山茱萸多糖提取过程研究.pdf

第30卷 第1期 2003年 北 京 化 工 大 学 学 报 JOURNAL OF BEIJ ING UNIVERSITY OF CHEMICAL TECHNOLOGY Vol. 30 , No. 1 2003 山茱萸多糖提取过程研究 李 平 王艳辉 马润宇 3 (北京化工大学可控化学反应科学与技术基础教育部重点实验室,北京 100029) 摘 要:通过单因素实验及正交实验对提取液中多糖含量的各种影响因素进行了研究,确定了山茱萸多糖最佳提 取工艺条件:提取温度80,提取时间2h ,料液比116 ,原材料粒度300450m ,提取次数4次,脱蛋白次数6次。 在此条件下提取并用DEAE2cellulose柱层析分离得到白色多糖PFCA,经IR检测为含有糖苷键的多糖。 关键词:山茱萸;多糖;正交实验;提取;分离 中图分类号: R284. 2 收稿日期: 2002207205 第一作者:女,1973年生,博士生 E2mail : lpxa 3 通讯联系人 引 言 山茱萸(Fructus Corni)为山茱萸科植物山茱萸 (Cornus of f icinalis Sieb. et Zucc)的干燥果肉,首见 于秦汉时代成书的 神农本草经,临床应用已两千 余年,有益肾、 补肝、 涩精固脱等功效1。近年来对 山茱萸的化学成分的研究已有不少报道,但对其多 糖类化学成分研究的报道较少。本文通过单因素实 验及正交实验,对山茱萸多糖的水提取过程工艺条 件进行了研究,为山茱萸多糖水提过程工业化提供 了重要理论依据。 1 材料与方法 1. 1 仪器与试剂 722型可见光栅分光光度计,北京光学仪器厂; FC295自动馏分收集器,北京市新技术应用研究所; RE252旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂。 山茱萸干燥果实,四川省药检所;DEAE2Cellu2 lose ,Whatman公司;Sephadex G2200 ,Piscataway公 司;D ( + )2葡萄糖,Sigma公司;硫酸,重蒸苯酚,氯 仿,正丁醇,考马斯亮蓝等试剂皆为国产分析纯。 112 分析方法 糖含量测定采用苯酚2硫酸法2。标准曲线的 绘制:精确称取D( + )2葡萄糖20 mg ,用重蒸水定容 至100 mL作为标准液。将标准液分别稀释成浓度 为30、60、90、150、180g/ mL的溶液,取不同浓度的 溶液各013 mL置于10 mL试管中,加入50 g/ L重 蒸苯酚溶液016 mL混合后,迅速加入3 mL 98 %浓 硫酸,混匀,室温静置30min。用直径10mm石英比 色皿测定490 nm处吸光度,用重蒸水进行空白对照 实验。在与标准曲线绘制相同条件下测定多糖样品 含量,校正因子取为019。 蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法3。 113 原材料预处理 将已干燥的山茱萸粉碎,筛分为180300m、 300450m、 大于450m 3个粒度范围。将不同 粒度的山茱萸分别用8倍体积的95 %乙醇回流8 h 脱脂,冷却过滤,滤渣晾干即为提取多糖的原材料。 114 实验步骤 (1)提取:精确称取经预处理的原料,置于三口 圆底烧瓶中,加入一定体积的蒸馏水,在不同条件下 搅拌提取一定时间后,过滤、 离心、 取样分析。 (2)脱蛋白:将山茱萸水提取液减压浓缩备用, 取一份浓缩液加入1/ 5倍体积的氯仿和1/ 25倍体 积的正丁醇,振荡10min ,在转速为4000r/ min下离 心10 min ,分离,测定水相中蛋白浓度。 (3)透析:脱蛋白后的浓缩液用流动自来水透析 72 h ,蒸馏水透析1 h ,接着用4倍体积95 %乙醇醇 沉,离心,依次用无水乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤沉淀,50 真空干燥,得到浅褐色山茱萸水提粗多糖PFCA。 (4)分离:取少量粗多糖溶于水,离心,上清液上 DEAE2cellulose柱,依次用浓度为0 ,011 ,013 ,015 , 110 ,210 mol/ L NaCl溶液洗脱,洗脱流速1 mL/ min。分部收集洗脱液,对洗脱液进行浓缩、 透析、 醇沉、 洗涤、 真空干燥,得白色山茱萸多糖PFCA。 2 结果与讨论 在山茱萸多糖提取过程中,影响提取液中多糖 含量的因素很多,经初步实验选定提取温度、 提取时 间、 提取次数、 料液比及材料粒度作为主要影响因 素,以提取液中多糖含量为指标,在单因素实验的基 础上采用四因素三水平正交实验,对提取工艺参数 进行了优化。 211 提取时间对提取过程影响 称取粒度300450m的原材料20g ,加入240 mL去离子水,80下搅拌提取,每隔一段时间取 样, 4 000 r/ min离心5 min后,分析并计算多糖含 量,结果见图1。 图1 提取时间与多糖浓度关系 Fig. 1 Relations between concentration of polysaccharide and extraction time 由图1可知,在提取初期 (30 60 min) ,提取液 中多糖含量很低,提取原材料内多糖含量较高,此时 传质推动力(多糖含量差)较大,因而在图中表现为 斜率较大的直线段;随着提取过程进行,提取液中多 糖含量增大,原材料内多糖含量降低,传质推动力减 小,因而图中直线段的斜率减小,但多糖含量仍呈上 升趋势,当提取时间达150 min时多糖含量达到最 高;随着提取时间继续延长,部分多糖被氧化,多糖 含量反而下降。因此最佳提取时间为150 min。 212 料液比对提取过程影响 称取粒度300450m的原材料20 g ,分别加入 不同量蒸馏水,80 下搅拌提取150 min ,过滤,滤液 定容至500 mL ,分析并计算多糖含量,结果如图2。 由图2可知,多糖含量随水用量的增加而增大, 但水用量超过一定值后,再增加水的浓度,多糖浓度 随水用量增加而增加的幅度不大,同时,水浓度过 大,给多糖溶液浓缩带来的动力消耗等工作量加大, 因此水用量不宜过大。实验条件下,水最佳用量应 为料液比的1016倍。 213 提取温度对提取过程影响 称取粒度300450m的原材料20g ,加入240 mL去离子水,在不同温度下搅拌提取150 min ,过 滤、 离心、 定容至500 mL ,分析并计算多糖含量,结 果如图3。 图2 料液比与多糖浓度关系 Fig. 2 Relations between concentration of polysaccharide and multiple of water 图3 提取温度与多糖浓度关系 Fig. 3 Relations between concentration of polysaccharide and extraction temperature 由图3可知,在7090 多糖含量随温度升高 而增加,超过90 多糖含量随温度升高而降低,其 原因是提取温度超过90 时,部分多糖被氧化成其 他物质。因此实验条件下,提取最佳温度应在80 90 之间。选80、85、90 作为正交实验的温度水 平。 214 正交实验 为了综合考虑多因素对提取过程的影响,采用 三水平四因素正交实验对提取过程进行研究。根据 单因素实验结果确定各因素的合理水平。按照 L9(3) 4正交表设计的实验方案如表 1 ,结果及方差 分析如表2。 由表1、 表2可知,当提取时间为2 h ,提取温度 为80,水体积为320 mL ,材料粒度为300450 m时,提取液中多糖含量最高,因此初步确定优化 41北 京 化 工 大 学 学 报 2003年 提取工艺参数为:提取时间2h ,提取温度80,料液比116 ,材料粒度300450m。 表1 L9(3) 4 正交实验设计方案 Table 1 Orthogonal experiments design of L9(3) 4 序号 A 提取时间/ h B 提取温度/ C 水体积/ mL D 材料粒度/m 糖浓度 / ( g/ mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A1 110 A1 110 A1 110 A2 115 A2 115 A2 115 A3 210 A3 210 A3 210 B1 80 B2 85 B3 90 B1 80 B2 85 B3 90 B1 80 B2 85 B3 90 C1 240 C2 280 C3 320 C2 280 C3 320 C1 240 C3 320 C1 240 C2 280 D1 450 D2 300450 D3 180300 D3 180300 D1 450 D2 300450 D2 300450 D3 180300 D1 450 6713 8119 7511 7412 8411 7718 8811 8013 8011 表2 正交实验数据处理 Table 2 Disposal of orthogonal experiments data 项目 因素 ABCD R1 R2 R3 极差R 较优水平 22413 23611 24815 7418 7817 8218 810 A3 22916 24613 23310 7615 8211 7717 516 B2 22514 23612 24713 7511 7817 8214 713 C3 23115 24718 22916 7712 8216 7615 611 D2 因素主次ACDB 图4 提取次数与多糖浓度关系 Fig. 4 Relations between concentration of polysaccharide and extraction times 215 提取次数对提取过程影响 为研究提取次数对提取液中多糖浓度的影响, 在总料液比一定的条件下,研究提取次数对多糖含 量的影响,结果如图4。 由图4可知,在总料液比一定的条件下,随提取 次数的增多,提取液中多糖浓度增加,因此增加提取 次数可有效增加提取液中多糖含量。但由于增加提 取次数会增加操作工序,从而增加操作成本,因此提 取次数不宜太多,以4次较好。 216 脱蛋白次数对提取过程影响 多糖提取液中含有蛋白质、 核酸等杂质,常用三 氯乙酸法或Sevag法脱蛋白4。本研究用Sevag法 脱蛋白,结果如图5。 图5 蛋白质浓度与脱蛋白次数关系 Fig. 5 Relations between concentration of protein and protein clearing times 由图5可知,当脱蛋白次数达到6次后,水相中 蛋白基本脱除完全。 217 多糖的分离及鉴定 在实验确定的最佳工艺参数下,通过水提、 浓 缩、 脱蛋白、 透析、 醇沉、 离心、 真空干燥得到粗多糖 PFCA。取少量PFCA溶于蒸馏水,离心,上清液上 DEAE2cellulose柱,依次用浓度为0 ,011 ,013 ,015 , 110 ,210 mol/ L NaCl水溶液洗脱,洗脱流速1 mL/ min ,苯酚-硫酸法跟踪检测,分部收集洗脱液,绘 51第1期 李 平等:山茱萸多糖提取过程研究 制洗脱曲线,结果如图6。 图6 PFCA DEAE2纤维素柱层析洗脱曲线 Fig. 6 DEAE2cellulose elution curve of PFCA 由图6可知,用浓度为0210mol/ L NaCl溶液 洗脱可以得到4个洗脱峰,第三个洗脱峰为主要洗 脱峰,收集相应的洗脱液,洗脱液经过减压浓缩、 透 析、 醇沉、 洗涤、 真空干燥,得白色山茱萸多糖PFCA 。红外光谱检测表明,PFCA 在3 403(O H) 、 图7 PFCA 的红外光谱图 Fig. 7 IR spectrum of PFCA 2 935(C H) 、1 612 (C O) 、1 3291 424(C O) 及1 0131 148(CO)cm - 1有多糖的特征吸收峰 , 在830 cm - 1有吸收峰 ,而在890 cm - 1附近无吸收 峰,说明多糖PFCA分子结构中存在 2型糖苷 键5。 3 结 论 实验考察了山茱萸提取过程中工艺条件对提取 过程的影响,采用正交实验方法对提取过程的工艺 条件进行了优化,确定了山茱萸水提取的最佳工艺 参数:提取时间2 h ,提取温度80,料液比116 ,材 料粒度300450m ,提取次数4次,脱蛋白次数6 次。在最佳工艺条件下,对提取得到的山茱萸粗多 糖用DEAE2cellulose柱层析,得到白色山茱萸多糖 PFCA,对PFCA 进行IR检测得知该多糖为含 有糖苷键的多糖。 参考文献 1 周京华,李春生,李电东.山茱萸有效化学成分的研究 进展J .中国新药杂志,2001 ,10(11) :808 - 812 2 董 群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚2硫酸法测定多糖 和寡糖含量的研究J .中国药学杂志,1996 ,31 (9) : 550 - 553 3 鲁子贤主编.蛋白质和酶学研究方法(第一册) M.北 京:科学出版社,1989 4 方积年.多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定 J .药学通报,1984 ,19(10) :46 - 49 5 张翼伸.多糖的结构测定J .生物化学与生物物理进 展,1983(5) :18 - 23 Water extraction conditions of polysaccharide fromFructus Corni LI Ping WANG Yan2hui MA Run2yu (The Key Laboratory of Science and Technology of Controllable Chemical Reactions , Ministry of Education , Beijing University of Chemical Technology , Beijing 100029 , China) Abstract: In this paper , several factors of affecting the extraction process were studied through orthogon