的功能性成分溶于水中， 对提高黑木耳 的消化吸收率有十分重要的意义。 多糖常 用的提取方法有 ： 热水 浸提 法、 酸 浸提 法、 碱浸提法 、 酶法等_ 2 。传统黑木耳多糖提取采 用水体系， 需要多次浸提 ， 操作时间长， 收率低 。 酸浸 收稿 日期：2 0 0 6 1 21 1 *占林 省科学技术厅资助项 目( 项 目编号 ： 2 0 0 5 0 5 3 6 ) 刘大纹通 化市职工大学副教授 ，1 3 4 0 0 0 吉林省通化市 李铁柱 吉林 大学生物 与农 、II 工程学院 博士生 1 3 0 0 2 5 长春市 孙 永海吉林 大学生物与农 I ， 工程学院教授通讯作 提法和碱浸提法容易使部分多糖发生水解， 破坏 多 糖的活性结构、 减少多糖得率。 本文采用超微粉碎技 术 ， 超声波协同纤维 素酶酶解工艺破碎黑木耳细胞 壁提取木耳多糖 。 l 试验材料及方法 1 1 试验材料 主要试验材料及试 剂 见表 1 ， 分析中采用的化 学试 齐 lJ 均 为 分析纯 。 1 2 主要仪器设备 J MS一8 0型变速胶体磨， 河北省廊坊市通用机 维普资讯 第 5期 刘大纹 等 ：黑木耳多糖提取工艺的优化 1 0 1 表 1 主要试 验材料和试剂 Tab 1 M ai n r e a g e nt s a nd m at e r i a l s u s e d i n e x pe r i me nt s 材料及试剂 生产厂家 黑木耳 葡萄糖 蒽酮 硫脲 无水 乙醇 盐酸 硫酸 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 邻苯二甲酸氢钾 纤维素酶( 1 0 0 0 0 U mL) 汪清林业 局 沈阳市试剂三厂 中国医药 集团 七海化学试剂公 司 北 京化工 厂 莱 阳市双双化工有限公司 北京化工厂 北京化工厂 上海爱建试剂 上海爱建试剂 上海爱建试剂 天津诺维信酶制剂公司 械厂。 J L9 2 0 0型激光粒度仪 ， 济南微纳公司。 C S F一 1 A型超声波发生器 ， 上海超声波仪器厂。 UV一 8 5 0 0 型紫外一 可见光分光光度计 ， 上海天美科学仪器有限 公司。P HS一2 C型数字酸度计 ， 国营万达仪器仪表 厂。 GB 2 o 4型分析天平 ， 瑞士 ME TT L E R T OL E DO 公司。DWF一1 0 0型电动植物粉碎机 ( 带 6 O目筛) ， 河北省黄骅县科研器械厂 。 1 3 试验方法 ( 1 ) 预热处理 研究表明， 黑木耳颗粒的粒度越小， 单位体积颗 粒表面积越大 ， 则相同条件下酶解反应的速度也越 快 ， 黑木耳粗多糖溶出率也越大。经预试验确定 ， 影 响黑木耳颗粒粉碎效果的因素有浸泡时间、 浸泡温 度、 黑木耳悬浊液的料水 比。 为了得 出黑木耳颗粒粉 碎的最佳工艺条件 ， 以黑木耳颗粒在粉碎前处理的 浸泡 温 度、 浸 泡 时 间、 料 水 比为 试 验 因 素， 采 用 L 。 ( 3 ) 正交试验方案 ， 以平均粒度为评价指标 ， 选择 最佳预热处理工艺条件。因素水平见表 2 。 表 2 预 处理因素水平表 Ta b 2 Fa c t o r s a nd l e ve l s o f pr e pr o c e s s i ng e xp er i m e nt ( 2 ) 协同酶解工艺 在超声波协 同酶解研究中， 经预试验 确定超声 波频率为 2 O k H z ， 功率为 2 O w， 酶解液中纤维素酶 添加量的体积分数为 1 6 。 进行了酶解温度、 酶解 p H 值对黑木耳粗多糖溶出率影响的二因素二次正 交旋转组合试验 ， 目的是优化黑木耳超声波协 同酶 解工艺试验条件 。粗多糖溶出率的含义是指经过超 声波协 同酶解后所得的粗多糖质量与黑木耳质量的 百 分 比 ( 溶液 中粗 多糖 测 定 采用 硫 酸 蒽 酮 比色 法 。 ) 。试验因素水平编码见表 3 。 表 3 试验因素水平编码表 Ta b 3 Expe r i me nt a l c o di ng f or f a c t or a n d l e v e l ( 3 ) 对 比试 验 为了验证采用超声波协同纤维酶酶解黑木耳工 艺的强化作用， 进行对 比试验并测定样品溶液粗 多 糖含量及计算粗多糖溶出率。 试验 1 ： 采用经典粗多糖提取方法。 取适量黑木 耳样 品， 置于 8 O l C 水浴条件下恒温提取 6 h 。 试验 2 ： 采用超微粉碎单因素提取方法。 取适量 黑木耳样品预热处理后经过胶体磨超微粉碎 ， 置于 8 O C水浴条件下恒温提取 6 h 。 试验 3 ： 采用超声波协同纤维 素酶酶解提取方 法。取 适 量 黑木 耳 样 品， 直接 采 用超 声 波 ( 频 率 2 O k Hz ， 功率 2 O w) 协同纤维素酶酶解超微粉碎的样 品， 酶解温度 4 1 8 8 C， p H 值 4 6 1 ， 时间 1 6 O rai n 。 试验 4 ： 采用超声波协 同纤维素酶酶解超微粉 碎的样品的提取方法 。取适量黑木耳样品预热处理 后 经 过 胶体 磨超 微 粉碎 ， 然 后采 用超 声波 ( 频 率 2 O k Hz ， 功率 2 O W) 协同纤维素酶酶解超微粉碎的 样品， 酶解温度 4 1 8 8 C， p H值 4 6 1 ， 时间 1 6 O rai n 。 2 试验结果与分析 2 1 预热处理试验结果与分析 由表 4可知 ， 在黑木耳粉碎前预热处理的试验 因素中， 料水 比是影响粉碎效果的最重要因素 ， 浸泡 温度其次 ， 浸泡时间的影响最小 。最 佳工艺条件 为 。B 。 C3 ， 即浸泡温度 6 O C、 浸泡时间 1 2 O rai n 、 料水 比 1：2 0 0 ， 这 时 黑 木 耳 颗 粒 的 平 均 粒 度 为 5 1 9 4 m， 考虑黑木耳吸水膨胀 因素， 此平均粒度 已达到超微粉碎的标准 。 2 2 协同酶解工艺试验结果与分析 试验结果 见表 5 ， 由表 5可得粗 多糖溶 出率 回 归方 程为 维普资讯 1 O 2 农业机械学报 表 4 正交试验结果 Ta b 4 Res u l t of or t hog o na l e x pe r i me n t 表 5 二次通用旋转组合试验结果 Tab、 5 Re s u l t o f qu a dr a t i c g en e r a l r o t a t i on uni t i z e d de s i g n 一 1 6 7 1 6 0+ 0 5 5 4 6 xl + 1 3 8 2 4 x2 + 0 4 4 2 5 xl 2 1 7 7 3 0 一2 6 9 5 5 x ： ( 1 ) 对 式( 1 )进 行显著性检 验啪， 首先进行失拟检 验 得 F f = 0 3 42 2 Ff 1 fJ 1 ( 5， 7) ： 7 4 6 表明已求得的回归方程的显著性 水平 为 0 0 1 ， 即置 信度为 0 9 9 。 将转换公式 一 兰 ! 二 Z一 2 - 4 。 一9 9 0 X2 0 7 8 代入式 ( 1 ) ， 经整理得酶解温度、 酶解 p H值与黑木 耳粗 多糖溶出率关系为 y一 一 9 7 9 5 5 4 + 1 2 5 1 k l + 3 8 4 6 8 3 z 2 + 0 0 5 7 3 z l 2 2 0 0 1 8 1 2 一4 4 3 0 5 z ； ( 2 ) 以超声波作用下的酶解温度、 p H值为 自变量 ， 粗多糖溶出率为因变量 ， 作酶解温度、 p H值对粗 多 糖溶 出率影响的三维图如图 1 所示。 20 茎 l 5 臻 寨 。 0 彝5 6 60 图 1 温度 、 p H值与粗 多糖溶 出率关 系 Fi g 1 Re l a t i ons h i p a mong t e mpe r at u r e，pH a n d po l y s a c c ha r i de d i s s ol vi ng r a t e ( 1 ) 超声波条件下温度对粗 多糖溶出率的影响 因为纤维素酶的酶解反应也是一种化学反应 ， 依然存在活化能 8 。所以， 在一定的温度范围内， 温 度对纤维素酶酶催化的影响也符合一般的化学反应 规律 ， 即纤维素酶分子的动能随着温度的增加而增 加 ， 从而加速反应速度。 图 1也证明当其他条件一定 时 ， 在一定范围内粗 多糖 的溶 出率也随着温度的升 高 而增 加 。 另一方面 由于纤维素酶是一种蛋白质， 在受热 的条件下会发生变性 反应 ， 温度对纤维素酶就存在 着激活与失活两方面的作用。酶反应的最适温度就 是这 2种过 程平 衡的结 果 ， 住 低 J ： 最适 温度 时 ， 激活 效应为主； 在高于最适温度时， 则失活效应为主 ， 为酶活性迅速衰失， 反应速度很快下降。 从图 1可以 看出， 当温度升高到一个特定值时 ， 粗 多糖的溶出率 则开始下降。可 见超声波条件下纤维素酶酶解反应 存 在 着最 优温 度。通 过 寻 优计 钟 ： 得 最 优温度 为 41 8 8( 。 ( 2 ) 超声波条件下 p H值对粗多糖溶m率影响 由 t ： 纤维素酶酶解反应过程的底物 、 中间产物 维普资讯 第 5期 刘大纹 等 ： 黑 木耳多糖提 取工艺的优化 1 O 3 以及最终 产物都是呈 电中性 的不可 电离 物质 ， p H 值主要是通过影响纤维素酶的电离和空间构象来影 响纤维素酶酶解反应 9 。在纤维素酶分子中含有大 量酸性和碱性基团 ， 这些基团在水中可以电离 。p H 值对酶的这些可电离基 团的电离起决定性 作用， 也 影响槎个酶分子的解离状 态， 所 以 p H值过高或过 低都可以使酶的构象发生变化引起不可逆的失活而 影响酶解反应的进程。 从图 1 可以看出， 当 p H值较 低时 ， 粗多糖的溶出率随着 p H值的增加而上升 ； 当 p H值增加到一个特定值时 ， 粗 多糖 的溶出率则开 始下降 。可见超声波条件下纤维素酶酶解反应也存 在着最优 p H 值 。通过 寻优 计算 得最 优 p H 值 为 4 6 1。 2 3 对比试验结果与分析 对比试验结果如表 6所示 。 在所做对 比试验 中， 惟有超声波协同纤维素酶酶解超微粉碎后的样品的 提取方法 ( 试验 4 ) 所测得的黑木耳粗 多糖溶 出率远 远高于其他提取方 法 ， 说明超声波协同纤维素酶酶 解经超微粉碎强化后效果明显提高。 表 6 对比试 验结果 Ta b 6 Re s ul t of c ompa r i s o n e xp e r i men t 试验 号 粗 多糖溶 出率 试验 号 粗 多糖溶 出率 l 2 0 5 2 3 3 8 6 4 3 2 2 5 7 9 2 9 4 1 6 9 8 7 6 3 结束语 采用超声波协 同纤维素酶酶解超微粉碎的黑木 耳颗粒 ， 提取功能性成分的方法十分有效 ， 而且具有 反应时间短、 反应条件温和、 细胞壁破碎彻底 、 粗 多 糖溶出率高的优点。 参考文献 1 徐锦堂中国药用真菌学E M 北京 ： 北 京医科大学 中国协和医科大学联合出版社 ， 1 9 9 7 2 吴梧桐 ， 陈琼 华 ， 徐碧如银耳孢子多糖的分离和分析 J 真 菌学 报 ， 1 9 8 2 ， 1 ( 2 ) ： 1 1 9 1 2 1 3 姜红， 孙宏鑫， 李晶， 等酶法提取黑木耳多糖 J 食品与发酵工业，2 0 0