应用于转基因食品检测的PCR技术及其进展.pdf

2 0 0 7 年1 月 第2 2 卷第1 期 中国粮油学报 J o u r n a lo ft h eC h i n e s eC e r e a l sa n dO i l sA s s o c i a t i o n V 0 1 2 2 N o 1 J a n 2 0 0 7 应用于转基因食品检测的P C R 技术及其进展 孙大庆1 ，2闫冰1 2赵宁3姜毓君1 2 4 ( 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室1 ，哈尔滨1 5 0 0 3 0 ) ( 东北农业大学食品学院2 ，哈尔滨1 5 0 0 3 0 ) ( 东北农业大学生命科学学院3 ，哈尔滨1 5 0 0 3 0 ) ( 农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心4 ，哈尔滨1 5 0 0 3 0 ) 摘要近几年全球转基因作物种植面积连年大幅度增加，随之产生的转基因食品更是琳琅满目，然而 在转基因食品安全性尚无定论情况下，转基因食品的检测技术便显得尤为重要。在转基因食品检测中，P C R 技术由于具有快速、灵敏、准确等一系列优点，从而得到了迅猛发展。本文介绍了转基因食品检测中使用的各 种P C R 技术，并根据它们各自的原理对其优缺点进行了比较和探讨，同时阐述了检测过程中应该注意的一些 问题。此外，一些新技术与P C R 的结合，对P C R 技术的完善和发展提供了有力的支持，并在转基因食品检测 中取得了良好的效果。 关键词转基因食品P C R 检测靶序列 转基因生物( g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m ， G M O ) 又称遗传修饰生物，一般是指用遗传工程的方 法将一种生物的基因转入到另一生物体内，从而使 接受外来基因的生物获得它本身所不具有的新特 征，这种获得外源基因的生物称之为转基因生物。 转基因食品，虽然没有统一的定义，但可以理解为含 有转基因生物成分或者利用转基因生物如转基因植 物、动物或微生物生产加工的食品 。 当前转基因食品主要来源于转基因植物。据国 际农业生物技术应用咨询服务中心( I S A A A ) 统计， 2 0 0 4 年全世界转基因作物种植面积为81 0 0 万公 顷，比2 0 0 3 年增长2 0 。预计到2 0 1 0 年底，将会有 大约3 0 个国家15 0 0 万农民播种转基因作物，播种面 积将达1 5 亿公顷。据估计，用这些转基因作物生 产加工的食品全世界有近万种。转基因技术的快速 发展一方面展示出先进科学技术对生产力的巨大促 进作用，另一方面也引发了转基因作物对人体健康 基金项目：黑龙江省青年科学技术专项资金资助项目( Q C 0 5 C 5 5 ) ； 黑龙江省教育厅科学技术研究重大项目( 1 0 5 5 1 2 0 0 0 4 ) ； 黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目 ( 1 1 5 1 G 0 0 6 ) 收稿日期：2 0 0 6 0 2 一0 9 作者简介：孙大庆，男，1 9 7 9 年出生，硕士研究生，食品科学 通讯作者：姜毓君，男，1 9 7 1 年出生，副教授，食品科学 和生态环境影响的争论。为满足广大消费者的选择 权和知情权，同时由于国际贸易的需要，转基因食品 的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的 重视，而各种检测技术也随之发展起来。 食品中用来证明外源基因存在的生物大分子主 要是：蛋白质和D N A ，因此转基因食品检测方法也主 要有两大类：蛋白质水平上，主要是以免疫反应为基 础的酶联免疫法( E L I S A ) 和试纸条法。由于抗原抗 体反应特异性很高，所以这两项检测技术具有很高 的专一性，并且已被证明对于未加工转基因产品的 检测是有效的旧“J ，但检测性能常受到基因表达水平 的影响，而表达水平又会受制于植物的生理状态和 组织的差异。另外转基因食品中蛋白质很容易在食 品加工过程中失活、变性。因此这些因素对E L I S A 和试纸条法的可靠性、重珊胜产生很大的制约。 核酸水平上，主要是以P C R 技术为核心的技术 体系。一般检测启动子( 如花椰菜花叶病毒的3 5 S 启动子) 与终止子( 如农杆菌的n o s 37 终止子) 、报 告基因( 主要是一些抗生素抗性基因如卡那霉素、新 霉素抗性基因等) 和目的基因( 抗虫、抗除草剂、抗 病和抗逆等基因) 。与蛋白质水平的检测技术相比， P C R 具有检测范围广、灵敏度高、自动化程度高等优 点，因而P C R 技术在转基因食品检测中得到了快速 的发展和广泛的应用。 万方数据 第2 2 卷第1 期孙大庆等应用于转基因食品检测的P C R 技术及其进展 1 0 9 1 转基因食品的定性P C R 检测 转基因食品的P C R 检测有四个必要的步骤：取 样，D N A 提取，D N A 扩增和扩增产物的检测。在检 测过程中，有许多需要注意的问题，它们都直接影响 着P C R 的检测结果。 1 1 取样方法 取样目的是通过合理的取样方法得到能够真实 反映被检物的最少样品。取样或许是检测中最简单 的步骤，但它决定着检测的结果。因为取样存在一 定的偶然性，样品不可能与检测物1 0 0 成分一致， 因此利用统计学原理使取样点合理分布显得尤为重 要。对于转基因食品取样方法的研究已有一些报 道，这些研究考虑了原料类型( 未加工原料及其含有 物或深加工食品) 、可接受的检测底限和便于贸易等 因素5 】。 1 2 D N A 提取 D N A 的总量和纯度决定着扩增的效率，因此也 决定着P C R 检测转基因食品的效果。转基因食品中 D N A 总量受食品加工和D N A 提取过程中一些因素 ( 例如p H 值和温度的变化，核酸酶是否存在等) 的影 响，脱嘌呤作用和提取的D N A 分子大小也会影响靶 序列扩增的长度，另外食品中的某些成分或D N A 提 取中使用的试剂也可抑制P C R 反应。现在有很多方 法可用来提取D N A ，对于转基因植物D N A 的提取应 该注意多糖的存在。目前比较常用的是十六烷基三 甲基溴化胺( C T A B ) 和酚提取D N A 的方法。在检测 新的食品样品时，应考虑食品的类型和D N A 的状态 等因素，从而制定最合适的提取方法。 1 3 根据靶序列区分的检测方法 1 3 1 非特异性靶序列的检测方法 非特异性靶序列的检测方法可以检测含有相同 靶序列的所有转基因食品，它是目前最常用的检测 方法。转基因食品中常检测的靶序列是最先批准商 业化生产的转基因作物中普遍使用的启动子和终止 子，例如来自花椰菜花叶病毒的3 5 S 启动子1 和农 杆菌的n o s 3 终止子( 表1 ) ，另外转基因作物中为 了改善种植性状常使用的一些结构基因也被作为检 测的目标，例如苏云金芽胞杆菌编码B t 内毒素的 c r y l A ( b ) 基因被用于抗玉米螟的几种转基因玉米；而 n p t l I 基因用于检测新霉素抗性。非特异性靶序列的 检测方法可以利用多重P C R 技术改进其检测效 率7 | 。 表1检测3 5 S 启动子和n o s 3 终止子的转基因作物 靶序列种类 1 7 6 号玉米，B t l l 玉米，M O N 8 0 2 玉米，M O N 8 1 0 玉米， ，s s = 慕茄T M ，删嬲：F 番茄 R o u n d u pR e a d y 大豆T MB 3 3 一i n v 马铃薯 B t l l 玉米，G A 2 1 玉米，M O N 8 0 2 玉米 n o s 3 ， F l a v S v r 番茄T M ，N E M A2 8 2 F 番茄 R o u n d u pR e a d y 大豆” 虽然非特异性靶序列的检测方法可以检测大部 分的转基因食品，但对于不含有共同靶序列的个别 转基因食品却不能给与明确的鉴定。此外它可能产 生假阳性结果，这种情况是由于非转基因生物自然 条件下获得了靶序列造成的。例如花椰菜花叶病毒 的转染使自然条件下的花椰菜花也具有了3 5 S 启动 子。尽管该种方法存在不足，但它对于检测不了解 背景的转基因作物是很有效的筛选方法。， 1 3 2 特异性靶序列的检测方法 两个毗邻基因连接处的序列称为连接片段。虽 然连接片段的结构序列是复杂的( 图1 ) ，但对于一个 外源基因是专一的而且是转基因食品特异性检测较 理想的靶序列。连接片段通常是启动子与结构基因 或终止子与结构基因结合处的序列( 表2 ) 。 边缘片段 连接片段 圈l外缘基因与插入基因级的边缘片段和连接片段示意图 空白段：没有功能的D N A 序列； P l 和P 2 ：启动子； T l 和T 2 ：终止子； T M ：报告基因； G ：目的基因；l ：内含子 当一个外源基因能引起几种不同插入情况时， 特异检测该转基因产品的最好办法就是扩增它的边 缘片段。边缘片段是外源基因和插入位点处基因组 序列的结合部分，因此边缘片段对于被检测的转基 因产品具有很好的特异性。 万方数据 1 1 0 中国粮油学报 2 0 0 7 年第l 期 1 4 假阳性的处理 表2 特异检测方法中使用的一些连接片段 由于扩增反应的高度敏感性，P C R 技术不得不 面对可能产生假阳性结果的风险。在转基因食品检 测中造成假阳性结果有两个主要因素：D N A 片断的 非特异性扩增；P C R 的扩增产物受到了前期操作的 影响( 携带污染) 。一般利用验证扩增产物的方法来 解决前者，利用控制携带污染的方法来解决后者。 1 4 1 验证扩增产物 大量样品的检测分析中，为了避免非特异性扩 增产生的假阳性，验证扩增产物是必要的。用溴化 乙锭琼脂糖电泳检测扩增产物的大小是常用的验 证方法，但有时扩增产物大小相近，会造成扩增产物 条带的重叠，因此该方法不能作为一个准确的验证 方法。最可靠的验证方法是对扩增产物进行测序， 但它比较昂贵，通常不被采用。巢式P C R 常用于扩 增产物的验证，它使用第一阶段P C R 的扩增产物作 为第二阶段P C R 反应的模板，第二阶段使用的引物 是第一阶段引物结合的靶序列内部的一小段序列。 所以经巢式P C R 获得预期大小的D N A 片段是判断 结果呈阳性的有效证据。尽管巢式P C R 可以有效检 测非特异性扩增带来的假阳性结果，但同时它增加 了携带污染或交叉污染假阳性的风险。此外，限制 性酶切分析法和S o u t h e r n 杂交法也被用于验证扩增 产物。 近年有文献报道，将双探针和电化学发光技术 与P C R 相结合，不但有效的避免了非特异性扩增产 生的假阳性结果，而且与传统的凝胶电泳验证方法 相比不接触毒害物质，信噪比高，操作简便。在刘晋 峰等人的研究中，使用过量的标记有生物素和化学 发光剂三联吡啶钌的两种探针与变性的P C R 产物杂 交，因为只有含靶序列的目的产物能与两探针结合 并且能通过磁珠吸附分离出来进行电信号检测，因 此实现了检测的高效、准确和无毒害 8 。 1 4 2 携带污染的控制 因为阳性和假阳性结果获得的扩增产物序列是 相同的，携带污染产生的假阳性不能通过上述方法 得以解决，而只能在实验室中采取有效的防护措施 加以避免，例如对样品的制备和分析分别设置独立 的房间，检测中使用的仪器专用等。除了这些物理 防护措施，L o n g o ，M C 等人通过在扩增反应中使用 d U T P ( 代替a y r P ) 和尿嘧啶转葡糖基酶( U D G ) 来防 止携带污染的产生。U D G 在3 7 0 C 下能够有效去除任 何扩增前存在的D N A 上的尿嘧啶，随后U D G 在P C R 循环开始前的变性阶段被热灭活，因此对P C R 扩增 不会造成任何影响四J 。 1 5 P C R 产物的检测 对于P C R 产物的检测，常用的方法是溴化乙锭 琼脂糖和丙烯酰胺胶凝电泳法。它们的主要优点是 操作简便和低成本，因此几乎应用于所有分子生物 学实验室。但其准确性和分辨率不高，且难于定量 和自动化。另外，高效液相色谱或毛细管电泳法也 是检测P C R 产物的有效方法，例如反向离子对高效 液相层析技术，它以烷基化聚苯乙烯作填料并利用 紫外光吸收率来检测结果；毛细管电泳法由于与计 算机系统结合而具有自动化程度高的优点，同时可 以使样品和试剂用量大大减少0 1 1J 。 2 转基因食品的定量P C R 检测 随着转基因生物的商品化、贸易的国际化，越来 越需要发展能够对其进行精确定量的检测技术。在 P C R 反应后期，由于D N A 聚合酶活性减弱，引物与 靶序列的结合几率变小和合成材料的减少等因素， 使P C R 产物的终止拷贝数与样品中的起始靶序列浓 度之间不可能建立线性关系。近年来出现的定量 P C R 技术很好的解决了这些问题，目前在转基因食 品检测中最常用的是：竞争定量P C R ( q u a n t i t a t i v e c o m p e t i t i v eP C R ，Q C P C R ) 和实时定量P C R ( r e a l t i m eP C R ，R T P C R ) 技术。 2 1 竞争定量P C R Q C P C R 的定量是依赖于靶序列和已知浓度的 竞争序列对引物竞争结合的信号比较来实现的。因 为只有靶序列和竞争物以完全相同的效率扩增时才 能获得正确的定量结果，所以竞争物的设计成为Q c P C R 技术的关键。一个合适的竞争物必须满足两 个条件。首先，它能够与相同引物的靶序列共同扩 增；其次，它应该具有特殊的性质以便于区分原有的 万方数据 第2 2 卷第1 期孙大庆等应用于转基因食品检测的P C R 技术及其进展 1 1 1 靶序列。通常竞争物通过克隆靶序列进行D N A 重 组改造获得。在改变片段大小时应该小心谨慎，因 为这样很可能影响扩增的效率。 对于Q c P C R 产物的检测，也多使用溴化乙 锭琼脂糖电泳。近年诱导荧光检测系统( L I F ) 结合 毛细管凝胶电泳( C G E ) 的应用已经能够进行极其微 量的检测，而且增加了Q c P C R 产物定量的敏感性 和准确性，是一个有前景的方法2 | 。另外，持续变性 毛细管电泳技术( C D C E ) 允许靶序列和竞争物之间 存在很小的尺寸差异3 | 。这些技术都有效的促进了 Q c P C R 的发展。 2 2 实时定量P C R R T P C R 的最大特点就是每次循环后扩增产 物的数量能被实时监控。实时监控是通过使用荧 光标记实现的，荧光标记可以使染料结合到D N A 双链中( 嵌入因子) 或是一种复合的特异序列探针。 通常探针中携带一个激发下可发出荧光的荧光基 团和一个近距离内( 1 0 一l o o h ) 可以吸收荧光的猝 灭基团。当D N A 聚合酶5 一37 核酸外切活性 起作用( T a q M a n 探针) 或探针与扩增产物特异反应 ( 发卡型引物和分子信标) 时，荧光基团和猝灭基团 发生分离，因此，可以检测到荧光信号的增加。R T P C R 定量靶序列时使用的主要参数是荧光信号 本底和循环阈值( c t ) ，前者是可检出显著信号的最 小值，后者是荧光信号超过阈值时的循环数。为了 使结果具有良好的重现性，阈值应选择扩增的指数 期。在理想条件下，c t 值与反应初始时靶序列的拷 贝数成反比关系。这样就可以绘制出标准曲线从 而获得未知样品C t 值。 R T P C R 在一个离心管中同时完成了靶序列扩 增和产物检测过程，因此具有交叉污染风险小，可靠 性高和操作时间短等优点。这些优点促使R T P C R 技术得到了广泛的应用。但该方法的高成本问题一 定程度制约了它的普及。 近年有许多利用R T P C R 技术检测转基因作 物的文献报道，如玉米1 4 15 | 、大豆1 6 83 和烟草 等，并且该方法的检测底限大多小于0 0 1 ，鉴于国 际上目前设定的转基因限量是该方法检测底限的 1 0 0 倍以上，R T P C R 检测技术的灵敏度已完全能 够满足转基因产品检测的需要。 2 3 参照标准 任何定量分析的关键步骤都必须确定系统的标 准，标准通过已知浓度检测物构成的参照样品来制 定。检测转基因产品时，应尽量使用官方( 如欧盟参 考物和测量研究所，I R M M ) 核准的参照标准。现在 已有法定标准物的转基因作物还不多，但这方面的 报道在逐渐增加，例如玉米和大豆旧0 | 。法定标准物 是由未加工原料制备而成的。因为基质效应和加工 过程中完整D N A 分子的缺失可能导致样品中转基 因物质含量被低估，所以根据样品与法定标准物的 线性关系来定量应保持谨慎的态度。 3转基因食品的多重P C R 检测 多重P C R ( m u l t i p l e xP C R ，M P C R ) ，又称复合 P C R ，它是在同一P C R 反应体系里加上二对以上引 物，同时扩增出多个靶序列的P C R 反应，其反应原 理，反应试剂和操作过程与一般P C R 相同。 对于食品中转基因成分的检测最大的挑战莫过 于转基因生物数量的激增。根据F D A 公布的资料， 仅美国目前经过批准投入商业化生产的转基因作物 品种已经达到5 3 个，若加上处于研究阶段的作物品 种，其数量将大大增加。为了解决这个问题，许多实 验室都在研发能够同时检测多个转基因产品的 M P C R 检测技术。虽然M P C R 原理简单，但要使多对 引物同时满足合适的扩增条件存在一定困难，所以 寻找合适的扩增条件在M P C R 技术中是至关重要 的。 目前M P C R 技术已用于多种转基因作物的检 测嵋1 | ，对于M P C R 多实验室之间的重现性问题，现在 也得到了有效的解决口引。随着对定量检测的需求， M P C R 技术不但可以对多个靶序列进行定性检测，而 且发展了多重定量P C R 技术拉3 。另外，近年超分支 滚环扩增技术( H y p e r b r a n c h e dr o l l i n gc y c l ea m p l i f i c a t i o n ，H R C A ) 也被应用于转基因食品的检测。与 M P C R 比较，多重H R C A 只需要一对引物即可完成多 个靶序列的检测，有效地避免了M P C R 中多对引物 之间的干扰问题，因此更方便、更高效晗引。 4 展望 近年来，P C R 技术在转基因食品的检测中显示 了良好的优越性。然而，随着市场中新的转基因食 品大量出现，转基因食品检测在灵敏和准确定量的 基础上提出了高通量的要求。为了合理监控转基因 食品，并为转基因产品市场的发展提供出路，未来这 个领域的研究将会集中在建立简便、快速、灵敏、精 确和高通量的检测方法上。另外，建立法定标准和 确定法定标准物也是今后发展的方向。 万方数据 11 2 中国粮油学报 2 0 0 7 年第1 期 参考文献 1 王晶，王林，黄晓蓉食品安全快速检测技术北京：化 学工业出版社，2 0 0 2 ：1 7 1 1 7 2 2 B a u m g a r t eS ，T e b b eC C F i e l ds t u d i e so nt h ee n v i r o n m e n t a lf a t e o ft h eC r y lA bB t t o x i np r o d u c e db yt r a n s g e n i c m a i z e ( M O N 8 1 0 ) a n di t se f f e c to nb a c t e r i a lc o m m u n i t i e s i nt h em a i z er h i z o s p h e r e M o lE c o l ，2 0 0 5 ，1 4 ( 8 ) ：2 5 3 9 2 5 5 1 3 袁铁琰，张大兵，王全喜试纸条技术在转基因农作物 检测中的应用生物技术通报，2 0 0 4 ，5 ：3 7 3 9 4 S t a v eJ W P r o t e i ni m m u n o a s s a ym e t h o d sf o rd e t e c t i o no f b i o t e c hc r o p s ：a p p l i c a t i o n s ，l i m i t a t i o n s ，a n dp r a c t i c a l c o n s i d e r a t i o n s JA O A CI n t ，2 0 0 2 ，8 5 ( 3 ) ：7 8 0 7 8 6 5 G i l b e r t ，J S a m p l i n go fr a wm a t e r i a l sa n dp r o c e s s e df o o d s f o rt h ep r e s e n c eo fG M O s F o o dC o n t r o l ，1 9 9 9 ，1 0 ：3 6 3 3 6 5 6 C a n k a rK ，R a v n i k a rM ，Z e lJ ，e ta 1 R e a l t i m ep o l y m e r - a s ec h a i nr e a c t i o nd e t e c t i o no fc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u st o c o m p l e m e n tt h e3 5 Ss c r e e n i n ga s s a yf o rg e n e t i c a l l ym o d i - f i e do r g a n i s m s JA O A CI n t ，2 0 0 5 ，8 8 ( 3 ) ：8 1 4 8 2 2 【7 M a t s u o k aT ，K u r i b a r aH ，A k i y a m aH ，e ta 1 Am u l t i p l e x P C Rm e t h o do fd e t e c t i n gr e c o m b i n a n tD N A sf r o mf i v el i n e s o fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dm a i z e S h o k u h i nE i s e i g a k uZ a s s h i ， 2 0 0 1 ，4 2 ( 1 ) ：2 4 3 2 8 “uJ ，X i n gD ，S h e nX ，e ta 1 D e t e c t i o no fg e n e t i c a l l y m o d i f i e do r g a n i s m sb ye l e e t r o c h e m i l u m i n e s e e n c eP C R m e t h o d B i o s e n sB i o e l e e t r o n ，2 0 0 4 ，2 0 ( 3 ) ：4 3 6 4 4 1 9 L o n g oM C ，B e m i n g e rM S ，H a r t l e yJ L U s eo fu r a c i lD N A g l y c o s y t a s et oc o n t r o lc a r r y o v e rc o n t a m i n a t i o ni np o l y m e r a s ec h m nr e a c t i o n s G e n e ，1 9 9 0 ，9 3 ( 1 ) ：1 2 5 1 2 8 1 0 G a r c i a C a n a sV ，G o n z a l e zR ，C i f u e n t e sA H i g h l yr e - p r o d u c i b l eC a p i l l a r yG e lE l e c t r o p h o r e s i s ( C G E ) o fD N A f r a g m e n t su s i n gu r j c o a t e dc o l u m n s D e t e c t i o no fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dm a i z eb yP C R C G E J S e p S c i ，2 0 0 2 ， 2 5 ：5 7 7 5 8 3 11 G a r c i a C a n a sV ，G o n z a l e zR ，C i f u e n t e sA S e n s i t i v e a n ds i m u l t a n e o u sa n a l y s i so ff i v et r a n s g e n i cm a i z e su s i n g m u l t i p l e xp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，a n dl a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e E l e c t r o - p h o r e s i s ，2 0 0 4 ，2 5 ( 1 4 ) ：2 2 1 9 2 2 2 6 1 2 B o r s o nN D ，S t r a n s b a u c hM AW e t t s t e i nP J ，e ta 1 D i r e c t q u a n t i t a t i o no fR N At r a n s c r i p t sb yc o m p e t i t i v es i n g l e t u b eR T P C Ra n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s B i o t e c h n i q u e s ，1 9 9 8 ，2 5 ：1 3 0 1 3 7 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 L i mE ，T o m i t aA V ，T h i l l yW G ，e ta 1 C o m b i n a t i o no f c o m p e t i t i v eQ u a n t i t a t i v eP C Ra n dc o n s t a n t d e n a t u r a n t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sf o rh i g h r e s o l u t i o n d e t e c t i o n a n de n u m e r a t i o no fm i c r o b e a l c e l l s A p p l E n v i r o n m M i c r o b i 0 1 ，2 0 0 1 ，6 7 ：3 8 9 7 3 9 0 3 陈颖，徐宝梁，苏宁，等实时荧光定量P C R 技术在转 基因玉米检测中的应用研究作物学报，2 0 0 4 ，3 0 ( 6 ) ： 6 0 2 6 0 7 C o l l o n n i e rC ，S c h a t t n e rA ，B e r t h i e rG ，e ta 1 C h a r a c t e r - i z a t i o na n de v e n ts p e c i f i c d e t e c t i o nb yq u a n t i t a t i v er e a l t i m eP C Ro f l 2 5m a i z ei n s e r t JA O A CI n t 2 0 0 5 8 8 ( 2 ) ：5 3 6 5 4 6 陈颖，徐宝梁，苏宁，等实时荧光定量P C R 技术检测 转基因大豆方法的建立食品与发酵工业，2 0 0 3 ，2 9 ( 8 ) ：6 5 6 9 H u a n gC C P a nT M E v e n t s p e c i f i cr e a l t i m ed e t e c t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dR o u n d u p R e a d ys o y b e a n JA 鲥cF o o dC h e m ，2 0 0 5 ，5 3 ( 1 0 ) ： 3 8 3 3 3 8 3 9 B u m sM J ，V a l d i v i aH ，H a r r i sN A n a l y s i sa n di n t e r p r e t a t i o no fd a t af r o mr e a l t i m eP C Rt r a c ed e t e c t i o nm e t h o d su s i n gq u a n t i t a t i o no fG Ms o y aa sam o d e ls y s t e m A n a lB i o a n a lC h e m ，2 0 0 4 ，3 7 8 ( 6 ) ：1 6 1 6 1 6 2 3 刘冰峰，张延明，闰玉清，等利用实时荧光定量P C R 技术检测转基因烟草哈尔滨师范大学自然科学学 报，2 0 0 5 ，1 ( 2 1 ) ：6 9 7 2 K u r i b a r aH ，S h i n d oY ，M a t s u o k aT ，e ta 1 N o v e lr e f e r e n c em o l e c u l e sf o rq u a n t i t a t i o no fg e n e t i c a l l ym o d i f i e d m a i z ea n ds o y b e a n JA O A CI n t ，2 0 0 2 ，8 5 ( 5 ) ：1 0 7 7 1 0 8 9 徐景升，余爱丽，姚伟，等利用M P C R 技术快速检测 进口大豆转基因背景江西农业大学学报，2 0 0 5 ，2 7 ( 2 ) ：2 6 2 2 6 9 H e m a n d e zM ，R o d r i g u e z L a z a r oD ，Z h a n gD ，e ta 1 I n t e r l a b o r a t o r yt r a n s f e ro faP C Rm u l t i p l e xm e t h o df o r s i m u l t a n e o u sd e t e c t i o no ff o u rg e n e t i c a l l ym o d i f i e dm a i z e l i n e s ：B t l l ，M O N 8 1 0 ，T 2 5 ，a n dG A 2 1 JA 刚cF o o d C h e m ，2 0 0 5 ，5 3 ( 9 ) ：3 3 3 3 3 3 3 7 A k i y a m aH ，W a t a n a b eT ，W a k a b a y a s h iK ，e ta 1 Q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o ns y s t e mf o rm a i z es a m p l ec o n t a i n i n gc o m b i n e d t r a i tg e n e t i c a l l ym o d i f i e dm a i z e A n a lC h e m ， 2 0 0 5 ，7 7 ( 2 2 ) ：7 4 2 1 7 4 2 8 陶震，蔡兴锋，颜志强，等H R C A 技术在转基因植物 检测中的应用生物工程学报，2 0 0 3 ，1 9 ( 3 ) ：2 9 4 2 9 9 万方数据 第2 2 卷第1 期孙大庆等应用于转基因食品检测的P C R 技术及其进展 D e v e l o p m e n to fP C RT e c h n i q u ei nD e t e c t i o no f S u nD a q i n 9 1 ，2Y a nB i n 9 1 2Z h a oN i n 9 3 J i a n gY u j u n l ，2 ，4 ( N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ，K e yL a bo fD a i r yS c l e n c e ，M i n i s t r yo fE d u c a t i o n l ，H a r b i n 15 0 0 3 0 ) ( C o l l e g eo fF o o dS c i e n c ea n dI f n g i n e e r i n g ，N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y 2 ，H a r b i n1 5 0 0 3 0 ) ( C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e ，N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y 3 ，H a r b i n 15 0 0 3 0 ) ( G M Op r o d u c t sS u p e r v i s i o na n dI n s p e c t i o nC e n t e r ，M i n i s t r y A b s t r a c t N o w a d a y st h eg l o b a lp l a n t i n g o fA g r i c u l t u r e 4 ，H a r b i n 1 5 0 0 3 0 ) a r e ao ft r a n s g e n i cc r o p si si n c r e a s i n gq u i c k l y ， e g o r i e so ft r a n s g e n i cf o o d sa r ea l s oi n c r e a s i n g B e c a u s eo ft h ed i s p u t e sa b o u tt h es e c u r i t yo f t e c t i v et e c h n i q u e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l e I ti si n t e n d e di nt h i sa r t i c l et op r o v i d ea nu p d a t e d a tt h es a m et i m et h ec a t t r a n s g e n i cf o o d s ，t h ed e o v e r v i e wo nt h ep r i n c i p a l a p p l i c a t i o n so fd i f f e r e n tP C Rt e c h n i q u e st o g e t h e rw i t ht h e i rm a i na d v a n t a g e sa n dd r a w b a c k si nd e t e c t i o no ft r a n s g e n i c f o o d s A d d i t i o n a l l y ，s o m en o v e lt e c h n i q u e sp r o m o t i n gt h ei m p r o v e m e n ta n dd e v e l o p m e n to fP C Ra r ei n t r o d u c e d K e yw o r d st r a n s g e n i cf o o d s ，P C R ，d e t e c t i o n ，t a r g e ts e q u e n c e 心缄鲥缄纵纵缄缄瞰缄鲥缄蛐纵缄缄缄缄缄鲥缄缄缄纵蹦瞰撤缄心“S m 纵心“S 心“S 硇“S E 心E S 心 ( 上接第9 4 页) O p t i m i z i n gC o n d i t i o n sf o rE x t r a c t i o no fS h a r kO i lw i t h E n z y m a t i cH y d r o l y s i sb yR e s p o n s eS u r f a c eM e t h o d o l o g y W uX i a n g t i n g ( C o l l e g eo fA p p l i e dT e c h n o l o g yW e n z h o uU n i v e r s i t y ，W e n z h o u3 2 5 0 0 0 ) A b s t r a c tB a s e do ns i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t si n c l u d i n gr a t i oo fl i q u i d s o l i d ( W F ) ，a m o u n to fe n z y m e ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i st i m e ，p H ，t e m p e r a t u r e ，a n ds t i r r i n gr a t e ，t h r e ei m p o r t a n tc o n d i t i o nf a c t o r s a m o u n to fe n z y m e ，p H a n dt e m p e r a t u r e - - w e r eo p t i m i z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw i t ho i le x t r a c t a b i l i t ya st h ee v a l u a t i n gi n d e x e s T h eo b t a i n e do p t i m u ml e v e l so ft h et h r e ei m p o r t a n tf a c t o r sa r ea sf o l l o w s ：a m o u n to fe n z y m e5 3 0U g ，p H7 1a n d t e m p e r a t u r e4 5 7 。C T h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n so p t i m i z e db yo r t h o g o n a lt e s t sw i t ho i le x t r a c tr a t ea st h ee v a l u a t i n g d e xa r ea sf o l l o w s ：e n z y m a t i ch y d r o l y s i st i m e6 h ，s o l v e n ta m o u n t1 0 0 m L 2 0 9r a wm a t e r i a l ，t e m p e r a t u r e3 5 a n d 4 O K e yw o r d se n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，f i s ho i l ，e x t r a c t i o n ，r e s p o n s es u r f a c e ，o r t h o g o n a lt e s t l n p H 万方数据 应用于转基因食品检测的PCR技术及其进展应用于转基因食品检测的PCR技术及其进展 作者：孙大庆， 闫冰， 赵宁， 姜毓君， Sun Daqing， Yan Bing， Zhao Ning， Jiang Yujun 作者单位：孙大庆,闫冰,Sun Daqing,Yan Bing(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨 ,150030;东北农业大学食品学院,哈尔滨,150030)， 赵宁,Zhao Ning(东北农业大学生命科 学学院,哈尔滨,150030)， 姜毓君,Jiang Yujun(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 ,哈尔滨,150030;东北农业大学食品学院,哈尔滨,150030;农业部转基因生物产品成分监督检 验测试中心,哈尔滨,150030) 刊名： 中国粮油学报 英文刊名：JOURNAL OF THE CHINESE CEREALS AND OILS ASSOCIATION 年，卷(期)：2007，22(1) 被引用次数：6次 参考文献(24条)参考文献(24条) 1.王晶.王林.黄晓蓉 食品安全快速检测技术 2002 2.Baumgarte S.Tebbe CC Field studies on the environmental fate of the Cry1Ab Bt-toxin produced by transgenic maize (MON810) and its effect on bacterial communities in the maize rhizosphere 2005(08) 3.袁铁琰.张大兵.王全喜 试纸条技术在转基因农作物检测中的应用期刊论文-生物技术通报 2004(05) 4.Stave JW Protein immunoassay methods for detection of biotech crops:applications,limitations,and practical consider