响应面优化黑葵花籽壳中黄酮的提取及抗氧化性研究.pdf

2 0 1 1 NO 9 1 5 2 S e r i a l N o 2 3 4 Ch i n a B r e wi n g R e s e a r c h Re po 响应面优化黑葵花籽壳中黄酮的提取及抗氧化性研究 张净阮， 张守媛 ( 长春工业大学 化学与生命科学学院， 吉林 长春 1 3 0 0 1 2 ) 摘要： 利用响应 面法对黑葵花籽壳中黄酮类化合物 的提取条件进行 了优化， 得出了黑葵花籽壳黄酮类化合物的最佳工艺条件。结 果表明： 从黑葵花籽壳中提取黄酮类化合物的最佳乙醇浓度为7 0 v o l ， 最佳提取温度为5 0 C ， 提取时间为2 h ， 料液比为1 ： 2 3 ( v w) 。 在 此条件下提取率由5 6 提高到6 2 。对葵花籽壳黄酮的抗氧化研究表明： 葵花籽壳黄酮的还原能力和超氧阴离l 自由基 ( 0 ) 的清除 作用均明显高于2 ， 6 - 二叔丁基对 甲酚 ( B HT ) ； 在质量浓度小于8 0 mg m时， 葵花籽壳黄酮对羟基 自由基 ( O H) 的清除率 高于B H T， 而 在质量浓度大于8 0 m L 时低于B HT 。 关键词： 响应面法； 黑葵花籽壳黄酮； 抗氧化 中图分类号 ： R 2 8 4 2 文献标识码： A 文章编号： 0 2 5 4 5 0 7 1 ( 2 0 1 1 ) 0 9 0 1 5 2 0 5 Op t i mi T a t i o n o f e x t r a c t i o n c o n d i t i o n s o f f l a v o n o i d s f r o m b l a c k s u n - fl o we r s e e d s h e l l b y r e s p o n s e s u r f a c e me t h o d a n d i t s a n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s Z HANG Ha i y u e ， ZHANG S h o u y u a n ( C o l l e g e o f C h e mi c a l a n dL i f e S c i e n c e , C h a n g c h u n U n i v e r s i t yo f T e c h n o l o g y , C h a n g c h u n 1 3 0 0 1 2 , C h i n a ) Ab s t r a c t ：Extr a c t i o n c o n di t i o n s of fla v o n oi d s f r o m bl a c k S t i l l flo we r s e e d s h e l l we r e o pt i mi z e d b y r e s po ns e s u r f a c e me t h od o l og y Th e r e s u l t s h owe d t ha t t he o p t i ma l e x tra c t i o n c o nd i t i on s we r e a s f o l l o ws ：a l c o ho l c o nc e ntra t i on 70 v ol ，e x t r a c t i on t e mp e r a tur e 5 0 C，e x t r a c t i o n t i me 2 h a n d s o l i d l i q u i d r a t i o 1 ： 2 3 ( v w ) a n d t h e e x tr a c t i o n r a t e in c r e a s e d f r o m 5 6 t o 6 2 u n d e r t h e c o n d i t i o n s R e s e a r c h o n a n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s s h o we d t h a t fl a v o n o i d s o f b l a c k s u n fl o we r s e e d s h e l l h a d b e tt e r r e d u c i n g a b i l i t y a n d s u p e r o x i d e a n i o n fre e r a d i c a l s( O ) s c a v e n g i n g a b i l i ty t h a n t h a t o f b u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e ( B HT ) T h e fl a v o n o i d s o f b l a c k s u n fl o w e r s e e d s h e l l h a d b e t t e r a b i l i ty o f s c a v e n g i n g h y d r o x y l fr e e r a d i c a l s ( O H ) t h a n t h a t o f B H T wh e n ma s s c o nc e n tra t i o n l e s s t h a n 8 O mg L， wh i l e i t h a d l o we r e ffe c t t h a n BHT whe n ma s s c o n c e n tra t i o n wa s h i g h e r t h a n 8 O m Ll Ke y wo r d s ： r e s po ns e s u r f a c e me t ho d o l o g y； fla vo n oi d s o fb l a c k s u n flowe r s e e d s h e l l ；a n t i o xi d a nt a c t i v i t y 我 国黑葵花籽 资源十分丰 富 ， 特 别是东北地 区 。 葵花 籽壳 中的黄酮类 化合物主要为花色苷类物质 ， 花色 苷为重 要的天然色素 ， 主要应用在食 品、 饮 料中， 从葵花籽壳 中提 取 该物质 ， 不仅避 免 了资源 的浪 费， 还 为天然色 素 的提 取 应用开拓了更广阔的开发前景【 1 j 。黄酮类物质的优秀的抗 氧化能力可使其代替合成抗氧化剂， 用于油脂的抗氧化中 也可以改善谷类、 蛋糕和饼干以及传统的健康食品和膳食 添 加剂 的 市场潜 能 。因此对 天然 黄 酮类物 质 的研 究 、 开 发 、 利 用引起 了人们广泛 的关注R - 1 。本研究通过 响应面的 方法优 化 了葵花籽壳黄酮类物质 的提取 工艺参数 ， 为葵花 籽 壳黄 酮类的提取工艺及抗氧化 活性提供 了理论依据 。 1材 料与方法 1 1材料 黑 葵 花 壳购 于 吉 林 省 长 春 市 ， 手 工 剥 皮 ， 烘 干 ， 粉 碎 ， 备用 。 主要设备： F W1 0 0 高速万 能粉碎机 ( 天津市泰斯特仪 器有限公司生产) ； 电子天平 ( 北京赛多利斯仪器有限公司 生产) ； P C 一 1 0 0 0 数显式电热恒温水浴锅 ( 上海跃进医疗机 械厂生产) ； 鼓风干燥箱 ( 上海精宏实验设备有限公司) ； G L 2 1 L M离心机 ( 日本岛津) 。 试 剂： 乙醇 ， 盐酸 ， 2 ， 6 一 二叔丁基对 甲酚 ( B H T ) 、 无水 乙 醇、 水杨酸 、 邻苯三酚 、 铁氰化钾、 三氯化铁等均为分析纯 。 1 2 方 法 1 2 1提取溶剂的选择 分别 以不 同的体积分 数的 乙醇 ( 含 1 的盐酸) 作 为提 取溶剂： ( 1 ) 水； ( 2 ) 6 0 v o l 乙醇； ( 3 ) 7 0 v o l 乙醇； ( 4 ) 8 0 v o l 乙醇 ； ( 5 ) 9 0 v o l 乙醇 。 准确称 葵花籽 壳粉2 g ， 于 1 0 0 m Lj角瓶 l J ， 料 液 比为 ( 物料质量 ( g ) 与溶剂体积 ( mL ) 1 ： 1 5 ， 封 口浸提 。浸提温度 5 0 ， 时间6 0 mi n 。 浸提 结 束后 ， 过滤 ， 分别 以下列2 种方 法衡 量提 取 效 果 ： ( 1 ) 滤液 烘= F 称 重 ， 以 ( 粗提物 重量 原料 重量) X 1 0 0 计算 粗提率 ， ( 2 ) 吸取 l mL 色素液 ， 稀释 1 0 倍 ， 用紫 外 叮见 分光光度计在波长5 3 0 n m处测吸光度值 。 1 2 2提取剂最佳p H 值的确定 将不 同p H 值 ( 1 0 、 2 0 、 3 0 、 4 0 、 5 0 ) 的7 0 v o l L , 醇溶液 分 别 按料液 比1 ： 2 0 的 比例 加入 到2 g 葵花 籽 壳粉 末 中 ， 在 5 0 的恒温水浴锅 中浸提 1 h 。 浸提结束后， 过滤， 吸取 l mL 色素液， 稀释1 0 倍， j 紫 外可见分光光度计在波长5 3 0 n m处测吸光度值 。 1 2 3单因素试验 ( 1 ) 最佳浸提温度 的确 定： 准确称取2 g 葵花籽壳粉末 ， 收稿日期： 2 0 1 1 - 0 4 2 2 作 者简介： 张海悦 ( 1 9 6 7 ) ， 女， 教授 ， 主要 从事功能食品及农副产品的深加工方面的研 究工作。 研究报告 中 国 酿造 2 0 1 1 年第9 期 总第 2 3 4 期 1 5 3 在料液 比1 ： 2 0 ， p H值为 3 0 的7 0 v o l 醇 浓度 的条件 下 以 不 同温度浸提 ， 分别为3 0 、 4 0 c 【 = 、 5 0 、 6 0 、 7 0 ， 水浴浸 提 1 h ， 浸提结束后经稀释在5 3 0 n m处测定其吸光度值 。 ( 2 ) 最佳料液比的确定： 准确称取2 g 葵花籽壳粉末， 在 料液 比1 ： 1 0 、 l ： 1 5 、 1 ： 2 0 、 1 ： 2 5 、 l ： 3 0 ， p H值为 3 0 的7 0 v o l 乙 醇浓度 ， 温度为5 0 水浴浸提l h ， 浸提 结束后经稀释在 5 3 0 n m处测 定其 吸光度 值。 ( 3 ) 最佳浸提时间的确定： 准确称取2 g 葵花籽壳粉末， 以不 同 时间0 5 h 、 1 0 h 、 1 5 h 、 2 h 、 2 5 h ， p H值 为3 0 的7 0 v o 1 乙醇浓度， 温度为5 0 水浴浸提1 h ， 浸提结束后经稀释在 5 3 0 n m处测定其 吸光度值 。 1 2 4响应面法对提取工艺参数的优化与验证 根据单因素试验结果， 以葵花籽壳色素提取温度 ( A ) 、 提取时间( B ) 、 料液比( c ) 为试验因素进行二次回归正交旋 转组合设计， 各因素变化区间由单因素试验确定， 水平取 值及编码见表1 ， 响应面分析使用D e s i g n E x p e r t 件来完成。 表1 响应面试验设计因素水平取值及编码 Ta b l e 1 F ac t or s ，l e v e l s an d c o de s o f r e s po n s e su rfa c e e x pe r ime n t de s i g n 1 2 5葵花籽壳黄酮抗氧化性测定 ( 1 ) 对3 价 铁离 子还 原能力 的测 定 刀 ： 依 次加入2 0 mL p H值 为6 6 的0 2 mo l L 磷酸盐 缓冲 溶液 、 2 0 mL l 六 氰合 铁酸钾和2 0 m L 不同浓度的葵花籽壳提取液及B HT 溶液， 混匀， 5 0 水浴2 0 rai n 。冰浴快速冷却后， 加入2 0 mL 1 0 三氯乙酸， 于4 o C 、 3 0 0 0 r mi n 离心l O mi n 。 取上清液2 5 mL ) J H 入蒸馏J k2 5 m L 及0 5 mL 0 1 三 氯化铁 ， 静置 反应 1 0 mi n ， 在 波长5 3 0 ri m处测 定吸光值， 以无水 乙醇作参 比溶液 。 ( 2 ) 清除羟基自由基( O H ) 能力的测定 8 1 ： 采用固定反 应时间法， 在相同体积的反应体系( 8 8 m mo l L H 2 O ： 0 5 mL 、 9 mmo l L F e 0 5 mL 、 9 mmo l L 水杨酸 乙醇溶液0 5 mL ) 中加 入不同浓度的葵花籽壳黄酮提取液2 0 mL ， 并以无水乙醇 为参比溶液， 在5 3 0 n m处测定吸光值 ( A 2 ) ， 无水 乙醇代替 水杨酸 时的吸光 度值 ( A ) ， 无水 乙醇代 替样 品溶液时 的吸 光度值 ( ， 计算羟基 自由基清除率 ( 。 R= 【 1 一 ( A 2 - A1 ) A o x l 0 0 ( 3 ) 清 除超 氧 阴离 子 自由基 ( 0 ) 能力 的测 定 0 】 ： 取 1 O m L 不同浓度的葵花籽壳提取液， 加入9 O mL p H值为8 0 的0 0 5 mo l L 磷酸盐缓冲液， 2 5 恒温水浴1 5 mi n ， 取该混合 溶液3 0 mL 于比色管中， 加入4 5 mmo 儿 的邻苯三酚溶液 0 1 m L 反应3 mi n ， 测定其在波长5 3 0 n m处的吸光度值 ( A 2 ) ； 同时测定 添加邻 苯三酚前 样 品的吸光度值 ( A 1 t ) ； 另外 以 无水 乙醇 1 O m L 测定邻 苯三酚 的 自氧化程度 ， 吸光度值 为 ( A 。 ) 。超氧阴离子清除率 ( R )的计算公式如下： R = I 1 - ( A 2 一 Al ) A 0 x 1 0 0 l - 3标 准曲线的绘 制 用移液管准确 吸取0 0 mL 、 0 5 mL 、 1 0 mL 、 2 0 mL 、 3 0 mL 、 4 0 mL 的芦丁标准液分别置于1 0 mL 的容量瓶中， 加入水 2 mL - A mL ， 加 入5 0 亚硝 酸 钠0 4 mL ， 摇 匀 ， 放 置6 mi n ， 加 入 1 0 硝 酸铝0 4 mL ， 摇匀 ， 放置6 mi n ， 加入4 3 氢氧 化钠 4 0 mL ， 再加水 至刻度 ， 摇 匀 ， 放置 1 5 rai n ， 以试剂 空 白做参 照对比。 用最小二乘法做线性回归， 求的芦丁浓度 ( Y ) 与吸 光度值( A ) 的关系曲线。 Y=1 0 4 8 2 X+0 0 0 5 4 ， R 2 ： 0 9 9 9 5 。 2结果与分析 2 1提取溶剂的选择 由图l 可知， 7 0 v o l 乙醇为最佳提取溶剂， 因此试验的 提取溶剂选择7 0 v o l 的 乙醇 。 ：四 4 0 6 0 7 0 8 0 9 5 乙醇浓度 v o l 图1 乙醇浓度对吸光度的影响 Figu r e 1 Effe c t s o f alc o ho l c on c en t r a t ion on a b s oa n c e 2 2 p H 值 的确定 由图2 可知， p H值为3 0 时吸光度最大， 因此p H 值为3 0 为最佳提取p H 值 。 l 2 3 4 5 p H值 图2 p H 值对吸光度的影响 F i g ur e 2E ffe c t s of p H v alu e on a bs o r b an c e 2 3单因素试验 2 - 3 1料液比的选择 由图3 可知， 当料液比为1 ： 2 0 时吸光度最大， 因此料液 舳 0 O O O O O 赵 2 0 1 1 NO 9 1 5 4 S e r ia l N o 2 3 4 Ch i n a B r e wi n g R e s e a r c h Re po g 比1 ： 2 0 为最佳提 取料液 比。 O 4 2 O 4 O O 3 8 嚣o 3 6 。 一 3 0 3 2 O 3 0 0 28 I ： l O I ： I 5 I ： 2 0 I ：25 I ： 3 0 料液 比 图3 料液 比对吸 光度 的影响 Figur e 3 Effe c t s o f li qu id t o mat er i a l r a t io on a bs or b an c e 2 3 2提取温度的选择 由图4 可知， 提取温度5 0 。 【 二 时吸光度值最大， 随温度升 高吸光度值减 小 ， 因此5 0 为最佳提取温度 。 06 0 0 5 5 冬 0 5 0 0 45 0 4 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 温度 图4 温度对 吸光度 的影 响 Figur e 4E ffe c t s of e x t r a c t ion t e mp er at ur e on ab s or b a nc e 2 3 3提取时间的选择 由图5 可知 ， 提取 时问为 1 5 h 时吸光度值最大 ， 因此提 取 时间为1 5 h 为最佳提取 时间。 薹 O 5 1 0 1 5 2 O 2 5 时阃 h 图5 提取时间对吸光度的影响 Figur e 5 Effe c t s o f ex t r a c t ion t i me on a b s or ban c e 液 比 ( C ) 为 白变量 ， 以提取 液吸 光度 作为 响应值 ， 试验 设 计 及结果见表2 。 表2响应面试验设计结果 Ta ble 2Res u l t s o f r e s p on s e s u rf ac e d e sign 利用D e s i g n E x p e r t 软件对表2 的试验数据进行3 7 d 2 次 回归分析 ， 逐步排除不显著项 ， 得到拟合 回归方程 ： R = 0 5 37 00 +0 07 7 25 0A+7 00 00 0E 0 03 B， 1 00 00 0E 00 3C+ 0 01 7 7 5 0 AB一 0 0 2 9 2 5 0 AC一 0 01 2 7 5 0 BC 0 1 1 4 8 8 A 0 0 2 2 8 7 5 B 一 7 3 7 5 0 0 E 0 0 3 C 表3回归模型方差分析 Ta ble 3 Va r ian c e an a l y s is o f r e gr es s ion mod e l 2 4响应面法确定葵花籽壳黄酮最佳提取条件 2 4 1响应面法试验设计及结果 对此回归模型进行方差分析， 结果见表3 。 提取温度对 根据B o x B e l 1 I l k e n 的中心组合设计原理， 设计了3 因素 模型影响极为显著， 该模型的相关系数R 2 = 0 9 9 4 6 说明， 模 3 水平的响应面分析试验， 以温度 ( A ) 、 提取时间( B ) 和料 型预测精度达9 8 7 6 ， 该模型与实际实验拟合较好， 自变 鸵 如 2 01 1 No 9 1 5 6 S e d a l N o 2 3 4 Chi n a Br e wi n g R e s e a r c h Re po n 便会 与水杨 酸竞 争 O H， 而使 有色产物 的生成量 减少 1 2 。 从图8 可 以看 出， 葵 花籽 壳黄酮对 O H 有一 定的清除作用 ， 并且随样品质量浓度的升高清除作用不断增强。在质量 浓度为8 0 mL 以下， 葵花籽壳黄酮对羟基 自由基的清除率 高于B H T ， 而在 浓度 高于 8 O mg m时葵 花籽 壳黄 酮对 O H 的清 除率低于B HT 。 2 5 5 +BH_ r 一葵花籽壳黄酮 样 i 1 1浓度 ( mg I _ 。 ) 图8 葵花籽壳黄酮浓度对 OH的清除率的影响 Figu r e 8 Effe c t o f fl av o n oids c o n ce n t r a t ion f r c lm b lac k s u r lf l o wer s ee d s he l l o n OH s c a ve n gi n g r a t e 2 5 3对0 清除能力的测定 0 2 4 6 8 样品浓度 ( mg ) BHT 葵花籽壳黄酬 图9 葵花籽壳黄酮对O 清 除能 力的影响 Figu r e 9 Effe c t of f lav o no i d s c o n ce n t r at i o n f r Om b l a c k s u n -f l o wer s ee d s he l l o n Os c av e n gi n g r at e 邻 苯三 酚在碱性条 件下 能发生 白氧 化生成 有色 中 问 产物 1：1 0 2 - ， 质 量浓度越 高， 自氧化 的催化 反应 速度越 快 ， 而抗氧化剂能迅速捕捉0 2 - ， 从而抑制邻苯三酚 自氧化反 应 。从 图9 可 以看 出， 葵花籽 壳黄酮对0 2 “ 的清 除作用 明显 高于B H T， 并且随着样 品质量浓度的增加， 其清除O 2 的 作用增强。当样品质量浓度为4 o mg m时， 清除率达到 了 5 2 9 4 ， 继续增加样 品质量浓度 ， 清除率基本 小变 。 3结论 根据 中心组合 设计 原理， 采用3 因子4 水平的响应面分 析法 ， 得 出了黑葵花籽 壳黄酮类化 合物 的最佳 工艺条 件 。 结果表 明： 从黑葵花籽 壳中提取黄酮类化合物 的最佳提取 溶剂为7 0 v o l 乙醇溶 液， 最佳提取温度为5 0 ， 提取时问为 2 h ， 料液 比为1 ： 2 3 。 在此条件 下提取率 由5 6 提 高到6 2 。 对葵花籽壳黄酮的抗氧化研究表明： 葵花籽壳黄酮对3 价 铁离子的还原能力和超氧阴离子 自由基 ( 0 2 - ) 的清除作 用均 明显 高于2 ， 6 二叔 丁基 对 甲酚 ( B HT ) ； 在质 量浓度 小 于8 0 mg L 时， 葵花籽壳黄 酮对羟基 自由基 ( O H ) 的清 除率 高 于B H T ， 而在质量浓度 大于8 O m g m时低 于B H T 。 参考文献： 1 王蕾 ， 张海悦 ， 白雪丽 ， 等 葵花籽 资源在 食品工 业 的新 升发 食品科技， 2 0 0 7 ( 1 0 ) ： 7 - 9 2 】 朱红梅， 赵猛 响应面优化沙棘色素提取及抗氧化研究 J 】 l 林产化 学与工业， 2 0 1 0( 8 ) ： 8 0 8 3 3 邓洁 红， 谭兴和 ， 郭时印 ， 等 响应 面优 化刺葡萄皮色素提取工 艺参数 J 湖 南农业大 学学报： 自然科学版 ， 2 0 0 7 ， 3 3 ( 6 ) ： 6 9 4 ， 6 9 9 4 】 张海悦 ， 王蕾 葵花籽 壳色素 的提取 及稳 定性研 究 J 】 中国酿造 ， 2 0 0 9( 7 )： 7 2 7 4 5 1NOU E l ( ， OC HI H， T AK E TS U K A M， e t a 1 Mo d e l i n g o f t h e e c t o f fre e z e r c o nd i t i o ns o n t h e p r i n c i pa l c o n s t i t ue n t p a r a me t e r s o fi c e c r e a m b y u s i n g r e s p o n s e s u r