饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾生长及组织生化组成的影响.pdf

收稿日期:2006208203;修订日期:2007206214 基金项目:广东省自然科学基金(05006223)资助 作者简介:刘晓华(1967 ) , 湖北武汉市人;博士研究生,正高职高级畜牧师;主要从事畜牧、 水产营养生理生化研究。Tel :027262728888; E2mail : liuxh101 通讯作者:谢从新,华中农业大学水产学院教授;主要从事生态研究。E2mail : xiecongxin mail. 研究简报 饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾生长及组织生化组成的影响 刘晓华1 ,2 曹俊明3 吴建开3 周 盟3 蓝汉冰3 谢从新1 (1 1华中农业大学水产学院,武汉 430070; 21武汉市农科院畜牧兽医科学研究所,武汉 430065; 31广东省农科院畜牧研究所,广州 510640) EFFECTS OF GSH SUPPLEMENTATION IN THE DIET ON GROWTH PERFORMANCE AND TISSUE BIOCHEMICAL COMPOSITION OFLITOPENAEUS VANNAMEI LIU Xiao2Hua1 ,2,CAO Jun2Ming3,WU Jian2Kai3,ZHOU Meng3,LAN Han2Bing3and XIE Cong2Xin1 (11College of Fisheries , Huazhong Agriculture University , Wuhan 430070;21Institute of Animal Science , Academy of Wuhan Agricultural Sciences Wuhan 430065;31Institute of Animal Science , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangzhou 510640) 关键词:凡纳滨对虾;谷胱甘肽;生产性能;组织蛋白;血淋巴细胞计数 K ey words :litopenaeus vannamei; G lutathione(GSH) ; Growth performance; Tissue biochemical composition; Number of haemocytes 中图分类号:S963173 文献标识码:A 文章编号:100023207(2008)0320440205 凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)自1994至1995年在我 国引种并试养成功,因其具有抗逆能力强、 营养要求低、 生长 速度快、 饲料转化效率高、 加工出肉率高等诸多优点得以迅 速推广,已成为目前我国广泛养殖的重要经济水产动物。但 随着规模化、 集约化养殖程度的提高,养殖过程中所出现的 大量的应激因子如营养、 拥挤、 环境变化等经常会导致虾体 代谢的紊乱,抗病力下降,疾病易流行和爆发。因此,抗应激 饲料添加剂的研制和开发日益成为当前研究的热点。 谷胱甘肽 (N 2 (N 2L2 2glutamyl2L2cysteinyl) glycine , GSH)作 为一种活性小肽,已被证明是动物肠道氨基酸的一种重要的 吸收形式1 ,2。已经证实GSH具有保护动物肠黏膜、 调节免 疫系统、 促进DNA、 蛋白质的合成,促进细胞的生长与增殖等 功能。Zambohino ,et al1 提出GSH能提高鲈鱼生长速度和成 活率,并且能极大减少骨骼的畸形3。最新研究还表明,GSH 能通过调节仔猪4和黄羽肉鸡5的生长轴从而促进它们的 生长,并且能调节仔猪、 黄羽肉鸡的抗氧化能力。GSH在水 产动物中的应用研究尚处于起步阶段。焦彩虹6在罗非鱼 饲料中添加GSH 8周后,发现罗非鱼的生长性能和肝脏总抗 氧化能力有所提高,肝脏中SOD活性出现差异,饲料中添加 200 mg/ kg剂量组肝脏中GSH2PX和GR活力显著高于对照 组,GSH能促进罗非鱼离体肝细胞的增殖和IGF21的分泌。 有关GSH在甲壳动物中的研究尚未见报道。本试验以凡纳 滨对虾为研究对象,旨在初步研究饲料中添加GSH对凡纳滨 对虾生长的影响,为GSH在凡纳滨对虾日粮中应用提供理论 依据。 1 材料与方法 111 试验饲料 以酪蛋白、 明胶为蛋白源,玉米淀粉为糖 源,鱼油和豆油为脂肪源,矿物质和维生素参考文献7略有 修改配制基础日粮并作为对照组饲料(表 1) 。在基础日粮中 分别添加60、120、180、240和300mg/ kg GSH配制5种试验饲 料。GSH购自AMRESCO公司,纯度 9810 %。所有饲料原 料经60目过筛,混匀,经双螺杆挤压机制粒,干燥, - 20 冷 藏保存。 112 试验虾及饲养管理 试验凡纳滨对虾来自中山大学珠 海试验基地,试验开始前放在珠海基地循环系统(每套循环 系统24个水族缸,每个缸容积250L)中暂养2周,期间投喂 对照饲料,然后将初始均重为 (1 1120101) g/尾的凡纳滨对 虾随机分箱。每种饲料设4个平行,每个平行养虾30尾。水 源为经沙滤、 消毒后的天然海水加自来水调配成盐度为 58 的人工海水,水温2530。养殖过程不断充氧曝 气,溶解氧 (7 1250156) mg/L ,氨氮 (0 1170106) mg/L ,亚硝 第32卷 第3期 水 生 生 物 学 报 Vol. 32 ,No . 3 2 0 0 8年5月ACTA HY DROBIOLOGICA SINICAMay , 2 0 0 8 酸氮 (0 101801008)mg/L ,pH(719501 04) 。按体重的8 %确 定投饲量,分别于每天的7:00、12:00、16:00和20:00投喂。 每3周称一次体重,根据体重调整投喂量。饲养实验期为 56d。 表1 基础日粮配方及营养组成 Tab11 Formulation and proximate composition of the basal diet( %) 成分Ingredient含量Content ( %)成分Ingredient含量Content ( %) 酪蛋白Casein3215胆固醇Cholesterol110 明胶Gelatin810 2纤维素 2cellulose310 玉米淀粉Corn starch2214黏合剂Binder115 鱼油Fish oil615BHA Antioxidant(BHA)011 乌贼粉Squid meal210多维1Vitamin mix1510 大豆磷脂(50 %) Soybean lecithin210复合矿2Mineral mix21510 氯化胆碱(50 %) Choline chloride110 营养组成(实测值) Proximate composition( %) 粗蛋白Crude protein36151灰分Ash8167 粗脂肪Crude lipid7187水分Moisture11122 1多维(IU/ kg预混料) Vitamin premix(IU/ kg premix) :VA, 1600000IU; VD, 80000IU; VE, 4000 IU; VK 3, 400 IU; VB1, 1200 IU; VB2,1200 IU; VB6,2000IU;泛酸Pantothenic , 3000 IU;烟酸Niacin , 6000 IU;生物素Biotin , 40 IU;叶酸Folic acid , 400 IU; VB12, 2g;肌醇Inositol , 6000 IU ;VC, 20000 IU;沸石粉Zeolite ,861112g 2复合矿(g/ kg预混料) Mineral premix(g/ kg premix) :Ca(H2PO4) H2O , 265111g;无水CaCl2, 253124g;NaCl , 59134g;KCl , 114154g;MgSO47H2O , 146108g; CuSO45H2O , 0184g; FeSO47H2O , 4195g; ZnSO47H2O , 3167g; MnSO4H2O , 5116g; KI , 01008g; CoCl2H2O , 010532g; Na2SeO4,010066g; 沸石粉Zeolite ,239127g 113 样品收集与分析 饲养试验结束时,停止喂料24h ,虾 体称重,统计死亡率。每个平行随机取15只虾,自头胸甲和 第一腹节之间抽取淋巴8,注入Ependoff离心管 (1 1 5mL) 中, 4 冰箱静置34h ,3500r/ min离心15min ,取上层血清于 - 80 冰箱中保存备用。同时剥离肝胰脏,称重后置于 - 80 低温冰箱保存备用,并采集肌肉和鳃丝分别制备样品 冷冻保存。 另外每个平行再随机取虾3只,参照文献9略做改动, 每只虾用1mL消毒的注射器吸取011mL预冷 (4 )的对虾抗 凝剂,抽取血淋巴,混匀,4 保存,用于血淋巴细胞计数。采 用Lowry10法,以小牛血清蛋白作为标准测定组织蛋白含 量,采用DTNB分光光度法测定组织GSH含量11。 114 数据统计分析 实验结果用平均数 标准差 (x s) 表 示,用SPSS1210版软件进行ONE2WAY,AVONA分析,然后进 行DUNCANS多重比较法分析实验结果平均数的差异显 著性。 2 结 果 211 试验虾的成活率、 增重率和饲料转化效率 从表2可以看出,饲料中添加GSH能不同程度地提高 凡纳滨对虾的成活率、 增重和饲料转化效率。与对照组(组 1) 相比,各试验组的成活率分别升高了8153 %31169 % ,其 中以第3组的成活率最高,显著高于第1、 第2、 第5、 第6组 (p 01 05) 。随着 GSH添加量的增加,凡纳滨对虾的增重率逐渐增加,在第4 组达到最高,分别与除第3组外的其他四组呈现显著差异 (p 0105) ;随着GSH添加量的进一步升高,增重率下降,但 仍显著高于对照组(p 01 05) 。以增重率为指标,得到增重 率和添加量之间的一元二次回归方程为:y= - 010032x2+ 111144x+ 270139 ,R2= 017497(图 1) 。经计算,饲料中GSH 的最适添加量为174113mg/ kg。饲料中添加GSH不同程度提 高了凡纳滨对虾的饲料转化效率,与对照组相比,除第2组 外,其他4组的饲料系数均分别呈现显著差异(p 01 05) 。 图1 饲料中添加GSH对凡纳滨对虾增重率的影响 Fig11 E ffect of dietary GSH supplementationon the weight gain rate oflitopenaeus vannamei 3期刘晓华等:饲料中添加谷胱甘肽对凡纳滨对虾生长及组织生化组成的影响441 表2 谷胱甘肽对凡纳滨对虾生长性能的影响 Tab12 E ffects of dietary GSH supplementation on the growth performance oflitopenaeus vannamei 组别 Group No1 GSH添加量 GSH supplementation(mg/ kg) 成活率 Survival rate( %) 增重率 WGR1( %) 饲料转化效率 FCE2 10681343133a27714738163a01390108a 260741175169b3031420144ab01430112ab 3120901003185d3721059158c01460111bc 4180851001193dc3871318163c01530108cd 5240831332172c32312239113b01630104e 6300811672131c32518225198b01590110de 注:表中同一列数字后上标不同表示差异显著(p0105) ;表3、4同 Note : Values in the same row with different superscripts are significantly different(p0105) ; The same as Tab13 , 4 1WGR:weight gain rate = ( Final weight2 Initial weight)/ Initial weight100;2FCE:Feed conversion efficiency= ( Final weight2Initial weight)/ Diet 212 凡纳滨对虾的组织蛋白含量 由表3可见,饲料中添加GSH能不同程度地提高凡纳 滨对虾血清、 肝胰脏和肌肉的蛋白含量。随着饲料中GSH 添加量的升高,血清蛋白含量呈先升后降趋势,第3、 第4、 第 5组的血清蛋白含量分别比对照组显著升高(p 01 05) 。肝 胰脏、 肌肉蛋白含量与血清蛋白含量的变化趋势相似,其中 不同的是第6组的肝胰脏蛋白含量也显著高于对照组(p 01 05) 。 213 凡纳滨对虾的血淋巴细胞计数和肝胰脏GSH含量 如表4所示,饲料中添加不同浓度的GSH对凡纳滨对 虾的血细胞密度有较大影响。试验各组的血淋巴细胞计数 均显著地高于对照组(p 0105) ,且与GSH呈一定的量效关 系,在第5组达到最高;随着GSH添加量的进一步升高,血淋 巴细胞计数显著下降(p 01 05) 。与对照组相比,第2、 第3、 第4组虾肝胰脏的GSH含量显著升高(p 0105) ,其他二组 试验虾的差异未达到显著水平。 表3 凡纳滨对虾各组组织中蛋白含量 Tab13 Protein content in different tissues oflitopenaeus vannamei(mg/ mL) 组别 Group No1 GSH添加量 GSH Supplementation (mg/ kg) 血清 Serum 肝胰脏 Hepatopancrea 肌肉 Muscle 鳃丝 G ill 101151694160a351271168a121250187a81010103 2601231757128ab361100115ab121670157ab81870165 312013413611103b371710134c131260166ab81790166 418013613613144b391981106d131680171b81360151 52401331946186b371640158c121490160a81590187 63001251035179ab371400154bc121610149a81420173 表4 试验各组血淋巴计数和肝胰脏中GSH含量 Tab14 The number of haemocytes and GSH content in hepatopancrea oflitopenaeus vannamei 组别 Group No1 GSH添加量 GSH Supplementation(mg/ kg) 血淋巴计数 Numner of haemocytes (106/ mL) 肝胰脏GSH GSH content in hepatopancrea(mg/ mL) 1031590151a311462109a 26041620131b481004103d 312041920134b431946171cd 418051260130b411254141bcd 524081170189d341275171ab 63006160136c371715100abc 442 水 生 生 物 学 报32卷 3 讨 论 GSH在凡纳滨对虾中的应用研究尚属空白,在仔猪、 黄 羽肉鸡、 罗非鱼中的应用也刚刚起步。刘平详4在仔猪日粮 中添加50200 mg/ kg GSH能提高仔猪采食量、 平均日增重、 体重、 饲料报酬,并提高仔猪血清中的IGF2 和leptin含量; 在黄羽肉鸡5中添加80160mg/ kg GSH,能提高肉鸡血清中 GSH含量,对肉鸡生产性能也有促进作用。在罗非鱼6日粮 中添加100400mg/ kg GSH,能显著提高罗非鱼摄食率、 饲料 转化率、 蛋白质效率和生长速度。本试验结果表明,在凡纳 滨对虾日粮中添加一定量的GSH能提高虾的成活率、 增重 率和饲料转化效率。有资料表明,GSH在动物肠腔12和肠 黏膜细胞13中起着保护肠黏膜免受毒物和过氧化物的损伤 的作用。肠腔GSH可跨小肠绒毛刷状缘被完整吸14; GSH 在小肠上皮细胞内将脂质过氧化产物清除,发挥对脂肪酸氢 过氧化物的脱毒作用12;外源性GSH被小肠吸收后,可降低 肠上皮细胞对脂质过氧化产物的吸收,进一步保护着肠黏 膜15。还有研究发现,GSH对激素分泌具有调节作用:对大 鼠胰岛细胞的体外培养试验表明,外源性GSH(0101mmol/L) 可促进葡萄糖介导的胰岛素分泌16。所以,可以认为GSH 可能通过影响凡纳滨对虾一系列生理活动而影响着凡纳滨 对虾机体的生长、 提高饲料转化效率和成活率,其具体作用 机理有待进一步研究。 进一步分析发现,本实验以对虾增重率作为评价指标计 算出在饲料中的最佳添加剂量为174113mg/ kg ,添加量继续 增加,试验虾的增重率呈现下降趋势。观察试验虾血淋巴细 胞计数和组织蛋白变化,也表现出近似情况。这说明饲料中 添加GSH在一定范围内发挥积极作用,但超过一定剂量后, 作用不太明显,有的甚至产生一定的抑制效应。这可能是由 于过多的GSH摄入体内,会对虾体代谢产生一些不利影响。 因为已有研究结果表明,虽然GSH在清除自由基中发挥抗 氧化作用,但过多的GSH可与多种化合物(如醛类、 醌类、 卤 烯烃等)结合产生毒性代谢物,这些代谢物可与DNA共价结 合或产生氧自由基或肿瘤17,毒性代谢产物的长期积累对 机体产生不利影响。Steven ,et al118还报道,GSH本身也可 以作为氧化物的前体,在较高的浓度时产生毒性。高姝 娟19用ESR技术研究GSH对NADH诱导的心肌线粒体自由 基损伤的氧化机制时也发现这一规律。 本实验结果还表明,饲料中添加GSH能提高凡纳滨对 虾血淋巴细胞数量和肝胰脏中GSH含量。甲壳动物依靠细 胞免疫和体液免疫来抵制外界不良刺激、 减少感染、 消除疾 病9。其中细胞免疫主要依靠血淋巴细胞。对虾血淋巴细 胞分为3种20:无颗粒细胞(透明细胞)、 小颗粒细胞(半颗 粒细胞)和颗粒细胞。无颗粒细胞具有吞噬作用;小颗粒细 胞在防御反应中胞吐作用与识别异物能力活跃21;颗粒细 胞内有大量的颗粒,含有大量的酚氧化酶原,激活后释放酚 氧化酶(PO) ,从而对细胞免疫反应发生作用。Johansson ,et al121认为,它们的染色与哺乳动物白细胞中的粒细胞相近, 所以对虾血淋巴细胞可能在防御中起重要作用。对虾血细 胞数量上升和成活率升高的一致性关系从一个方面表明饲 料中添加GSH可能通过增加凡纳滨对虾血淋巴细胞中的细 胞数量,提高对虾的免疫功能,这为进一步深入研究GSH对 对虾细胞免疫功能的影响提供了有益的线索。本试验中外 源GSH提高了凡纳滨对虾肝胰脏中GSH的含量,说明外源 添加GSH能在机体组织中蓄积,发挥它的生理功能,这同 Vincenzini22研究的结果一致。 致谢: 本实验得到广东省农业科学院水产研究室主任吴建开, 研究人员周盟、 蓝汉冰、 马力等的鼎立相助,在此,对他们表 示衷心的感谢! 参考文献: 1 AddisonJ. 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