提高酸乳中c9,t11-+共轭亚油酸含量的研究.pdf

2009, Vol. 30, No. 23食品科学生物工程326提高酸乳中c9,t11-共轭亚油酸含量的研究李素波1，靳小攀1，郑玉梅2，高红伟1，檀英霞1，郁成雨1，陈炳卿3，王璇琳1,*(1.军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；2.国家人口计划生育委员会科学技术研究所，中国计划生育学杂志社，北京 100081；3.哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江 哈尔滨 150086)摘 要：本研究利用乳酸菌发酵法，添加合适的底物，在形成酸乳的同时提高乳中c9,t11- 共轭亚油酸，c9,t11-CLA的含量，筛选菌株的最佳配比条件，研究影响 CLA 含量的因素，发现奶中影响酶促反应和菌株生长的营养成分均可以影响乳酸菌发酵中 CLA 的产生。应用气相色谱检测出乳酸菌培养液中 CLA 的其它异构体。关键词：c9,t11- 共轭亚油酸；乳酸菌发酵法Production of c9, t11-Conjugated Linoleic Acid in YogurtLI Su-bo1，JIN Xiao-pan1，ZHENG Yu-mei2，GAO Hong-wei1，CHAN Ying-xia1，YU Cheng-yu1，CHEN Bing-qing3，WANG Xuan-lin1,*(1. Beijing Institute of Transfusion Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China；2. National Research Institute for Family Planning, Chinese Journal of Family Planning, Beijing 100081, China；3. College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)Abstract：The research wsa aimed to increase the yield of conjugated-linoleic acid (CLA) in yogurt. The fermentationconditions for production of CLA were optimized and the factors including substrates and the mixing proportion of theLactobacillus straims were investigated. The results showed that the nutriton composition significantly affected the enzume-catalyzed reaction and the lactobacillus growth as well as the CLA yield. Additionally, other CLA isomers besides c9, t11-CLA were identified by improved GC in the culture medium. The method provided novel insights in developing the milkproducts abundant in CLA.Key words：c9, t11-conjugated linoleic acid (CLA)；fermentation of Lactobacillus中图分类号： TS252.54 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)23-0326-05收稿日期：2008-12-25作者简介：李素波(1975 )，女，实验师，本科，主要从事微生物学和抗体技术研究。E-mail：lisubo* 通讯作者：王璇琳(1973 )，女，助理研究员，博士，主要从事基因重组技术在医药、食品领域的应用研究。 E-mail：wxl-恶性肿瘤是威胁人类生命和健康的最主要疾病之一。据流行病学、病因学和实验研究表明，80% 的肿瘤是由不良生活方式和环境因素所致，其中 35%40%的肿瘤发病与不科学、不合理的膳食有关。如果膳食措施适当，有 1/3 癌症的发生是可以通过膳食措施来避免的1。美国国家科学院曾于 1996 年在人类饮食中的致癌物与抗癌物报告一文中指出：共轭亚油酸(CLA)是唯一的一种能抑制多种实验动物肿瘤发生的脂肪酸2。在芬兰对 4600 名女性 25 年的调查中发现，牛乳的摄入与乳腺癌的发生之间成负相关。研究者认为牛乳脂肪中 CLA 可能就是该保护因子。早期在法国进行的实验组 - 对照组实验发现，在乳腺脂肪组织中 CLA 含量高的女性中，其乳腺癌的发病率就明显下降3。近期研究结果表明，乳中c9,t11-CLA异构体具有降低血脂的作用4。本研究目的在于提高乳及乳制品中 CLA 含量。因此，实验筛选发酵牛乳常用菌株，进行了乳酸菌对底物的耐受能力和转化能力的研究，确定添加底物的最佳剂量，研究了菌株产生 CLA 的影响因素，确定添加底物的最佳时间，培养基对菌株产生 CLA 的影响，添加营养物质对 CLA 含量的影响，探讨乳酸菌发酵法过程中CLA 含量的影响因素。1材料与方法1.1材料与试剂乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis 1.18)、乳脂链球菌(Streptococus cremoris or la-Jensen1.9) 中科院微生物327生物工程食品科学2009, Vol. 30, No. 23所；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis1.69) 兰州工业试验所；保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 东北农业大学生命科学与食品工程学院。c9,t11-CLA(纯度为 98%，0.9g/ml)、亚油酸(纯度为99%，0.9g/ml)、内标物(十七烷酸甲酯，纯度为 99%)Sigma 公司。1.2仪器与设备GC-17A气相色谱仪 日本岛津公司；AllegraTM64R型低温高速离心机、722 型光栅分光光度计 山东高密分析仪器厂；Beckman DU640 紫外分光光度计 美国Bechman 公司。1.3方法1.3.1紫外分光光度法检测 c9,t11-CLA共轭亚油酸具有共轭二烯结构，在 234nm 波长处有特征吸收峰，本实验采用紫外分光光度法建立了纯度为98% 的 c9,t11-CLA 的线性回归方程，并应用此方程进行培养基中 c9,t11-CLA 的检测与定量。1.3.2乳酸菌产生 CLA 的气相色谱定性分析5 株乳酸菌分别用含不同浓度底物的 MRS 培养基培养。培养液和菌体分别进行脂肪提取、脂肪酸甲酯化、上机进行气相色谱检测，并将图谱与 c9,t11-CLA 标准品气相色谱图对照，研究 5 株乳酸菌将 LA 转化为 CLA 异构体的情况。1.3.3不同时间添加底物对产生 CLA 含量的影响取对数生长期(OD234nm=0.3)的各个菌株，接种于 5ml脱脂牛乳中，每个菌株设以下几组：培养开始时加入底物组、培养结束前 10、30、60min 加入底物组，每组3 个平行样，正己烷萃取，于 234nm 波长处 UV 检测CLA，计算 CLA 的含量。1.3.4不同的底物浓度对5株乳酸菌产生CLA含量的影响取对数生长期的各个菌株，接种于 5ml 脱脂牛乳中，每株乳酸菌分别设以下几个添加底物剂量组：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml。每个剂量组分别做 3 个平行样，培养结束前 10min 添加底物，培养结束后用正己烷萃取，于 234nm 波长处 UV 检测 CLA，计算 CLA 的含量。1.3.5不同培养基对 5 株乳酸菌产生 CLA 含量的影响取对数生长期的各菌株，分别接种于 5ml MRS 培养基和 5ml 脱脂牛乳中，接种量为 10%，每组 3 个平行样。培养开始时加入底物，1 h 后用正己烷萃取，于234nm 波长处 UV 检测 CLA，计算 CLA 的含量。1.3.6添加不同的糖对 CLA 含量的影响取对数生长期的 5 株乳酸菌，每株菌分别接种于含蔗糖、乳糖、葡萄糖的 5ml 全乳中，接种量为 10%，添加糖量为 5%，每组 3 个平行样。于凝乳前 10min 加入底物，添加底物剂量除 Streptococcus thermophilus0.5mg/ml 外，其余 4 株乳酸菌均为 2mg/ml。培养结束后，用正己烷萃取，于 234nm 波长处 UV 检测 CLA，计算 CLA 的含量。1.3.7添加脱脂乳粉对 CLA 含量的影响取对数生长期的各菌株，分别接种于添加脱脂乳粉量为 3% 的 5ml 全乳中，接种量为 10%，每组 3 个平行样。于凝乳前 10min 加入底物，添加底物剂量除 Strep-tococcus thermophilus 0.5mg/ml 外，其余 4 株乳酸菌均为2mg/ml。培养结束后，于234nm波长处UV检测CLA，计算 CLA 的含量。1.3.8添加糖和脱脂乳粉对 CLA 含量的影响取对数生长期的各菌株，分别接种于添加脱脂乳粉量为 3% 的 5ml 全乳中，接种量为 10%， Streptococcusthermophilus 不加糖、Streptococus cremoris or la-Jensen1.9 添加蔗糖、Lactococcus lactis1.18 添加乳糖、Lactococcus lactis 1.69 添加葡萄糖、Lactobacillusbulgaricus 添加蔗糖，糖的添加量均为 5%，每组 3 个平行样。在各菌株最适生长温度下培养，培养结束前10min 加入底物，添加底物剂量除 Streptococcusthermophilus 0.5mg/ml 外，其余 4 株乳酸菌均为 2mg/ml。培养结束后，用正己烷萃取，于 234nm 波长处 UV 检测CLA，计算 CLA 的含量。1.3.9结果统计分析运用 SAS6.12 软件包分析数据。计量资料的数据以平均值标准差(x s)表示，组间差异采用方差分析进行处理，P 0.05 表示差异具有统计学意义。2结果与分析2.1CLA 紫外吸收标准曲线图1 共轭亚油酸紫外吸收标准曲线Fig.1 Standard curve of CLA4.03.53.02.52.01.51.00.50A260nmCLA质量浓度( g/ml)05101520以吸光度为纵坐标，CLA 浓度为横坐标，进行回归分析的结果如下：线性回归方程：A=0.193687C 0.01452，R2=0.998538；线性范围：020.000g/ml(图 1)。 2009, Vol. 30, No. 23食品科学生物工程3282.2CLA 气相色谱检测IS.十七烷酸甲酯；LA.CLA 甲酯。图 8 LA 标准品气相色谱图Fig.8 Gas chromatogram of LA standard100500mV时间(min)010203040ISLA100500mV时间(min)010203040ISc, 9t11-CLAIS.十七烷酸甲酯；c9,t11-CLA.c9,t11-CLA 甲酯。图 7 c9,t11-CLA 标准品气相色谱图Fig.7 GC chromatogram of c9,t11-CLA standard选择的 5 株乳酸菌均能产生 CLA，由图 26 可知，在 40min 和 41min 处各出现了一个峰，其中 40min 是 c9,t11-CLA 峰，按照 CLA 异构体出峰规律，41min 是 CLA的其他异构体；图 3 为 Lactobacillus bulgaricus 的气相色谱图，除了在 40min 和 41min 处出现峰外，还在 43min处出现了一个峰，说明该乳酸菌菌种能将 LA 转化为三种 CLA 异构体。图 7 为 c9,t11-CLA 标准品图谱，图 8为 LA 的标准品图谱。2.3不同时间添加底物对产生 CLA 含量的影响由表 1 可知，在培养结束前 10min 加入底物，产生的 CLA 均明显高于培养开始时加入底物组，在培养结束前 10min 加入底物各菌株产生的 CLA 量与培养结束前30、60min 加入底物组相比，经统计学分析，均具有极显著差异(P 0.01)。2.4不同的底物浓度对5株乳酸菌产生CLA含量的影响图 2 Streptococcus thermophilus 培养基中脂肪酸气相色谱图Fig.2 GC chromatogram of fatty acid composition of culturemedium for Streptococcus thermophilus18.73326.65931.06239.13040.843时间(min)41.751图 3 Lactobacillus bulgaricus 培养基中脂肪酸气相色谱图Fig.3 GC chromatogram of fatty acid composition of culturemedium for Lactobacillus bulgaricus12.385时间(min)12.52516.04217.80519.50720.27221.31622.85026.32527.71731.13039.20841.78543.067图 4 Streptococus cremoris or la-Jensen1.9 培养基中脂肪酸气相色谱图Fig.4 GC chromatogram of fatty acid composition of culturemedium for Streptococus cremoris or la-Jensen1.9时间(min)13.35115.75817.14919.45520.75723.81726.65431.08139.18240.79341.674图 5 Lactococcus lactis 1.18 培养基中脂肪酸气相色谱图Fig.5 GC chromatogram of fatty acid composition of culturemedium for Lactococcus lactis 1.18时间(min)40.74331.00727.61426.61224.17120.70918.73215.73712.73341.634图 6 Lactococcus lactis 1.69 培养基中脂肪酸气相色谱图Fig.6 GC chromatogram of fatty acid composition of culturemedium for Lactococcus lactis 1.69时间(min)40.79339.12831.08126.65423.81724.15420.75719.45517.14915.7582.52.01.51.00.50CLA含量( g/ml)底物浓度(mg/ml)0.51.01.52.02.53.0StreptococcusthermophilusStreptococcus crem-oris Orla-Jensen1.9LactococcusLactis1.18Lactococcuslactis1.69Lactobacillus bulgaricus图9 底物浓度对共轭亚油酸的影响Fig.9 Effect of substrate concentration on CLA41.674329生物工程食品科学2009, Vol. 30, No. 23为了确定培养结束前10 min添加底物的最佳浓度，进行了底物添加剂量的筛选，发现除 S t r e p t o c o c c u sthemophilus最佳底物浓度为0.5mg/ml，其他 4 株菌中最佳底物添加浓度均为2mg/ml。并且当底物浓度高于2mg/ml，CLA 的产量均下降，说明底物添加到达一定剂量时，酶促反应有利于向还原反应进行；同时，实验结果表明：菌株将底物转化为 CLA 的有效剂量范围是比较窄的(图 9)。2.5不同培养基对 5 株乳酸菌产生 CLA 含量的影响lus bulgaricus 产生 CLA 较为有利；乳糖有利于Lactococcus lactis1.18 产生更多的 CLA；葡萄糖使Lactococcus lactis 1.69 产生 CLA 最多。同时发现，对菌株 Streptococcus thermophilus 来说，添加糖反而使CLA 下降，说明添加糖并不都有利于 CLA 的产生。2.7添加脱脂乳粉对 CLA 含量的影响注：*.与 MRS 培养基比较，差异极显著，P 0.01。菌株底物浓度 CLA(g/ml)(mg/ml)MRS培养基脱脂牛奶Streptococcus thermophilus0.50.93540.10001.59990.1825*Streptococus cremoris or la-Jensen9370.07681.56400.0422*Lactococcus lactis1.181.01.14070.16721.62670.4845*Lactococcus lactis 1.691.01.52370.15771.70000.0068*Lactobacillus bulgaricus1.00.88290.06541.42800.1058*表 2 培养基对共轭亚油酸的影响(x s，n=3)Table 2 Effect of mediums on CLA (x s，n=3)菌株 CLA( g/ml)无糖乳蔗糖乳糖葡萄糖Streptococcus thermophilus1.5999 0.18251.4765 0.03321.4547 0.01461.4296 0.0169Streptococus cremoris or la-Jensen1.91.5640 0.0422 1.6995 0.0090*1.6121 0.00501.6388 0.0116Lactococcus lactis1.181.6267 0.4845 2.0655 0.01032.6849 0.0105*1.6783 0.0109Lactococcus lactis 1.691.7000 0.0068 1.7965 0.01241.8076 0.01281.8567 0.0076*Lactobacillus bulgaricus1.4280 0.1058 1.6160 0.0098*1.5206 0.00821.4902 0.0026表 3 不同糖对共轭亚油酸的影响(x s，n=3)Table 3 Effect of various sugar on CLA (x s，n=3)注：*.与无糖组比较，差异显著，P 0.05；*.与无糖组比较，差异极显著，P 0.01。由表 2 可知，各菌株在脱脂乳中产生的 CLA 的量均高于 MRS 培养基，经统计学分析，有极显著性差异(P 0.01)，说明对于产生 CLA 的乳酸菌来说，脱脂乳是一种比 MRS 培养基好的生长基。2.6添加不同的糖对 CLA 含量的影响由表 3 可知，各菌株对糖的需要并不完全相同，蔗糖对 Streptococus cremoris or la-Jensen1.9 和 Lactobacil-由表 4 可知，添加脱脂乳粉能提高各菌株在乳中产生的 CLA 量。2.8添加糖和脱脂乳粉对 CLA 含量的影响CLA( g/ml)菌株底物浓度(mg/ml)培养开始时添加底物培养结束前添加底物10min30min60minStreptococcus thermophilus0.51.5099 0.18251.9464 0.0224*1.5845 0.01741.5150 0.0195Streptococus cremoris or la-Jensen640 0.04222.1530 0.0210*1.8980 0.01601.6280 0.0077Lactococcus lactis1.181.01.6267 0.48453.3547 0.1000*2.7396 0.003552.5170 0.0230Lactococcus lactis 1.691.01.7000 0.00682.5690 0.0190*2.0005 0.01401.9570 0.0200Lactobacillus bulgaricus1.01.4280 0.10583.2140 0.0156*1.7150 0.01301.3300 0.0155注：*.培养结束前 10min 加入底物各菌株产生的 CLA 量与培养结束前 30、60min 加入底物组比较，差异极显著，P 0.01。表 1 不同时间添加底物对产生 CLA 含量的影响 (x s，n=3)Table 1 Effect of substrate with various adding time on CLA (x s，n=3)菌株 CLA(g/ml)全乳添加脱脂乳粉的全乳Streptococcus thermophilus1.95500.14092.68000.0161*Streptococus cremoris or la-Jensen1.91.20210.01641.34950.1685*Lactococcus lactis1.182.89200.02012.92320.0279*Lactococcus lactis 1.691.08030.00862.00580.0435*Lactobacillus bulgaricus1.94520.01312.35720.1174*表 4 脱脂乳粉对共轭亚油酸的影响(x s，n=3)Table 4 Effect of skim milk powder on CLA (x s，n=3)注：*.与全乳组比较，差异极显著，P 0.01。表 5 同。菌株 CLA(g/ml)全乳添加脱脂乳粉和糖的全乳Stre ptococcus th ermophilus1.95500.14092.68000.0161*Strept ococus cremoris or la-Jens en1.91.20210.01641.42990.0288*Lact ococcus lac tis1.182.89200.02013.34600.0259*Lac tococ cus lact is 1.691.08030.00862.08820.0268*La ctobac illus bulg aric us1.94520.01312.87040.1211*表 5 添加糖和脱脂乳粉对共轭亚油酸的影响(x s，n=3)Table 5 Effects of sugar and skim milk powder on CLA (x s，n=3) 2009, Vol. 30, No. 23食品科学生物工程330由表 5 可知，选择了对各菌株有利于产生 CLA 的最佳条件，进行在全乳中 CLA 的产生最佳条件研究。按照不同菌株对影响 CLA 产生各因素的敏感程度的不同，筛选了实验条件下各菌株的最适条件，添加脱脂乳粉对Streptococcus thermophilus 产生 CLA 影响最大，对于其他 4 个菌株来说，在乳中同时添加不同的糖和添加脱脂乳粉 CLA 含量均有不同程度的提高。3讨 论 研究表明5-9，乳酸发酵牛乳时能够产生 CLA，嗜酸乳酸菌能比较有效地使亚油酸或甘油亚油酸酯变成共轭亚油酸，乳酸菌7微生物中含有亚油酸异构酶，其作用位点是在脂肪酸 C12双键，能把亚油酸特异性转化为c9,t11-CLA。Lin 等6将嗜酸乳杆菌、德尔布吕克乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种、德尔布吕克乳杆菌乳菌亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种和唾液链球菌嗜热亚种等 6 种乳微生物与亚油酸共培养 048h，结果发现，这 6 个乳酸菌均具有将亚油酸转化为共轭亚油酸的 能 力 。3.1乳酸菌对底物的耐受能力及对底物的转化能力实验添加的底物是一种脂肪酸酯，它的添加对菌株的生长无疑是一种刺激，菌株的生长期不同，菌株对底物的耐受力也不同，因此，对数生长期和稳定期的底物添加有效剂量有所不同。结果表明：处于对数生长期的菌株对底物较为敏感，当底物浓度超过 1.0mg/ml 时，菌株的生长呈现抑制状态，当底物浓度达到1.5mg/ml 时，菌液的 OD 值与对照组相比，几乎下降了一半；菌株处于生长稳定期时，菌株对底物的耐受能力较强，当底物的浓度达到 2.0mg/ml 时，菌株的生长虽然也受到影响，但是影响并不明显，说明菌株对底物的耐受能力是受其生长状态影响的。5 个菌株均具有将底物转化为CLA 的能力，为确定各菌株底物的最适添加剂量，研究了它们对数生长期和稳定期对底物的转化能力。实验结果表明：菌株在对数生长期 3h 产生的 CLA 量高于 1h和 2h，说明菌株在生长初期对底物的刺激较为敏感，随着各菌株的不断繁殖，菌数呈对数指数增加，异构酶活力随之增强，活跃生长的细胞与脂肪底物接触时间越长，累积的 CLA 含量越大，CLA 含量 3h 高于 1h 和 2h。乳酸菌处于生长稳定期时，当底物浓度为 2.0mg/ml 时，1h 产生 CLA 的量高于 2h 和 3h，说明生物氢化是一耗能过程，此过程在衰老细胞中可能不活跃，因此稳定期与脂肪底物接触时间越短，积累的 CLA 越多。综上所述，乳酸菌对过量脂肪酸的转化可能是一种自身解毒过程，菌株的 L A 异构酶可能是一种“自杀酶” ，这也是不能无限制的增加底物的原因之一。同时，生物氢化过程是一种可逆的动态平衡反应，因此确定菌株达到有效异构化能力的最佳底物浓度和最短培养时间是至关重 要 的 。3.2乳酸菌产生 CLA 的气相色谱定性分析对 5 个乳酸菌菌株的菌体脂肪酸和培养液进行气相色谱检测时发现，CLA 色谱峰出现在乳酸菌外液即培养液中，在菌体的脂肪酸组成气相色谱上未见到 CLA 的气谱峰，说明异构酶可将 LA 转化为 CLA 后释放到乳酸菌外液中，同时，检测中发现在培养液中除了 c9,t11-CLA峰外，还出现了 CLA 的其他异构体的色谱峰。因此，乳酸菌不仅在能将 LA 异构为 c9,t11-CLA 的异构酶，还存在其他 LA 异构酶，说明在本研究基础上可以改变适当的菌株培养条件，开发出更多种类的富含 CLA 的酸奶及发酵制品。3.3添加糖和脱脂奶粉对菌株产生 CLA 的影响依据乳酸菌 5 个菌株对影响产生 CLA 各因素的敏感程度不同，筛选了实验条件下各菌株产生 CLA 的最适条件，测定了 CLA 的含量。结果发现，添加脱脂奶粉对嗜热链球菌产生 CLA 的影响最大，能够促进 CLA的产生，添加糖反而不利于嗜热链球菌产生 CLA；对于其他 4 株菌来说，在奶中添加适合的糖和脱脂奶粉，CLA 含量均有不同程度的提高。推测对于能产生 CLA的 5 个乳酸菌来说，不同亚种产生的异构酶在结构上并不完全相同，因此对于影响 CLA 的各个因素的敏感程度有所不同。参考文献：1World C