乳铁蛋白测定方法的比较.pdf

一 申旦一一 一 一一 一 乳铁蛋白测定 方法 的比较 卢蓉苍 , 许时婴 , 王璋 江南大学食品学院 , 江苏无锡 摘要建立了种乳铁蛋白的测定方 法并进行了比较 。 免疚酶联吸附法灵敏度 高 , 最小检测限低 , 适合于乳铁蛋 白分离纯化的全程分析 高效液相色谱法快速准确 , 操作简便 , 可实现乳铁蛋白初步分离时的 同步分析分光光度法快 速简便 , 准确性稍差 , 适合于纯化后具有较高浓度的乳铁蛋白的在线分析 。 关键词乳铁蛋白免疫酶联吸附法高效液相色谱法分光光度法 中图分类号文献标识码文童编号 一一一 一,一, , 一 即 叩 , , 娜 叮 , 叮 , 叮 引 言 早在年 , 人们在牛乳 中发现了一种红色蛋白 , 它就是 乳铁蛋 白 , 以下简称 川 。 经过多年的研究 , 人们 发现可增强铁的传递和吸收 , 具有广谱的抑菌性等许多独 特的生理调节功能 。 可广泛应用 于食品与医药行业 ” 。 建立准确 、快速的 含量的测定方法 , 是进行分离 、 纯 化 、性质及 功能研究的基础 。 本文建立 了的免疫酶联吸附法 、 高效液相色谱法 、 分光光度法等测定方法 , 并 对这三种测定方法的准确性 、 相关性 、适用 范围进行了 比较 。 材料与方法 材料 标样电泳纯 , 纯度为公司粗制品 纯度为实验室自制精制品纯度为实验 室自制鼠抗血清以标样作为抗原 , 用鼠 收稿日期 一一 作者简介卢蓉蓉 一 , 女 , 讲师 , 在职博士研究生 , 从事乳品科学方面的研究 。 免疫制得 , 一“ 色谱柱 一 一 仪器 酶联免疫检测仪南京华东电子管厂 一 型系统公司型紫外 一 可见光分 光光度计上海仪器有限公司 。 方法 法参照文献【 。 法色谱条件 一 流动相值为 , 浓度为磷酸盐缓冲液 含流速为柱温为 进样 量为 林 检测器为检测器 , 检测波长为 。 波 长扫描 将精制品溶液 , 于 一 波长下扫描 , 测定吸光 度 。 结果与讨论 法测定 选择抗血清工作浓 度比为 , 配制质量浓度为 林 的系列溶液 , 测定值 , 阴性对照 。 根 , 据结果 , 做出工作曲线见图 。 回归曲线的线性范围为 此 最小检测限为 卜 验 。 结果表明 , 回收率在 一 之间 , 在 之间 。 表法回收率及精密度试验 火 期攀蹲以耐 一 工介恻定值妇妇 纷 犷均 一回叼 拿 率啊一加 一 质量浓度 卜 图法测定质且浓度的工作 曲线 配制标样系列 , 应用法测定 , 每一浓度水平平行 测定次 , 读取值后取平均 , 用工作曲线计算测定值 , 计算 回收率 、 标准偏差 、变异系数 见表 。 结果表明 , 回 收率在 一 之间 , 在 一 之间 。 表法回收率及精密度试验 期馨峰 户。 一少今侧定值矛 钊瘫 味 枣 刘琴 率矛咚 一昌户之 、 法测定 标样的分析图谱见图 。 标样 的保留时间为 。 恻 。 图标样的分析图谱 以不同浓度的标样进样 , 计算为 土 的 峰的峰面积 。 以峰面积对浓度作出标准曲线 , 见图 。 回归曲线 的线性范围为 一 , 相关系数为 。 法与法的比较 灵敏度 。 法 的最小检测限低于法个数 量级 , 灵敏度远高于法 。 准确性 。 法与法相比 , 法的变异系 数较大 , 相关性和准确性稍差 。 这是因为法的线性范围为 一 此儿 。 在测定时 , 对样品要进行多次稀释 , 才能保证读 取有效的吸光度值 。 此外 , 整个测定过程中试剂用量非常微量 大多数低于 卜 , 因此操作过程中不可避免地会给测定带 来误差 。 这种误差可通过多次平行测定 , 得到一定的弥补 。 法进样量虽然也是微量的 林 , 但可以做到准确 进样 。 质量型检测器可以很好地反映响应信号与浓度之间的正 比关系 。 因此 , 法的准确性非常好 , 平行测定之间的变异 性很小 。 对样品纯度的要求 。 法是依据抗原 、抗体 的特异 性反应 。 本文制备的鼠抗血清与 一 乳白蛋白 、 尸 一 乳球蛋 白 、 一 酪蛋 白 、 月 一 酪蛋 白均无特异性反应反应结果为阴 性 ,。 因此法可用于分离 、纯化 的全程分析 , 对样品 的纯度没有要求 。 本文采用的色谱柱是一种凝胶色谱柱 。 它主要是依 据相对分子质量 的差异来分离物质 的 。 图为粗制品的 图谱 。 当样品纯度不高 , 不仅会含有一些相对分子质 量不同的物质如乳 白蛋白 、 免疫球蛋白等 , 还会含有多种相 对分 子质量 为的物质 , 例如牛血清白蛋白 、 乳过氧化物酶 、 分泌性免疫球蛋 白等 。 这些物 质在凝胶色谱柱上的保留时间比较接近 , 会影响的 分离度 , 进而影响含量的准确测定 。 因此用峰面积外 标法测定含量 , 仅适用于高纯度 的样品 。 对于低纯度 的样品 , 利用凝胶色谱柱 , 可以分析样品中相对分 子质量的分布 , 从而快速判断预分离的效果 ”“ , 便于实现在 线检测 。 八曰八 六日一 曰叹乙 月 一 , 彩旧奢 质量浓度八 勺 法测定质且浓度的工作曲线 即 图 与法类似 , 进行测定法的回收率及精密度试 图粗制品的图谱 介 年第卷第期总第期 加葬翼殿瑙担四 此外 , 法分析所需要 的分析条件比较简单 , 酶联免疫 测定仪的价格低廉 。 法仪器设备比较昂贵 。 分光光度法测定 采用纯度为的溶液 , 在 一 下扫描 , 发现 由此可见 , 具有很高生物活性的的必然比较低 。 鉴 于分光光度法快速 、 简便 , 与法具有一定的相关性 , 虽然 准确性不是十分理想 , 但可利用这种方法快速地推算样品中 的含量 , 便于工厂中分离纯化过程 中的在线检测 。 在波长产生特征吸收峰见图 。 结论 玉日 波长 图的波长扫描 初乳原料中的质量浓度为卜 , 粗制品浓缩液 中的质量浓度低于 “。可见制备 粗制品的过程 中 , 的含量始终比较低 。分光光度法测定时, 低于 。 因此 , 用分光光度法测定粗制品中的含量准确性存在问题 。 由于法测定操作较为繁琐 , 一般需要一天以上的时 间 , 往往不能在进一步的分离纯化 中同步检测 。 而在 处有特征吸收 , 操作方便 。 为了考察分光光度法测定含量 的 可靠性 , 分析了分光光度法与法这两种测定方法之间的 相关性 。 分离纯化后 , 收集到的各分部中的浓度得到富集 。 对纯化后收集的各分部分别测定 。 值 , 并同时用法测 定其中的含量 , 结果见图 。从图 中可以看出 , 在分离纯化 后的产品分析中 , 分光光度法与方法之间具有一定的相 关性 。 图中也显示值未能达到一般分光光度法的线性范 围 一 。 这是 由于与铁饱和度有关 。 铁饱和度 的的 、仅为 川 。 万的铁饱和度越低 , 、就越低。 本 文制备的的铁饱和度低于 , 以致于 , 低于 。 低铁饱和度的具有很强的生理功能 ” 一。 的铁饱和 度越低 , 铁亲合性就越高 , 它能作为一种理想的铁载体 , 增加铁 的生物利用率 。 也正是 由于低铁饱和度 , 可以和病原性微生 物竞争性地结合铁离子 , 成为一种广谱的抑菌剂 。 抑菌活性取 决于铁饱和度 , 铁饱和度越低 , 抑菌活性就越高 。 当中的铁 完全饱和时 , 抑菌活性就会完全丧失 。 。 。扩 图 今 的质量浓度 法与分光光度法的相关性 法准确 , 灵敏度高 , 最小检测限低 , 对样品的纯 度没有要求 , 可用于分离纯化的全程分析 , 仪器价格低廉 , 应用面广 。 样品预先要进行适 当的稀释 , 操作较为繁琐 。 法快速准确 , 操作简便 , 适合于初步分离效果 的 监控 , 可实现初步分离时的同步分析 。 但对样品的纯度有一定 的要求 , 设备昂贵 。 采用分光光度法 , 在处测定吸光度 , 计算含 量 , 快速简便 , 准确性稍差 , 与法分析结果有一定的相关 性 。 适用于分离纯化后 , 具有较高浓度的的同步分析 。 参 考文献 【郭本恒 , 程玉倩 , 骆承库 , 乳铁蛋 白【中国乳品工业 , 一 【岛崎敬一于份卜工叼夕分离乙利用酪农科学 食品刃 研究 , 一 , 一 , 一 一 尽 【 叮 , 一 , , 一 币 叮 , , 一 【 , , 叮 , , 一