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生物样品中生物素的酶联免疫吸附 分析两种包被方法的比较研究 杨 红 (四川大学华西药学院,成都610041) 摘 要 通过对用猪肺炎霉浆菌包被或用其兔抗体包被两种方法的比较研究,得到一种高灵敏度和高准确 度对生物样品中生物素含量直接定量的酶联免疫吸附分析(ELISA)法。猪肺炎霉浆菌包被法的检测限仅约为 同类文献值的1150 ,加标平均回收率为101.13 % ,均优于猪肺炎霉浆菌抗血清(抗体)包被法结果。表明猪肺 炎霉浆菌比其抗体对酶标板有更强的物理吸附力。方法亦可用于其它待测定物的ELISA法。 关键词 生物素,酶联免疫吸附分析,包被,发酵液,猪肺炎霉浆菌 2001212224收稿;2002206211接受 1 引 言 生物素又称维生素H ,分子量为244 ,水溶性好 1 。它是动、 植物生长发育过程中作为羧化酶的辅 酶 1 ,参与蛋白质、 脂肪和糖类代谢的重要物质。目前,关于生物素的含量测定方法报道不少 24 。 ELISA则因其测定原理基于抗原2抗体反应而具有高灵敏度和高选择性,且快速简便 5 ,6 ,用于生物素含 量测定的也有报道 7 ,但测定生物样品的灵敏度差,最低测定浓度为0. 5molL (12. 2gL) ,回收率为 93.67 %。本文以灵敏度为指标,考察了各步实验条件对实验结果的影响,优选出实验条件,并在固定相 的制备中,对生物素酶联免疫吸附分析中以下两种包被方法进行了比较研究:A法以猪肺炎霉浆菌2兔 抗猪肺炎霉浆菌血清2生物素化羊抗兔IgG结合于孔壁表面形成固定相;B法用兔抗猪肺炎霉浆菌血清2 生物素化羊抗兔IgG结合于孔壁表面形成固定相。再用该固定相以竞争抑制法测定生物素,即用固定 相上的生物素和溶液中的生物素(样品或标准液)竞争溶液中有限量的HRP标记的链霉亲和素。对照 两种包被法发现,采用猪肺炎霉浆菌包被优于其抗体包被结果,也优于同类文献值。用A法制成的固 定相用于测定生物样品中的生物素,结果满意。本法也可用于其它测定对象。现报道如下。 2 实验部分 2.1 试剂与仪器 2.1.1 试剂 猪肺炎霉浆菌(mycoplasm hyopneumoniae)由台湾中山大学宣大卫教授实验室提供;自制兔 抗猪肺炎霉浆菌血清;生物素标准品和乙基汞硫代水杨酸钠为Sigma产品;生物素标记的羊抗兔IgG、 HRP标记的链霉亲和素和显色剂ABTS为美国Zymed Laboratery产品;其它化学试剂为德国Serva产品。 2.1.2 溶液 稀释液同洗涤液:pH 7. 4磷酸盐缓冲溶液(PBS ,由8 g NaCl、1115 g Na2HPO4, 0. 2 g KH2PO4, 0.2 g KCl加水至1000 mL) ;封闭液即0.5 %酪氨酸溶液(由5 g酪氨酸, 0.1 g乙基汞硫代水杨 酸钠加1000 mL pH 7.4 PBS制成,无菌) ;HRP标记的链霉亲和素溶液 (2 L HRP标记物、10L Tween 20 及40 mL水)显色剂即ABTS溶液 (140 L ABTS、860L pH 5.5 , 0.1 molL枸橼酸盐缓冲液、12L 30 % H2O2及13 mL水 ) ; 空白培养液,YPD2CYH(10 g酵母菌提取物,20 g蛋白胨,20 g葡萄糖、20 g琼脂及40 g放线菌酮,于1000 mL水中,无菌)。 2.1.3 仪器 酶标测定仪(芬兰,Labsystem) ,孵箱(台湾,HOTECH 720) ;离心机(日本,K UBOTA 1300 ;台 湾,Eppendorf 5415) ,孔酶标板(丹麦,Nunc 96)。 2.2 实验方法 2.2.1 标准溶液的制备 将生物素标准品用稀释液配制成1 mgL的贮备液。将贮备液用稀释液分别 第30卷 2002年10月 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第10期 11921195 配制成50、100、200、500、1000、2000 ngL的标准溶液。 2.2.2 ELISA实验条件的筛选优化 对两种包被方法进行了考察和比较,并以灵敏度为指标,考察了 各步实验条件,包括不同浓度的抗原、 抗体、 标记物及显色剂配方、 温育的温度和时间,其它溶液浓度及 体积等因素对实验结果的影响,优选出实验条件。 A法:以猪肺炎酶浆菌的上清液的稀释液,每孔150L包被酶标板,4 过夜。用稀释液200L 孔 洗涤酶标板3次后,以封闭液250L 孔封闭,室温1 h。用兔抗猪肺炎霉浆菌血清溶液,加150L孔, 37 温育反应1 h。用封闭液洗涤3次后,再用生物素标记的羊抗兔IgG溶液,加150L 孔,37 温育反 应1 h ,制成固定相A。 B法:用兔抗猪肺炎霉浆菌血清溶液,加150L 孔,37 温育反应1 h。用封闭液洗涤3次后,以封 闭液250L 孔封闭,室温1 h。再用生物素标记的羊抗兔IgG溶液,加150L 孔,37 温育反应1 h ,制 成固定相B。 2. 2.3 ELISA的操作过程 以上A、B两种固定相分别用封闭液洗涤1次及稀释液洗涤2次后,加标准 溶液或待测发酵液的样品溶液100L 孔和HRP标记的链霉亲和素溶液100L 孔,37 温育40 min ,进 行竞争反应。用稀释液洗涤2次后,以新配显色剂100L 孔,室温3040 min显色。于酶标仪上读取 吸光度A410。 图1 ELISA测定生物素的标准曲线 Fig. 1 Standard curve of enzyme2linked immunosorbent assay for biotin determination 21214 样品溶液的制备 发酵液直接用稀释液稀释 至11000 ,备用。 3 结果和讨论 3.1 标准曲线 以灵敏度为指标,从数十条标准曲线中筛选出 最优操作条件制备的标准曲线。图1为浓度范围在 502000 ngL标准曲线。以logit (100 BB0)2logC线 性回 归 logit ( 100 BB0)= ln 100BB0/ ( 1002 100BB0 ) , B及B0分别为不同浓度的标准溶液及 零浓度时的吸光度 ,斜率为- 3. 198 ,截距为8. 482 , 线性相关系数r= - 0. 990。灵敏度(50 %抑制率所 对应浓度IC50)为410 ngL ,最低检出限(产生10 %的抑制率所对应的生物素浓度)为83 ngL。 3.2 ELISA测定条件的优化及两种包被方法结果的比较 在条件筛选优化过程中,发现固定相的制备操作步骤中,采用如2.2.2中所述包被方法A法或包被 方法B ,再分别经两步或一步免疫反应得到的生物素结合于酶标板孔壁表面的固定相,测定结果有明显 差别。本文对A、B两种方法作了如下考察: 按照方法A ,即用猪肺炎霉浆菌2兔抗猪肺炎霉浆菌血清2生物素化羊抗兔IgG制成含生物素的固定 相,以回收率为指标,将空白培养液YPD2CYH用PBS 11000稀释后进行加标实验;以生物素贮备液加 标,制成含量为200、500、1000 ngL的加标溶液,测定并计算回收率,结果见表1。另外,按照包被法B , 即以兔抗猪肺炎霉浆菌血清2生物素化羊抗兔IgG制成含生物素的固定相,加标溶液浓度100、500、1000 ngL。回收率测定结果列于表2。 表1 本文A法的生物素在空白培养液中的回收率 Table 1 Recoveries of biotin in blank culture solutions using myciplasm hyopneumoniae for coating microtiter plate 生物素加入量 Biotin added (ng L) 生物素测定量 Biotin found (n= 5) mean + SD (ng L) 相对标准偏差 RSD ( %) 回收率 Recovery ( %) meanSD 平均回收率 Mean recovery ( %) 200 199.7249.68 24.87 99.8624.90 500506.9031.166.15101.386.23 10001021.4480.307.86102.148.03101.13 3911第10期杨 红:生物样品中生物素的酶联免疫吸附分析两种包被方法的比较研究 表2 本文B法的生物素在空白培养液中的回收率 Table 2 Recoveries of biotin in blank culture solution using rabbit anti2myciplasm hyopneumoniae serum for coating microtiter plate 生物素加入量 Biotin added (ng L) 生物素测定量 Biotin found (n= 5) mean + SD (ng L) 相对标准偏差 RSD ( %) 回收率 Recovery ( %) meanSD 平均回收率 Mean recovery ( %) 100153.9643.1228.0154.043.1 500586.00153.8626.3117.230.8 10001145.96455.3339.7114.645.5128.6 由表1可知,采用包被方法A ,空白培养液中加标生物素分别为200、500和1000 ngL时,平均回收 率为101.13 %;平均RSD为12.96 %。由表2可知,采用包被方法B ,空白培养液中加标生物素含量分别 为100、500和1000 ngL时,平均回收率为128. 6 %;平均RSD为31. 33 %。相对标准偏差(RSD)可反映 方法的精密度,加标回收率可反映方法的准确度。比较以上结果,用猪肺炎霉浆菌包被测定结果的精密 度和准确度均比用兔抗猪肺炎霉浆菌包被的结果好。尽管A法中多一步免疫反应,使免疫复合物的结 构增加,但并未发现散射光对测定有影响。另外,作者也曾用生物素羊抗兔直接包被酶标板,用竞争抑 制法测定生物素,其结果比本文B法还差。 酶联免疫吸附测定是基于包被物同酶标板孔壁之间的物理吸附作用的。以上结果的差异提示猪肺 炎霉浆菌与酶标板孔壁的物理吸附力强于兔抗猪肺炎霉浆可能是主要原因。即用抗体包被时由于物理 吸附力低,在后续操作时部分脱落,从而使固定相上的生物素量降低,最后在固定相上的HRP量降低, 图2 在PBS及11000稀释的YPD2CYH中的生物素 标准曲线 Fig. 2 Standard curve of biotin in PBS and in 11000 diluted YPD2CYH YPD2CYH1 酶母菌提取物、 蛋白胨、 葡萄糖、 琼脂和放线菌酮 (yeast extract , peptone , dextrose , agar and cycloheximide)。() PBS; (? )1 1000YPD2CYH空白溶液(blank solution)。 导致最后测定的吸光度值偏低,使回收率偏高;并 且低物理吸附力的固定相和操作过程中,脱落的程 度不同,导致精密度的降低。而用包被方法A ,从操 作上增加了一步免疫反应,并增加了洗涤操作,而回 收率仍十分理想,正好认证了猪肺炎霉浆与酶标板 孔壁的物理吸附力强于兔抗猪炎霉浆菌这一推断。 3.3 基质效应的消除与基因转殖酵母菌培养液的 测定 为达到对发酵液的直接测定,排除发酵液中其 它成分对测定的干扰的目的,在灵敏度许可的条件 下,基质效应可通过充分稀释试液消除 5 ,6 。表1中 加标回收率为101. 13 %的结果已证实这一点。此 外,还分别以PBS为溶剂与用PBS稀释至11000的 YPD2CYH的空白培养液为溶剂,制成不同浓度的生 物素标准溶液,分别求得的标准曲线,比较结果见图 2。图中两条曲线非常接近,也表明了培养液经 11000稀释,可消除基质效应的影响,因而生物样品无须经过提取等分离步骤,可以稀释后直接测定。 用本文A法测定63株基因转殖酵母菌及未经转殖的野生菌株(candida utilis)的发酵液中生物素含量测 定结果见表3。 表3 野生菌株培养液中的生物素经基因转殖后培养液中生物素含量的提高值 Table 3 Biotin concentrations in wild type yeast and the transformed yeast as well as the increased rate of biotin concentration 野生菌中生物素的测定值 Conc. (Wild type) gL - 1 51 基因转殖菌中生物素的测定值Conc. (Transf. ) gL - 1 200010009995004991009940 不同生物素浓度的基因转殖菌数目Yeast numbers416349 不同生物素浓度基因转殖菌之比例Yeast percentage ( %)6.3525.4053.9714.29 转殖后生物素浓度提高倍数Biotin increased factor2010102 4911 分 析 化 学第30卷 4 结 论 对包被工艺进行了改进。酶标板首先用猪肺炎霉浆菌包被,再依次与兔抗2猪肺炎霉浆菌抗血清及 生物素化羊抗兔IgG反应形成固定相。精密度与准确度证实了本方法的优势,且本文检测限仅约为同 类文献值 7 的1150。由于高的灵敏度,样品液11000倍稀释时,溶液中的生物素浓度仍然在标准曲线 的工作范围内。因此,基质效应即可简单地通过稀释得到消除。本文方法简便,灵敏度好,准确度高,对 于基因转殖酵母菌发酵液中生物素的定量测定,结果满意,并为其它生物样品的直接定量分析提供了借 鉴。 致 谢 承台湾中山大学宣大卫教授提供设备和技术指导。 References 1 The Merck Index 12th Edition , 1996,207:1272 2 Delgado Reyes F , Fernandez Romero J M, Luque de Castro M D.Anal.Chim.Acta, 2001, 436:109117 3 Mar Masson , Kyusik Yun , Tetsuya Haruyama , Eiry K obatake , Masuo Aizawa.Anal.Chem. , 1995, 67:22122215 4 Chen Y ingwu (谌英武) , ChenJing (陈 静) , Chen Qiming (陈启明) , Li Haitao (李海涛 ) . Chinese J.Instrumental Analysis (分析测试学报) , 1998, 17(5) :6971 5 Yang Hong(杨 红 ) . Chinese J.West China Journal of Pharma.Sci . 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