木瓜蛋白酶水解大豆蛋白工艺条件的优化.pdf

第 4 期( 总第 1 3 3 期) 农产品加工 学刊 2 0 0 8年 4月 A c a d e m i c P e r i o d i c a l o f F a r m P r o d u c t s P r o c e s s i n g No 4 Ap r 文章编号：1 6 7 1 9 6 4 6( 2 O O 8 ) 0 4 0 0 6 7 “ 0 3 木瓜蛋白酶水解大豆蛋白工艺条件的优化 左继红 ，崔政伟 ，邬敏辰 ，张树飞 ( 1 江南大学 机械学院，江苏 无锡2 1 4 1 2 2 ；2 江南大学 医学院，江苏 无锡2 1 4 1 2 2 ) 摘要：以大豆浓缩蛋白为原料，研究了酶用量、固液比、水解时间、水解温度及 p H值对氨基酸提取率的影响。最佳 酶解条件为：酶用量为5 ，固液比为 1 ： 8 ， 水解时间为 5 h ，水解温度为 5 5 ，p H值为 6 7 。得到了用木瓜蛋白 酶水解大豆蛋白质的最佳酶解工艺。 关键词：木瓜蛋白酶；大豆；水解 ；蛋白质 中图分类号 ：T Q 9 2 5 + 2 文献标志码 ：A T e c h n o l o g y Op t i mi z a ti o n o f S o y a P r o t e i n Hy d r o l y z e d b y P a p a i n Z u o 皿I叩g 1 ，C u i Z h e n g w e i ，Wu b l i a g e h e 2 ， $ h u t ( 1 S c h o o l o f E n g i n e e ri n g ，J i a n g n a n Un i v e r s i t y ，Wu x i ，J i a n g s u 2 1 4 1 2 2，C h i n a ； 2 S c h o o l o f M e d i c i n e ，J i a n g n a n U n i v e rs i t y ，Wu x i ，J i a n g s u 2 1 4 1 2 2 ，C h i n a ) Ab s t r a c t ： Me t h o d s W i t h s o y a s t h e r a w ma t e ri a l ， t h e e ff e c t s o f t h e a mo u n t o f p a p a i n，r a ti o o f s o l i d t o l i q u i d，t i me，t e mp e r a - t u r e a n d p H v a l u e o n t h e e x t r a c ti o n e fi c i e n c y o f a mi n o a c i d s we r e i n v e s t i g a t e dRe s u l t s the o p ti mal c o n d i t i o n o f e n z y mo l y s i s wa s a s f o i l o ws ：t h e a mo u n t o f D a p a i n o f 5 ，r a ti o o f s o l i d t o l i q u i d o f 1：8 ，h y d r o l y s i s D r 5 h a t 5 5 a n d p H 6 7 C o n c l u s i o n t h e o p t i ma l t e c h n o l o g y c o n d i ti o n o f s o y p r o t e i n h y d ml y z e d b y p a p mn C an b e o b t a i n e d Ke y w o r d s p a p a i n；s o y a ；h y d r o l y s i s ；p r o t e i n 蛋白质是人体必不可少的营养素，在人体的代谢 和生长过程中起着十分重要的作用。然而由于不同蛋 白质的氨基酸组成与空间结构不同，在人体 内的消化 吸收率也大不相同。当蛋白质被水解为小肽和游离氨 基酸后，其吸收利用率大为增加。因此，为了充分利 用好这些蛋 白质资源 ，对蛋 白质进行水解是十分必要 的，现在蛋白质的水解产品已被广泛应用于医药和其 他保健食品中， 满足活性肽产品的需要【 2】 。 以蛋白质为原料 ，水解制取氨基酸的方法有酸水 解法 、碱水解法和酶水解法 3种。 酸水解法水解虽彻底，但条件剧烈，色氨酸全被 破坏， 丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸被部分破坏；水解液 需经过中和及脱盐处理，工艺路线长，能耗高，设备 腐蚀大，营养成分损失多。 碱水解只能得到消旋化的氨基酸，羟基氨基酸、 巯基氨基酸全被破坏；且造价高，设备腐蚀严重，营 养成分损失也大。 酶水解法反应条件温和，操作简单，能保留更多 的营养成分 ，且水解过程易控制 ，不 会造成大的环境污染 。随着 我国酶工业 的迅速发 展，蛋白酶生产成本大幅下降，用酶水解蛋白质制取 氨基酸具有可行性 。 大豆产于我国，主产区在松辽平原中北部、三江 平原 、黄淮平原 、黑龙江省 ，以及长江 中、下游地 区，原料来源广泛 木瓜蛋白酶是由植物木瓜提取 的，可以大规模加工生产问 。 本实验研究 了木瓜蛋 白酶水解大豆蛋白的工艺条 件，为生产营养丰富和氨基酸种类齐全的天然保健品 奠定了工艺基础 。 1 材料与方法 1 1 试验原料及主要试剂 大豆浓缩蛋 白 ( 蛋 白质含量约 7 O ) ，秦皇 岛金 海食品工业有限公 司提供 ；木瓜蛋 白酶 ，无锡雪梅酶 制剂厂产品；甲醛、氢氧化钠、盐酸、酚酞、邻苯二 甲酸氢钾 ，均为 国产分析纯试剂。 1 2 主要仪器设备 P B 2 0 3 一N型电子精密天平 、D E C T A 3 2 0型p H 计、8 8 1 型定时恒温磁力搅拌器、H H 一6 型数显恒 温水浴锅 、循环水 式多用真空泵 、G 8 O 2 3 C S P z型 微波炉 、K Q B型玻璃仪器气流烘干器。 1 3 氨基氮含量的测定方法 采用 甲醛滴定法咧 定大豆蛋白中的氨基酸含量 。 取一定量的大豆蛋 白，分装到 5个锥形瓶中，每 收稿 日期 ：2 0 0 8 0 3 0 4 作者简介 ：左 继红( 1 9 8 1 一 ) ，男 ，河南人 ，硕士 ，研究方 向：食品工程机械的研究 。E - m a i l ：z u o j i h o n g 2 0 0 6 1 6 3 c o m。 维普资讯 农产品加工 学刊 2 0 0 8 年第4期 份 5 0 0 g ，称量出对应的酶用量 ，选择一个合适的固 液 比 ( 相对于大豆浓缩蛋 白的质量 比) ，先将酶溶解 到蒸馏水中，待完全溶解后倒人锥形瓶中，用玻璃棒 搅匀 ，然后放到一定温度的水浴锅中加热 。达到水解 时间后 ，在沸水 中灭酶活 5 m i n ，用滤纸过滤 ，用移 液管取 出中间溶液 2 m L，移人 l o o m L的容量瓶 中 ， 定容，摇匀，用 3 0 m L蒸馏水混合定容，摇匀。用 浓度为 0 0 5 m o l L的 N a O H滴定混 合液 ，滴定至 p H值为 8 2时( 刚显粉红色 ，此时不计碱的消耗 量) ，加入 5 m L的中性甲醛溶液，搅拌均匀后，继 续滴定至 p H值为 9 2( 粉红色) ， 记下 p H值 8 2 9 2 时所 消耗的 N a O H用量( ) 。根据 N a O H的消耗量 ， 可以计算出酶解溶液中的氨基氮含量。每次滴定都要 作一个空 白对照 ，即取 3 2 mL蒸馏水置于 1 0 0 mL的 洁净烧杯中，先用 N a O H标准溶液将 p H值调至 8 ,2 ( 此时不计碱的消耗量) ，再加入 5 m L的中性甲醛溶 液 ，用浓度为 0 0 5 m o l L的 N a O H标准溶液滴定至终 点( p H值为 9 , 2 ) ，记下 N a O H的消耗量 ，氨基氮 的含 量( g L ) 为 ： 氨基氮 ： ，二 )_ 尘 Q 2 结果与分析 2 1 大豆蛋白酶解单因素的选择 大豆蛋白酶解的影响因素主要有 5 个，即：固液 比、酶用量、酶解 p H值、酶解温度、酶解时间。 2 1 1 固液 比的选择 固液 比选择 了 5个水平 ，每组均取 5 0 0 g的大 豆浓缩蛋 白，分别加入 2 O ，3 O ，4 O ，5 O ，6 0 mL水 ， 即固液 比为 1： 4 ，1- 6 ，1- 8 ，1： 1 0 ，1： 1 2 。在 底物浓度不同时 ，酶水解效果也有差异 。其他因素条 件是 ：酶用量为 5 酶解 时间为 4 h ，酶解温度 为 5 O，酶解 p H值为 6 7( 蒸馏水的 p H值) 。每个水 平重复 3 次 。固液比对大豆蛋 白酶解的影响见表 1 。 表 1 固液比对大豆蛋白酶解的影响 从表 1 可知 ，大豆蛋 白酶解溶液氨基氮的含量随 着固液比的升高而降低； 但氨基氮水解液氨基氮总量 随着 固液 比的增 大先 升 高 ，后 降低 ；在 固液 比为 1： 8时 ，氨基氮水解液氨基氮总量 为最多。 2 1 2 酶用量的选择 在底物浓度相同情况下，加酶量的不同，酶解反 应效果也不同。实验共分 5 组 ，每组均取 5 0 0 g的大 豆浓缩蛋 白，酶用量分别 为 1 ，2 ，3 ，4 ， 5 ，6 ，其他因素条件是 ：固液比为 1： 8 ，酶解 时间为 4 h ，酶解温度为 5 0，酶解 p H值为 6 7 ( 蒸馏水的p H值) 。每个水平重复 3 次。酶用量与氨 基氮含量 的关 系见 图 1 。 抽 瑚 酶 图 1 酶 用量与氨基氮含量的关系 由图 1 看出，在其他因素固定不变的条件下，大 豆蛋白酶解溶液中的氨基氮含量随着酶用量的增多而 升高；酶用量为 5 以下时，氨基氮含量增长比较显 著；酶用量为 5 以上时，氨基氮含量增长缓慢。从 经济上考虑，酶用量为 5 较为合适。 2 1 3 酶解 p H值 的选择 木瓜蛋白酶的最适 p H值为 6 7左右，因此选取 了5 个 p H值水平：5 7 ，6 2 ，6 7 ，7 2 ，7 7 。酶解的 其他因素是：酶用量为 5 ，固液比为 1- 8 ，酶解温 度为5 O，酶解时间为4 h 。酶解 p H值与氨基氮含 量的关系见图 2 。 船4 抽 瑚 蛹 图 2 酶解 p H值与氨基氮含 量的关 系 由图 2 看出，其他因素固定不变的条件下，在上 述 5 个水平中，氨基氮变化不是很大，p H值为 6 7 时的氨基氮含量相对较高。 维普资讯 2 0 0 8 年第4 期 左继红，等：木瓜蛋白酶水解大豆蛋白工艺条件的优化 6 9 2 i 4 酶解温度的选择 2 2 大豆蛋白酶解的正交设计 木瓜蛋白酶的活性最适温度是 4 5 6 0 cIC ，因此， 由上述单因素试验看出，大豆蛋白酶解的固液比 选取了酶解温度 4 0 ，4 5 ，5 0 ，5 5 ，6 0 cIC 共 5个水 为 1： 8时的氨基氮含量最高，氨基态氮总量最多。 平。其他 因素 条件是 ： 酶用量为 5 ， 固液 比为 结合其含量和总量分析 ，固液比为 1 ： 8 较为适合。 1 ： 8 ，酶解时间为 4 h 。，酶解 p H值为 6 7( 蒸馏水的 、 固液比对提取液的氨基氮含量影响很大，很可能掩盖 p H值) 。酶解温度与氨基氮含量的关系见图3 。 其他因素的作用效果，因此这个因素在下面的正交试 验中不予考虑。大王 蛋白酶解正交试验的因素与水平 咖 =日 蛹 图 3 酶解温度与氨基氮含量的关系 由图 3可 以看 出 ，当温度从 4 0 c IC 上升到 5 0 c IC 时 ，大豆蛋白酶解溶液氨基氮的含量是上升的 ，继续 升温其含量变化不大。 2 1 5 最佳酶解时间的选择 酶解时间会对木瓜蛋白酶水解大豆蛋白的效率产 生重要 的影响，酶解时间过短 ，水解不充分 ；酶解时 间过长，酶易失活，水解液易腐败 ，水解效率不高。 其他因素条件是：酶用量为 5 ，固液比为 1： 8 ，酶 解温 度 为 5 0 cIC，酶解 p H值 为 6 7( 蒸 馏 水 的 p H值) 。酶解时间与氨基氮含量的关系见图4 。 皿 皿 锕 蝴 蛹 图 4 酶解时间与氨基氮含量的关系 由图 4可 以看 出，在酶解 5 h以前 ，大豆酶解溶 液氨基氮含量随着酶解时间的延长而升高。酶解 5 h 以后，随着酶解时间的延长，氨基氮含量呈现减弱的 趋势 ，这一现象有待研究 。 设计见表 2 ，大豆蛋白酶解的正交试验结果见表 3 。 表 2 大豆蛋白酶解 正交试验的因素与水平设计 表 3 大 豆蛋 白酶解的正交试验 结果 表 1 和表 2 试验表明，不同因素条件下的水解液 中的氨基态氮含量为 0 6 2 3 0 8 1 2 g L ，变化较大。根 据 值大小得到最优的水平组合为A B 2 C 3 D ，由极差 值R可知各因素的主次关系是 C A B D 。 3 结 论 ( 1 )从单因素和多因素看，固液比对氨基氮的影 响最为显著。固液 比为 1： 8时的氨基氮 总量最多 ， 所以从经济上考虑，固液比为 1： 8 比较合适。 ( 2 )温度对酶解 液的氨基氮含量具有较大影响 ， 温度为 5 5 cIC 时的氨基氮含量比较高。 ( 3 )酶的浓度在试验范围内，氨基氮含量随着酶 用量的增加而升高 (4 )综合其他因素和从经济角度考虑，酶用量为 5 时最好。时间和 p H值对水解液氨基氮的含量的 影响比较小， 且最佳 p H值为 6 7 ，水解时间为 5 h 。 ( 5 )木瓜蛋白酶对大豆蛋白水解的最佳工艺条件 ( 下转第 7 3页) 维普资讯 2 0 0 8 年第4 期 王静 ，等：热浸法提取花生壳中多酚类物质的工艺研究 7 3 由图 5可知 ，随着浸提时间的延长 ，花生壳 中多 酚类物质的提取率也随之增加，但多酚类物质的提取 率增加缓慢，只有在 2 4 h时提取率增加得较多。这 是 由于在初始的时间里 ，多酚类物质已基本被完全溶 出，在 以后 的时间里则溶 出较少 ，因此浸提时间选用 4 h。 3 6 3 4 ) 正交实验结果与分析 在单 因素试验 的基础 上 ，采用热浸提法进行 提 取花生壳中多酚类物质的正交实验 ，正交实验结果 见表 3 。 表 3 正交 实验结果 由表 3极差分析 可知 ，影响热浸提法提取花生壳 中多酚类物质各因素的主次顺序为：A ( 乙醇体积分 数) C ( 料 液 E L ) D ( 浸提 时间) ( 浸提温 度) ，说明乙醇体积分数对实验结果的影响最大，浸 提温 度对 实验 结果 的影 响最小 。得 出最优 方案 为 A B I C 2D ， ，即乙醇体积分数 为 6 5 ，浸 提温度为 7 5，料液 比为 1： 3 0 ，浸提时间为 5 h ，此条件是 热浸提法提取花生壳中多酚类物质的最优工艺条件。 3 7 最优组合验证试验 由于最 优组 合 A B C 2 D 未 出现在 实验 方案 中 ， 应进行验证试验 ，采用条件为 ：乙醇体积分数为 6 5 ，浸提温度 为 7 5 ，料液 比为 l： 3 0 ，浸 提时 间为 5 h ，进行热浸提提取，测得多酚类物质提取率 为 5 6 6 m g g ，证明此条件下所得到的多酚提取率最 大 ，即该条件为最佳提取工艺条件。 4结论 ( 1 )通过单因素试验和 L g ( 3 3 J E 交实验 ，优化出 花生壳中多酚类物质的最佳提取工艺条件为：乙醇体 积分数为 6 5 ，浸提温度为 7 5，料液比为 1 ： 3 0 ， 浸提时间为 5 h ，多酚提取率可达 5 6 6 m g g 。 ( 2 )该工艺为花生壳 中多酚类物质的纯化和生物 活性评价等研究奠定了基础 ，以此可提高花生的综合 利用价值。 参考文献 ： 詹沛鑫 ，李庆生 花生壳提取物的抗氧化活性研究 f J t I l l 轻化工学院学报，2 0 0 0 ，1 3( 2 ) ：3 7 3 9 曹凯光 花生资源的综合开发利用 J 食品科技，2 0 0 2 ( 1 ) ：1 5 1 7 赵志强 ，禹山林 花生的综合开发利用 f J 农牧产品开 发 ，1 9 9 5 ( 7 ) ：6 - 9 李明姝 ，姚开 贾冬英 花生功能成分及其综合利用 f J 中国油脂，2 0 0 4 ( 9 ) ：1 3 1 5 杨伟强 ，秦晓春，张吉民 花生壳在食品工业中的综合 开发与利用 f J 花生学报，2 0 0 3 ( 1 ) ：3 2 程水明，周国玉 花生壳天然抗氧化成分 的提取研究 J 1 河南农业大学报，1 9 9 7 ，3 1( 2 ) ：1 6 2 1 6 5 汪秋安 天然黄酮类化合物的生理功能及其应用 f J 香 料香精化妆品，1 9 9 9 ( 1 ) ：2 8 3 3 孟阳，于丽娟 花生壳中黄酮类抗氧化物的提取及在食