乳清蛋白复合酶解条件优化及其水解产物对HMG-CoA还原酶活性的影响.pdf

S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yo fF o o dI n d u s t r y 研究与探讨 2 0 0 7年第0 1期 食品工业科技 乳清蛋白复合酶解条件优化及其水解产物 对 HMG- CoA 还原酶活性的影响 高学飞,王志耕%,陆爱华 ( 安徽农业大学畜产品加工研究所, 安徽合肥2 3 0 0 3 6) 摘要: 采用胰蛋白酶、 中性蛋白酶A . S 1 3 9 8组成复合酶联合水 解乳清蛋白, 建立了三因素( 水解温度T , 初始p H, 胰 蛋白酶活性占总活性的百分比) 与乳清蛋白水解度(D H) 之间的回归模型, 通过模型优化了胰蛋白酶、 中性蛋白酶 A . S 1 3 9 8联合水解乳清蛋白的条件参数, 并研究了在优化 的水解条件下,乳清蛋白不同阶段水解产物在体外对 H MG - C o A还原酶活性的影响。 关键词: 乳清蛋白, 联合水解, 条件优化,H MG - C o A还原酶 A b s t r a c t : Wh e y p r o t e i n w a s h y d r o l y z e d w i t h t w o k i n d s o f c o mme r c i a l p r o t e o l y t i c e n z y me s( t r y p s i n、n e u t r a l p r o t e i n a s e 1 3 9 8 ) . T h e mo d e lo ft h e d e g r e e o f h y d r o l y s i s (D H )w i t ht h es e l e c t e dt h r e ep a r a me t e r ( h y d r o l y s i s t e mp e r a t u r e , b e g i n n i n g p H a n d t h e p e r c e n t a g e o ft r y p s i n a c t i v i t y ) d u r i n g h y d r o l y s i s h a db e e nc r e a t e d . A c c a r d i n gt ot h emo d e l , t h e o p t i mi z e d h y d r o l y s i sc o n d i t i o n sp a r a me t e rf o rt h e mi x e d e n z y me s h y d r o l y z i n g w h e y p r o t e i n w e r e o b t a i n e d .T h e nt h ei n f l u e n c eo ft h eh y d r o l y z a t eo f d i f f e r e n t h y d r o l y z i n gp h a s eo nH MG - C o A r e d u c t a s ea c t i v i t yi nv i t r oh a sb e e ns t u d i e d . K e y w o r d s : w h e y p r o t e i n Ru n i t e d h y d r o l y z e Rc o n d i t i o n s o p t i mi z e d R H MG - C o Ar e d u c t a s e 中图分类号:T S 2 0 1 . 2 +5 文献标识码:A 文 章 编 号 :1 0 0 2 - 0 3 0 6(2 0 0 7)0 1 - 0 0 7 2 - 0 3 收稿日期:2 0 0 6 - 0 4 - 2 6 %通讯联系人 作者简介:高学飞(1 9 8 0 -) , 男, 在读硕士研究生, 从事畜产品品质与 加工等方面的研究。 基金项目:安徽省科技厅 “十五” 二期农产品加工重点科技攻关资助 项目(0 4 0 1 3 0 4 3) 。 乳清蛋白是一种重要的乳源食品蛋白。乳清蛋 白经蛋白酶水解不仅能够显著改善其乳化、起泡性 能 1 , 而且降解后产生的肽段更易于机体的转运、 吸 收及利用 2 , 其中一些肽段更是有着特殊的生理功能, 如降血压、 降胆固醇、 抗菌、 镇静等功能 3 7 。酶解乳清 蛋白获得功能肽在医药、保健食品等领域有着广阔 的应用前景。现代生物化学研究证明, 血清中胆固醇 主要来自肝脏生物合成,而三羟基三甲基戊二酸单 酰辅酶A(H M G - C o A) 还原酶是肝脏生物合成胆固醇 过程中的主要限速酶 8 , 对该酶活性抑制的体外检测 已成为筛选具有降血脂功能活性物质的重要途径。 本文研究了胰蛋白酶、中性蛋白酶A .S 1 3 9 8联合水 解乳清蛋白的优化条件,并初步探讨了在优化的联 合水解条件下乳清蛋白不同水解阶段产物在体外对 H M G - C o A还原酶活性的影响, 为乳清蛋白源降胆固 醇活性肽的制备提供了初步的实验支持。 1材料与方法 1 . 1材料与设备 3 5 %脱盐乳清粉丹麦产; 胰蛋白酶3 0 0 0 0 U / g, 厦 门 星 隆 达 试 剂 公 司 ;A .S 1 3 9 8中 性 蛋 白 酶 1 0 0 0 0 0 U/ g, 无锡博立酶制剂公司; 鲜猪肝 合肥肉联 厂供; (D L)3 - h y d r o x y l - 3 - m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m eA、 还原型辅酶(N A D P H) 、 二硫苏糖醇(D T T) 均购 自S i g m a公司; 其他试剂均为市售分析纯。 B e c k m a nL 8 - 8 0 M- T X L超高速冷冻离心机, T U - 1 9 0 1双光束紫外可见光分光光度计,B S - 2 1 0 S 电子天平,p H S - 3 B精密p H计,7 8 H W- 1磁力搅拌 仪,L N K - 8 7 1凯氏定氮仪等。 1 . 2实验方法 1 .2 .1水解实验流程按实验要求配制所需乳清蛋白溶 液调溶液p H预温加酶水解9 5 水浴灭酶定容 测定 1 .2 .2水解度测定甲醛滴定法 9 。 1 .2 .3复合酶水解乳清蛋白根据单因素实验结 果, 分别确定加酶总活性、 乳清蛋白浓度、 水解时间 为3 0 0 0(U/ g) ,4 %,6 h。 在此前提下, 采用中心组合实 验设计 1 0 , 以乳清蛋白水解度(D H) 为考察指标, 选定 水解反应温度T() , 初始p H, E t/ Et + a (%) ( 胰蛋白 酶活性/胰蛋白酶活性+中性蛋白酶A .S 1 3 9 8活性) 7 2 2 0 0 7年第0 1期 V o l . 2 8 , N o . 0 1 , 2 0 0 7 研究与探讨 食品工业科技 三因素为独立变量x 1、x2、x3, 各实验因素变量的实际值 及其对应的编码值参见表1。选用二次方程模型: y = 0+ 1x 1+ 2x2- 3x3+ 1 2x1x2- 1 3x1x3+ 2 3x2x3- 1 1x 2 1- 2 2x 2 2- 3 3x 2 3 1 .2 .4猪肝脏中H M G - C o A还原酶的提取参照文 献 1 1 方法。 1 .2 .5 H M G - C o A还原酶活性的测定 1 2 采用分光 光度法进行H M G - C o A还原酶活性的测定。取还原 酶液(5 0 m g / m L)1 0 0 L置于试管中, 依次加入磷酸盐 缓冲液(p H 6 . 8)6 0 0 L,0 . 1 %N A D P H 1 0 0 L,0 . 1 % H M G - C o A1 0 0 L, 不同水解阶段产物( 经1 0 0 0 0 r / m in, 3 0 m i n离心处理)1 0 0 L, 对照管加等体积生理盐水, 混匀后于3 4 0 n m处测定6 m i n内(3 7 ) 吸光度(A) 的 变化值,计算水解产物对H M G - C o A还原酶的抑制 率: 抑制率=(A对照- A加样)/ A对照1 0 0 %。 2结果与分析 2 . 1复合酶解联合水解实验安排及实验结果 见表2。 2 . 2回归模型的建立和显著性检验 以各因素变量编码值所对应的实际值代入表2 数据并用S A S软件处理后,以水解度为指标建立回 归模型:y 1= - 1 8 2 . 3 9 7 4 + 2 .3 8 5 6 x 1+ 4 5 . 5 1 3 4 x 2- 1 . 5 7 0 7 x 3+ 0 .0 2 6 8 x 1x2- 0 . 0 0 0 2 x 1x3+ 0 . 2 2 6 7 x 2x3- 0 . 0 2 5 4 x 1 2 - 3 .6 2 2 2 x 2 2 - 0 .0 0 2 x 3 2 。 回归模型方程中:F失拟 F0 .0 1(1 0,9), R 2 = 0 .9 1 3 8,说明失拟平方和是由实验误差等偶然因 素引起的,T、 初始p H、 E t/ Et + a 是影响胰蛋白酶-中性 蛋白酶A .S 1 3 9 8联合水解乳清蛋白的主因素,基本 无失拟因素存在, 方程回归显著。指标值D H(%) 的 变化有9 1 .3 8 %是由此三因素所决定,因此用所得回 归模型来模拟三因素与指标值的关系是可信的。 2 . 3复合蛋白酶水解乳清蛋白条件的优化 为确定胰蛋白酶-中性蛋白酶A .S 1 3 9 8复合酶 联合水解乳清蛋白的最佳条件参数,对所得非线性 回归模型方程各因素参数求一阶偏导,并令其等于 零, 求导方程整理得: Z x 1:2 . 3 8 5 6 + 0 .0 2 6 8 x 2- 0 . 0 0 0 2 x 3- 0 . 0 5 0 8 x 1= 0 (1) Z x 2:4 5 . 5 1 3 4 + 0 .0 2 6 8 x 1+ 0 . 2 2 6 7 x 3- 7 . 2 4 4 4 x 2= 0(2) Z x 3:- 1 . 5 7 0 7 - 0 .0 0 0 2 x 1+ 0 . 2 2 6 7 x 2- 0 . 0 0 4 x 3= 0 (3) 解方程组(1) (2) (3) 得:x 1= 5 0 . 8 4,x 2= 7 . 6 7,x 3= 3 6 . 7 6。 此三个参数值即对应目标函数D H(%) 的最大响应 值, 即在酶总活性为3 0 0 0 U/ g、 乳清蛋白浓度为4 %, 水解时 间6 h的 条 件 下 , 胰 蛋 白 酶-中 性 蛋 白 酶 A .S 1 3 9 8联合水解乳清蛋白的最佳控制参数为: 反应 温度5 0 .8 4 , 初始p H 7 .6 7, E t/ Et+ a 3 6 . 7 6 %。 2 . 4不同水解阶段产物对H MG- C o A还原酶活性 的影响 在优化的控制参数条件下, 胰蛋白酶-中性蛋白 酶A .S 1 3 9 8连续水解乳清蛋白7 h,不同水解时段水 解度及水解产物对H M G - C o A还原酶活性的影响参 见图1。 由图1知, 在水解初始阶段, 乳清蛋白水解产物 对H M G - C o A还原酶的抑制率随着水解度的增大逐 渐增大。 在水解进行到4 h时其水解产物对H M G - C o A 还原酶的抑制能力达到最大, 其抑制率为1 0 .1 2 %, 此 时乳清蛋白水解度为1 7 .3 1 %。 此后水解度持续增大, 至水解7 h时, 乳清蛋白水解度升至2 5 .6 5 %, 但水解 因素温度T ( )初始p H E t/ Et + a ( %) 上星号臂( + = 1 . 6 8 2 )6 09 . 08 0 上水平( + 1 )5 68 . 66 8 下水平( - 1 )4 47 . 43 2 下星号臂( - = - 1 . 6 8 2 )4 07 . 02 0 表1实验因素变量的实际值及其对应的编码值 实验号 11112 4 . 4 8 211- 11 8 . 4 1 41- 1- 12 2 . 3 4 5- 1112 3 . 7 6 6- 11- 11 7 . 7 8 8- 1- 1- 12 1 . 9 3 91 . 6 8 2002 0 . 4 7 1 0- 1 . 6 8 2001 9 . 2 6 1 20- 1 . 6 8 201 9 . 2 5 1 3001 . 6 8 22 1 . 9 4 1 400- 1 . 6 8 21 9 . 3 1 1 60002 2 . 3 4 1 70002 3 . 7 2 1 80002 3 . 6 3 2 00002 3 . 8 5 表2中心组合设计实验安排及结果 图1不同水解阶段水解物对H M G - C o A还原酶活性的影响 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 5 0 乳清蛋白水解度 H M G - C o A还原 酶抑制率 水解度、 抑制率(%) 水解时间(h) 01234567 7 3 S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yo fF o o dI n d u s t r y 研究与探讨 2 0 0 7年第0 1期 食品工业科技 -蛇麻烯为5 .8 3 %, 乙酸肉桂酯为3 .5 9 %。 3结论 利用超临界C O 2萃取技术,从肉桂中提取精油 的最佳工艺条件为: 萃取压力1 5 M P a、 温度3 5 、 时 间2 .0 h, 出油率达3 .6 9 %。与传统的水蒸汽蒸馏法相 比, 产率大大提高, 萃取时间明显缩短, 产品品质也 有很大改善, 能有效保留肉桂中的天然香味和色泽。 超临界C O 2萃取的肉桂精油经G C / M S分析, 鉴定出 4 3种成分, 占挥发性总成分的9 9 %, 其中反式肉桂醛 的含量最高, 达3 0 .9 7 %。 参考文献: 1 陈旭,雍克岚.肉桂研究进展 J .食品研究与开发, 2 0 0 3 , 2 4 ( 5 ) : 2 1 2 3 . 2 吴周和,吴传茂,徐燕.肉桂中天然防腐物质的提取及抑菌 作用 J .食品工业, 2 0 0 3 ( 5 ) : 2 8 2 9 . 3 刘永华,陈里林,周超光.我国肉桂进出口贸易现状分析 J . 广西热带农业, 2 0 0 2 ( 4 ) : 4 3 4 4 . 4 高余朵,李保国.柑橘精油的超临界C O2萃取实验研究 J . 上海理工大学学报, 2 0 0 5 , 2 7 ( 3 ) : 2 0 7 2 1 0 . 5 宋应华,郁威,王远明.超临界C O2萃取川芎挥发油过程研 究 J .中成药, 2 0 0 5 , 2 7 ( 9 ) : 1 0 0 7 1 0 1 1 . 产物对H M G - C o A还原酶的抑制率则降至1 .7 7 %。 这 表明, 在水解开始阶段, 乳清蛋白在胰蛋白酶和中性 蛋白酶A .S 1 3 9 8联合水解下,不断产生大量末端为 L y s、A r g或具有较强疏水性氨基酸残基的肽段( 这由 胰蛋白酶及中性蛋白酶A .S 1 3 9 8的特异性切割位点 所决定) , 可能在这些肽段中有某一种或几种有着较 为独特的氨基酸组成及空间构象,具有影响H M G - C o A还原酶活性基团的能力,从而表现出对H M G - C o A还原酶活性的抑制。随着水解程度的加深, 这种 活性肽段亦被不断裂解, 进而失去这一生理活性, 表 现为随水解度的持续增大其水解产物对H M G - C o A 还原酶活性抑制能力不断降低。由此可见,在实验 设定胰蛋白酶和中性蛋白酶A .S 1 3 9 8联合水解条件 下,制备乳清蛋白源具有H M G - C o A还原酶抑制能 力的活性肽最佳水解控制时间在4 h左右。 3结论 3 . 1通过中心组合实验建立三个参试因素( 温度T 、 初始p H、 E t/ Et+ a %) 与乳清蛋白水解度之间的回归模 型 :y 1= - 1 8 2 . 3 9 7 4+ 2 .3 8 5 6 x 1+ 4 5 . 5 1 3 4 x 2- 1 . 5 7 0 7 x 3+ 0 .0 2 6 8 x 1x2 - 0 .0 0 0 2 x 1x3 + 0 .2 2 6 7 x 2x3 - 0 .0 2 5 4 x 1 2 - 3 .6 2 2 2 x 2 2 - 0 .0 0 2 x 3 2 。通过模型优化了胰蛋白酶-中性 蛋白酶A .S 1 3 9 8复合酶水解乳清蛋白的条件:反应 温度5 0 .8 4 , 初始p H 7 .6 7, E t/ Et+ a 3 6 . 7 6 %。 3 . 2在实验设定条件下,制备乳清蛋白源 具 有 H M G - C o A还原酶抑制能力的活性肽最佳水解时间 为4 h,此时水解产物对H M G - C o A还原酶的抑制率 为1 0 .1 2 %。 参考文献: 1 C a e s s e n sP W,V i s s e rS .B e t a - l a c t o g l o b u l i nh y d r o l y s i s .1 . P e p t i d ec o m p o s i t i o na n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fh y d r o l y s a t e s o b t a i n e d b y t h e a c t i o n o f p l a s m i n ,t r y p s i n ,a n d S t a p h y l o c o c c u sa u r e u sV 8p r o t e a s e J . A g r i cF o o dC h e m , 1 9 9 9 , 4 7 ( 8 ) : 2 9 7 3 2 9 7 9 . 2 G u oH , K o n gB H , e t a l . H e a l t ha n dF u n c t i o nF o o d M . H a e r b i n : H e i l o n g j i a n gs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yp r e s s , 1 9 9 6 . 3 M a e sW,V a nC a m pJ ,V e r m e i r s s e nV .I n f l u e n c eo ft h e l a c t o k i n i nA l a - L e u - P r o - M e t - H i s - I l e - A r g( A L P M H I R )o nt h e r e l e a s eo fe n d o t h e l i n - 1b ye n d o t h e l i a lc e l l s J . R e g u lP e p t , 2 0 0 4 , 1 1 8 ( 1 2 ) : 1 0 5 1 0 9 . 4 A b u b a k a rA ,S a i t oT ,K i t a z a w aH ,K a w a iY . S t r u c t u r a l a n a l y s i so fn e wa n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e sd e r i v e df r o m c h e e s e w h e yp r o t e i nb yp r o t e i n a s eKd i g e s t i o n J .D a i r yS c i , 1 9 9 8 , 8 1 ( 1 2 ) : 3 1 3 1 3 1 3 8 . 5 N a g a o k aS ,F u t a m u r aY ,M i w aK ,A w a n oT ,Y a m a u c h i K . I d e n t i f i c a t i o no f n o v e l h y p o c h o l e s t e r o l e m i cp e p t i d e sd e r i v e d f r o m b o v i n em i l kb e t a - l a c t o g l o b u l i n J . B i o c h e m B i o p h y sR e s C o m m u n , 2 0 0 1 , 2 8 1 ( 1 ) : 1 1 1 7 . 6 P e l l e g r i n iA , D e t t l i n gC , T h o m a sU . I s o l a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o ff o u rb a c t e r i c i d a ld o m a i n si n t h e b o v i n e b e t a - l a c t o g l o b u l i n J .B i o c h i m B i o p h y sA c t a , 2 0 0 1 , 1 5 2 ( 2 ) : 1 3 1 1 4 0 . 7 C l a r eD A , S w a e s g o o dH E . B i o a c t i v em i l kp e p t i d e : a p r o s p e c t u s J . D a i r yS c i , 2 0 0 0 , 8 3 ( 2 1 ) : 1 1 8 7 1 1 9 5 . 8 李鹏,陈兰英.血脂康抑制猪肝H M G - C o A还