套袋对红富士苹果果实山梨醇代谢和相关酶活性的影响.pdf

中国农学通报2010,26(16):234-237 ChineseAgricultural Science Bulletin 0 引言 苹果套袋栽培可显著提高果实外观品质， 已成为 优质果品生产的主要技术手段1-2， 但套袋改变了果实 正常生长发育的微域环境条件， 从而影响果实生长发 育及品质形成3， 在一定程度上影响果实的可溶性固 形物、 有机酸、 糖含量等内在品质1-3。山梨醇作为苹 果碳同化物的主要运输形式， 在果实中被山梨醇脱氢 酶 （SDH） 和山梨醇氧化酶 （SOX） 转化成果糖和葡萄 糖4-5。目前研究表明， 苹果果实的山梨醇运转代谢与 果实发育和品质形成密切相关4-6。笔者以红富士苹 果为试材， 研究了套袋对苹果糖积累及山梨醇代谢相 关酶活性的影响， 以期明确套袋影响苹果果实品质形 基金项目： 国家自然科学基金项目 “套袋苹果糖代谢相关酶的调控机理及其与品质形成的关系”（30771486） ； 全国百篇优秀博士学位论文作者专项基 金 （200460） 。 第一作者简介： 安永梅， 女， 1982年出生， 在读硕士， 主要从事果实发育生理与分子生物学研究。通信地址： 266109 山东省青岛市城阳区长城路700 号青岛农业大学园林园艺学院， E-mail： anyongmeinihao 。 通讯作者： 王永章， 男， 1963年出生， 山东招远人， 教授， 从事果树学的教学与科研工作， 先后承担多项国家自然科学基金、 国家教育部和山东省自然 科学基金等研究课题。通信地址： 266109 山东省青岛市城阳区长城路700号青岛农业大学园林园艺学院。E-mail： wangyzh304 。 收稿日期： 2010-03-19， 修回日期： 2010-05-17。 套袋对红富士苹果果实山梨醇代谢和相关酶活性的影响 安永梅， 王永章， 李培环， 刘成连， 原永兵 （青岛农业大学园林园艺学院， 山东青岛 266109） 摘 要： 以红富士为试材， 研究套袋对苹果果实糖含量和山梨醇代谢相关酶活性的影响。结果表明： 在 整个发育过程中， 套袋苹果果实的蔗糖、 葡萄糖和果糖含量及SDH的活性变化趋势与对照基本一致。 与对照相比， 套袋后， 苹果果实的蔗糖、 葡萄糖和果糖含量均出现不同程度的降低， 而山梨醇含量有一 定的增加。套袋处理降低苹果果实的SDH活性， 但SOX活性在发育后期有一定的增加。相关分析表 明， 苹果果实的果糖积累与SDH活性密切相关。由此推断， 套袋通过降低苹果果实的山梨醇代谢而影 响苹果果实的糖积累。 关键词： 红富士苹果； 套袋； 山梨醇； 酶活性 中图分类号： S667文献标志码： A论文编号： 2010-0845 Effects of Bagging on Sorbitol Metabolism and Related Enzyme Activities in Developing Red Fuji Apple Fruit An Yongmei, Wang Yongzhang, Li Peihuan, Liu Chenglian, Yuan Yongbing (College of Gardening and Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao Shandong 266109) Abstract: The effects of bagging on sugar contents and related enzyme activities in sorbitol metabolism were studied withRed Fujiapple fruits. The results showed that the contents of sucrose, glucose，fructose and SDH activity in bagging fruits almost had the same change tendency as those of control fruits during the whole developmental period. Compared with control, the contents of sucrose, glucose and fructose in bagging fruits was much lower in some extents, however, the contents of sorbitol increased significantly. The results also indicated that fruit bagging greatly decreased SDH activity, but increased SOX activity during the late development period. The results of correlation and linear analysis also showed that the accumulation of fructose had significant correlation with SDH activity. It is concluded that fruit bagging influenced the sugar accumulation through reducing sorbitol metabolism in apple fruit. Key words: Red Fuji apple; bagging; sorbitol; enzyme activities 安永梅等： 套袋对红富士苹果果实山梨醇代谢和相关酶活性的影响 成的生理机制。 1 材料与方法 1.1 材料 试验于20082009年在山东省栖霞市官道镇优质 苹果丰产园进行。试材为 12 年生红富士 （Malus domesticaBorkh. cv. Red Fuji ） ， 株行距4 m6 m， 树 势中庸， 生长发育正常， 常规田间管理， 花后30天定果 后套双层纸袋。从花后15天开始， 每隔15天取样一 次， 直至果实成熟。每次随机取20个果实， 称其单果 重， 果肉用液氮速冻后置-80超低温冰箱中贮存备 用。 1.2 方法 1.2.1 可溶性糖的测定 山梨醇、 葡萄糖、 果糖和蔗糖的 测定采用高效液相色谱法 （HPLC） 7。Agilent 1100液 相色谱测定系统的色谱柱采用LUNA氨基柱NH2， 规 格250 mm4.6 mm。色谱条件： 柱温40， 流速2 mL/ min， RID示差检测器； 流动相为乙腈:水=83:17， 每次 进样体积为20 L， 根据样品峰面积和标准曲线计算 山梨醇、 蔗糖、 葡萄糖和果糖含量。 1.2.2 酶液的制备 称取1 g果肉放于研钵内， 加少量石 英砂和 5 mL HEPES 缓冲液。HEPES 缓冲液组成： 50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5，含 10 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L EDTA， 2.5 mmol/L DTT， 10 mmol/L 抗坏血酸和5%不溶性PVPP （聚乙烯吡咯烷酮） ， 冰浴 研磨匀浆， 12000g(4)离心20 min， 上清液用稀释10 倍的提取缓冲液 （不含PVPP） 透析20 h后用于相关酶 活性的测定。以上所有操作均在04下进行。 1.2.3 相关酶活性的测定 按Yamaki等的方法测定山 梨醇脱氢酶 （sorbitol dehydrogenase， SDH） 和山梨醇氧 化酶 （sorbitol oxidase， SOX） 的活性 4， 以mol NAD/ gFWh 表示山梨醇脱氢酶的活性， 以mol glucose/ gFW h表示山梨醇氧化酶的活性， 所有的测定均重复 3次。 2 结果与分析 2.1 套袋对红富士苹果果实可溶性糖含量的影响 不同发育时期红富士苹果果实的可溶性糖含量测 定结果表明 （图1） ： 套袋和对照苹果果实， 可溶性糖含 量随果实的发育进程而发生变化。在果实发育早期， 几乎没有蔗糖的积累， 果糖含量也较低， 而葡萄糖含量 较高。随着果实的发育， 果糖含量增加显著且一直持 续到果实成熟， 成为苹果果实的主要可溶性糖。而蔗 糖和葡萄糖含量在发育后期也有所增加， 但远低于果 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 01 0 51 2 01 3 51 5 01 6 5 花后天数/ d 果糖含量 / ( m g / g F W) 对照 纸袋 0 1 0 2 0 3 0 4 0 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 01 0 51 2 01 3 51 5 01 6 5 花后天数/ d 葡萄糖含量/ ( m g / g F W) 对照 纸袋 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 01 0 51 2 01 3 51 5 01 6 5 花后天数/ d 蔗糖含量/ ( m g / g F W) 对照 纸袋 图1 套袋对红富士苹果果实可溶性糖含量的影响 0 2 4 6 8 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 01 0 51 2 01 3 51 5 01 6 5 花后天数/ d 山梨醇含量/ ( m g / g F W) 对照 纸袋 235 中国农学通报 0 1 2 3 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 51 2 01 3 51 5 01 6 5 花后天数/ d 对照 纸袋 0 2 4 6 8 1 0 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 01 0 51 2 01 3 51 5 01 6 5 花后天数/ d 对照 纸袋 图2 套袋对红富士苹果果实SDH和SOX活性的影响 山梨醇脱氢酶活性/(mol/(gFW h) 山梨醇氧化酶活性/(mol/(gFW h) 相关系数分别为0.7880和0.8039， 均达到极显著水平， 表明苹果果实果糖的积累主要与SDH密切相关。虽 然葡萄糖和蔗糖与SDH间也存在较高的相关系数， 由 于葡萄糖和果糖与SDH所催化的反应间不存在直接 代谢关系， 因此无法判定其生理意义。从表1还可以 看出， SOX与蔗糖、 葡萄糖和果糖间的相关性较差， 表 明苹果果实中可溶性糖的积累， 尤其是葡萄糖和蔗糖 的积累可能与其他糖代谢相关酶 （蔗糖合酶、 蔗糖磷酸 合酶、 淀粉酶及转化酶） 相关。 3 讨论 苹果果实所积累糖的种类、 含量及比率是决定果 实品质及商品价值的要素之一1-4。虽然有研究表明， 转化酶 （包括可溶性酸性转化酶、 可溶性中性转化酶及 细胞壁结合酸性转化酶） 、 蔗糖合酶、 蔗糖磷酸合酶及 糖含量。在整个发育期间， 对照与套袋果实的葡萄糖、 果糖和蔗糖含量的变化趋势较为相似， 果实套袋在一 定程度上降低了果实中这些可溶性糖的含量。从图1 还可以看出， 苹果果实的山梨醇含量在整个果实发育 过程中变幅较小， 套袋果实的山梨醇含量显著高于对 照果实， 由此表明套袋处理影响从叶片转运到果实内 部山梨醇的转化。 2.2 套袋处理对红富士苹果果实SDH和SOX活性的 影响 从图2可以看出， 在发育早期， 苹果果实的SDH 活性较低。从花后45天开始， SDH活性开始迅速上 升； 到花后90天时， SDH活性达到最大值， 之后又有所 下降； 从花后135天开始， SDH活性又有所上升， 到果 实成熟时， SDH仍维持较高活性。与SDH的活性变化 相比， 在果实发育早期和发育后期， 苹果果实的SOX 活性较高， 而在发育中期， SOX活性较低。从图2还可 以看出， 苹果果实山梨醇的转化与SDH密切相关。套 袋也影响果实的SDH和SOX活性， 与对照相比， 套袋 降低果实的SDH活性。而在发育中后期， 套袋果实的 SOX活性与对照相比有一定的增加。 2.3 苹果果实可溶性糖含量与山梨醇代谢相关酶间的 相关性 通过分析红富士苹果果实发育过程中可溶性糖与 山梨醇代谢酶之间的相关性可以看出 （表1） ， 苹果果 实果糖的积累主要受到SDH的调控。在整个果实发 育过程中， 套袋与对照处理苹果果实果糖与SDH间的 处理 套袋 对照 糖种类 蔗糖 葡萄糖 果糖 山梨醇 蔗糖 葡萄糖 果糖 山梨醇 山梨醇脱氢酶(SDH) 0.5307 0.5778 0.7880* 0.6384* 0.7180* 0.7131* 0.8039* 0.2309 山梨醇氧化酶(SOX) 0.1473 0.0529 0.3082 0.3913 0.4057 0.4187 0.5072 0.5185 表1 红富士苹果果实可溶性糖与山梨醇代谢相关酶的相关性 236 安永梅等： 套袋对红富士苹果果实山梨醇代谢和相关酶活性的影响 淀粉酶组成了果实碳水化合物的代谢调节中心， 但在 苹果上， 果实糖代谢的关键调控酶， 目前并不清楚5,8。 山梨醇作为苹果叶片的主要光合产物， 苹果叶片中山 梨醇占可溶性碳水化合物的70%80%， 但在苹果果 实内山梨醇含量仅占3%8%， 表明山梨醇运转到果 实后被迅速转化为其他糖， 而不是作为糖的主要储存 形式8。从此试验结果可以看出， 在果实发育早期， 苹 果果实几乎没有蔗糖的积累， 原因在于发育早期的红 富士苹果果实酸性转化酶活性较高5。此阶段高活性 的细胞壁结合转化酶将从韧皮部卸载的蔗糖分解成葡 萄糖和果糖， 形成源库间递减的浓度梯度， 有利于蔗糖 从韧皮部的卸载， 从而保证叶片形成的光合产物源源 不断地输向果实5。随着苹果果实的发育， 尤其发育 中后期， 苹果果实的果糖积累较为显著， 并成为主要的 可溶性糖， 可能原因为发育中后期苹果果实SDH活性 的增加， 此试验相关统计分析结果为这个推论提供了 可靠的证据。 SDH作为苹果山梨醇代谢的关键酶， 目前的研究 表明SDH存在一个多基因家族， 但不同的成员表达时 空模式不同4,9， 其活性变化受到金属离子 （Hg+， Zn2+， Ag+， Ca2+， Mg2+， Ba2+） 、 可溶性糖 （葡萄糖、 山梨醇） 、 激 素 （ABA） 和介质pH等因素的调控10-12。山梨醇和葡 萄糖分子可能作为一种糖信号分子诱导NAD-SDH活 性增加， 这种诱导SDH活性的增加并不是由于渗透势 的变化引起的13， 而是SDH活性在基因表达水平上受 到调控。苹果果实发育过程中SDH的mRNA量转录 水平和酶活性变化基本一致， 都是在发育中期迅速升 高后降低， 在发育后期升高至果实成熟期达到最高10。 在苹果果实发育后期， SDH蛋白的含量迅速升高， 但 是约8周后酶的酶的活性才开始急剧增加14。这些研 究结果表明苹果中的活性可能也受到翻译后水平的调 控。这与此试验结果相一致。 套袋由于改变了果实生长发育的微域环境条件， 对果实发育和品质形成造成一定影响1-3， 从此试验结 果可以看出， 套袋苹果果实的果糖、 葡萄糖和蔗糖积累 低于对照， 可能原因在于果实套袋影响糖代谢相关酶 的基因表达和活性， 再者果实套袋后造成袋内温度升 高， 果实新陈代谢和细胞分裂消耗的物质能量增多， 叶 片运来的山梨醇和蔗糖大部分被迅速分解， 用于构建 各种细胞器、 细胞壁和细胞液成分， 所以各种糖分的积 累减少1。套袋对果实品质形成的影响是一个复杂的 生理过程， 它既影响了果实糖分的合成与输入， 又影响 了果实内各种酶的活性， 进而影响果实中糖的积累及 糖组分构成2,3。糖是作为一种信号启动相关酶表达的 基因， 还是由于糖浓度的变化促进或抑制相关酶的表 达还不清楚， 有待进一步的研究。 参考文献 1卜万锁,牛自勉,赵红钰.套袋处理对苹果芳香物质含量及果实品 质的影响J.中国农业科学,1998,31(6):88-90. 2李秀菊,刘用生,束怀瑞.红富士苹果套袋果实色泽与激素含量变 化J.园艺学报,1998,25(3):209-213. 3张建光,孙建设,刘玉芳.苹果套袋及除袋对果实微域温湿度及光 照的影响J.园艺学报,2005,32(4):673-676. 4Yamaki S, Ishikawa K. 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