硫酸化大蒜多糖的制备及其鉴定.pdf

91工艺技术食品科学2007, Vol. 28, No. 02 a n d v o l a t i l e c o m p o u n d s o f S p a n i s h “S e r r a n o ” d r y - c u r e d h a m a s a f u n c t i o n o f t w o p r o c e s s i n g t i m e s J . J o u r n a l o f A g r i c u l t u r e a n d F o o d C h e m i s t r y , 1 9 9 7 , 4 5 : 2 1 7 8 - 2 1 8 6 . 6 龚润龙. 金华火腿加工技术 M . 北京: 科学普及出版社, 1 9 8 7 . 7 赵改名. 肌肉蛋白水解酶在金华火腿加工过程中的作用 D . 南京: 南 京农业大学, 2 0 0 4 . 8 D I R I N C K P , O O S T A E L E F V , V A N D E N D R I E S S C H E F . F l a v o u r d i f f e r e n c e s b e t w e e n n o r t h e r n a n d s o u t h e r n E u r o p e a n c u r e d h a m s J . F o o d C h e m i s t r y , 1 9 9 7 , 5 9 : 5 1 1 - 5 2 1 . 9 S A B I O E M C , V I D A L - A R A G O N M J , B E R N A L T E M J , e t a l . V o l a t i l e c o m p o u n d s p r e s e n t i n s i x t y p e s o f d r y - c u r e d h a m f r o m s o u t h E u r o p e a n c o u n t r i e s J . F o o d C h e m i s t r y , 1 9 9 8 , 6 1 : 4 9 3 - 5 0 3 . 1 0 A N T E Q U E R A T , L P E Z - B O T E C J , C R D O B A J J , e t a l . L i p i d o x i d a t i v e c h a n g e s i n t h e p r o c e s s i n g o f I b e r i a n p e g h a m s J . F o o d C h e m i s t r y , 1 9 9 2 , 4 5 : 1 0 5 - 1 1 0 . 1 1 M A R T I N L , C O R D O B A J J , V E N T A N A S J , e t a l . C h a n g e s i n i n t r a - m u s c u l a r l i p i d s d u r i n g r i p e n i n g o f I b e r i a n h a m J . M e a t S c i e n c e , 1 9 9 8 , 4 9 : 1 4 5 - 1 5 3 . 收稿日期 ： 2 0 0 6 - 0 1 - 2 6 * 通讯作者 基金项目：国家高新技术发展计划专项( 2 0 0 1 A A 2 4 8 0 2 1 ) 作者简介：刘燕琼( 1 9 8 2 - ) ，女，硕士研究生，研究方向为功能因子提取、分离与利用。 硫酸化大蒜多糖的制备及其鉴定 刘燕琼，黄雪松 * ( 暨南大学食品科学与工程系， 广东 广州 5 1 0 6 3 2 ) 摘 要：为开发大蒜资源、增加功能性多糖种类，以大蒜为原料，用水提取、过滤、去蛋白、D E A E纤维素 层析、冷冻干燥获得大蒜多糖，S e p h a d e x G 1 0 0 检测其纯度；三氧化硫- 吡啶法对其进行硫酸酯化，产物以硫酸 钡比浊法测定含硫量，红外光谱和核磁共振碳谱分析其硫酸根的取代情况。得到了纯大蒜多糖，其硫酸酯化产物 含硫量为1 8 . 1 9 % ，硫的取代度为2 . 1 9 ，红外光谱和核磁共振碳谱分析结果表明，硫酸基取代主要发生在果糖残基 的C - 3和 C - 5位上。这些结果表明：三氧化硫-吡啶法硫酸酯化大蒜多糖是成功的。 关键词：大蒜( A l l i u m s a t i v u m ) ；大蒜多糖；硫酸化多糖；果聚糖 P r e p a r a t i o n o f S u l f a t e d G a r l i c P o l y s a c c h a r i d e a n d I d e n t i f i c a t i o n b y S p e c t r u m L I U Y a n - q i o n g ，H U A N G X u e - s o n g * ( D e p a r t m e n t o f F o o d S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g , J i n a n U n i v e r s i t y , G u a n g z h o u 5 1 0 6 3 2 , C h i n a ) A b s t r a c t ： O b j e c t i v e : T o i n c r e a s e t h e s p e c i e s o f f u n c t i o n a l p o l y s a c c h a r i d e s a n d e x p l o i t t h e g a r l i c ( A l l i u m s a t i v u m L . ) r e s o u r c e s . M e t h o d s : T h e g a r l i c p o l y s a c c h a r i d e ( G P ) w a s o b t a i n e d b y w a t e r e x t r a c t i o n , D E A E c h r o m a t o g r a p h y a n d s o o n . T h e G P s p u r i t y w a s d e t e c t e d b y t h e S e p h a d e x G 1 0 0 . S u l f a t e d g a r l i c p o l y s a c c h a r i d e w a s g a i n e d b y t h e m e t h o d o f s u l f u r t r i o x i d e p y r i d i n e c o m p l e x . T h e d e g r e e s o f s u l f a t i o n ( D S ) w a s d e t e r m i n e d b y b a r i u m s u l f a t e t u r b i d i m e t r y . T h e m o d e o f s u b s t i t u t i o n w a s a n a l y z e d b y I R a n d 1 3 C N M R s p e c t r u m . R e s u l t s : P u r e g a r l i c p o l y s a c c h a r i d e a n d i t s s u l f a t e d p r o d u c t w e r e o b t a i n e d . T h e s u l f u r c o n t e n t o f s u l f a t e d g a r l i c p o l y s a c c h a r i d e w a s 1 8 . 1 9 % w i t h i t s D S 2 . 1 9 I R a n d 1 3 C N M R s p e c t r u m s h o w e d t h a t t h e s u l f a t e b o u n d t o t h e p o s i t i o n o f C - 3 a n d C - 5 . K e y w o r d s： g a r l i c ( A l l i u m s a t i v u m L . ) ； g a r l i c p o l y s a c c h a r i d e ； s u l f a t e d p o l y s a c c h a r i d e ； f r u c t a n 中图分类号 ： Q 9 4 6 . 3 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 2 - 6 6 3 0 ( 2 0 0 7 ) 0 2 - 0 0 9 1 - 0 4 近年来，对多糖进行硫酸酯化改性的研究十分活 跃。不断的发现了如香菇多糖、壳聚糖、牛膝多糖等 许多多糖的硫酸化衍生物具有多种生物活性，如增强机 体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒，特别是抗艾滋病病毒 ( H I V ) 等。由于它们的毒副作用小，有的已经应用于临 床，显示了其广泛的应用前景和深远意义 1 - 2 。大蒜是 一种重要的药食兼用的资源。其功能性成分大蒜多糖属 于菊糖类的果聚糖 3 ，测定其含有果糖 8 5 % 、葡萄糖 1 4 % 、半乳糖 1 % 3 - 4 。已有多项研究证实大蒜多糖具有 增强免疫力，保护肝损伤，治疗实验性小鼠病毒性心 2007, Vol. 28, No. 02食品科学工艺技术92 肌炎，抗氧化和抗病毒以及作为乳酸菌发酵的碳源等多 种生物活性 5 。但对大蒜多糖的硫酸酯化改性至今未见 有报道。为了使大蒜多糖硫酸化并增加其使用功能，本 文利用三氧化硫 -吡啶法对大蒜多糖进行了硫酸酯化， 旨在获得硫酸化大蒜多糖，从而为大蒜资源的开发利 用，以及开发新品种的保健因子、保健食品或药品等 应用提供依据。 1材料与方法 1 . 1材料 1 . 1 . 1原料 鲜蒜：山东白皮大蒜，广东广州天河石牌农贸 市 场 。 1 . 1 . 2试剂 三氧化硫- 吡啶( 活性三氧化硫4 8 . 8 % 5 0 . 3 % ) B e l - g i u m 公司；明胶( 生化试剂) 、考马斯亮蓝G - 2 5 0 上海 化学试剂采购供应站；苯酚、吡啶、乙酸、氯化钡、 浓盐酸、硫酸钠、三氯乙酸和氢氧化钠均为分析纯。 1 . 1 . 3仪器 F D - 1 冷冻干燥机、多功能食物搅拌器、R E 5 2 - 3 旋 转蒸发仪、W H - 1微型旋涡混合仪、P H S - 3 C型精密 p H 计、J B 5 0 - D 型增力电动搅拌器、S p e c t r u m l a b 5 3 紫外可 见分光光度计、 E q u i n o x 5 5 红外光谱仪和4 0 0 u l t r a s h i e l d 核磁共振波谱仪。 1 . 2方法 1 . 2 . 1大蒜多糖的制备 1 . 2 . 1 . 1大蒜多糖的提取与分离 大蒜洗涤、去皮，用 3倍量水煮沸 2 0 m i n ，破碎、 打浆，压榨取汁，4层砂布过滤。蒜渣再加入 2倍水 煮沸并压榨过滤取汁。2 次滤液合并，3 5 0 0 r / m i n 离心。 取上清液于 6 0 下浓缩至可溶性固形物浓度为 1 0 % ， S a v a g法除蛋白 6 ，上 D E A E纤维素树脂柱进行层析， 以蒸馏水洗脱，洗脱液分别用考马斯亮兰 G - 2 5 0 和5 % 苯 酚 -硫酸试剂检测蛋白质和多糖。将含有大蒜多糖产品 的部分合并，经冷冻干燥得到大蒜中性多糖。 1 . 2 . 1 . 2纯度检查 将 S e p h a d e x G 1 0 0 用1 0 倍水浸泡，装柱，用水平 衡，将前述纯化的大蒜多糖样品( 1 0 % ) 加于柱顶，用无 离子水进行洗脱，分管收集，采用苯酚-硫酸法检测流 出液的多糖。 1 . 2 . 2大蒜多糖的硫酸酯化 7 - 8 小烧杯中用2 0 m l 吡啶溶解2 . 5 3 g 三氧化硫- 吡啶， 溶解后再加1 g 大蒜多糖，转移至三颈烧瓶。用1 0 m l 吡 啶洗涤小烧杯，洗涤液一并转移至三颈烧瓶。开动搅 拌机，溶解后，沸水浴反应 1h。反应完全后，加入 5 0 m l 无离子水，冰盐浴下用2 . 5 N 的N a O H 溶液调节p H 7 8 ，过滤，所得溶液于透析袋( 截留分子量为1 2 0 0 0 D a ) 内 先用自来水透析2 d ，再用蒸馏水透析1 2 d ；透析过程 中，每天更换透析液 2 3次；将透析袋内液体浓缩到 适量体积后进行冷冻干燥得硫酸酯化产品。 1 . 2 . 3硫酸化大蒜多糖的鉴定 7 - 8 1 . 2 . 3 . 1硫酸基的定性 红外光谱法：常规溴化钾混合压片法。 1 . 2 . 3 . 2硫的定量( 硫酸钡比浊法) 9 以硫酸钠为标准物，做两个平行组，分别加入 1 % B a C l2- G e l溶液和明胶溶液，均与 3 %三氯乙酸相混合 后，在室温下放置1 5 m i n ，测定在3 6 0 n m处的吸光度， 以含硫的质量为横坐标，两组吸光度之差( A1A2) 为纵 坐标，得标准曲线。 取适量的样品于带刻度的带塞试管中溶解于 5 m l 1 m o l / L 盐酸中在1 0 0 水解3 h 。水解完全后过滤，取1 m l 按标准曲线操作方法测定( A1A2) ，根据回归曲线计算 出硫的含量( % S ) 。 样品取代度的计算： D S = 1 . 6 2 % S / ( 3 21 . 0 2 % S ) 式中，DS表示取代度；%S表示含硫量。 1 . 2 . 3 . 3碳1 3 核磁共振谱( 1 3C N M R ) 的测定 1 0 硫酸化大蒜多糖溶于D2H ， 4 0 0 u l t r a s h i e l d 核磁共振 波谱仪测定，TMS内标。 2结果与分析 2 . 1大蒜多糖的纯度 1 0 . 8 0 . 6 0 . 4 0 . 2 0 1 3 5 7 9 1 1 1 3 1 5 1 7 1 9 2 1 A 管数 图1 大蒜多糖的纯度鉴定(Sephadex G100 柱层析) Fig.1 The identification of purity of garlic polysaccharide (Sepadex G100 column chromatography) 大蒜中性多糖的得率为1 1 . 2 5 % 。 纯化的大蒜多糖流经 S e p h a d e x G 1 0 0 柱后，用蒸馏 水洗脱的流出曲线见图 1 。图 1洗脱峰单一对称，显示 样品为均一多糖，即大蒜多糖已被纯化。所得多糖无 考马斯亮兰反应，表明其无蛋白质杂质。 2 . 2大蒜多糖和硫酸化大蒜多糖的红外光谱( 图2 ) 93工艺技术食品科学2007, Vol. 28, No. 02 硫酸酯化前后的大蒜多糖，在吸收波形、波数、 吸收峰强度、峰宽等指标上十分接近，说明两者的成 分非常相似，硫酸酯化反应后并没有杂质生成。 硫酸化大蒜糖( 图2 中B ) 的红外光谱显示了两个特征 吸收带，一个在 1 2 5 6 . 1 2 c m 1的是由于不对称 S = O 伸缩 振动引起的，另一个在8 1 7 . 3 1 c m 1的是由于对称的C - O - S振动引起。证明了硫酸基已被酯化到大蒜多糖上去。 2 . 3硫酸化大蒜多糖硫酸根的定量 大蒜多糖经沸水浴硫酸酯化 1 h后，反应体系变成 红褐色，在烧杯底部有少量不溶性无机盐生成，冷冻 干燥后得到黄色的产品。硫酸钡比浊法测得其含硫量为 1 8 . 1 9 % ，硫的取代度为2 . 1 9 。 2 . 4大蒜多糖和硫酸化大蒜多糖的1 3C N M R 谱( 图 3 ) 从图 3中 A所示为纯化的大蒜多糖1 3C N M R ，由此 可以看出，其结构特征与文献 1 2 是一致的，属于果聚 糖，其糖苷键的链接方式为- 2 , 1糖苷键。 比较大蒜多糖与硫酸酯化大蒜多糖的1 3C N M R ( 见图3 A 和B ) 可以看出，C5( 8 01 0 68 2 1 0 6) 、C 3( 7 61 0 67 8 1 0 6) 的化学位移峰强度大量减少，说明其均被硫酸 化，C4( 7 61 0 67 8 1 0 6) 、C 6( 6 01 0 6) 化学位移峰 强度亦有减少，但硫酸化程度相对要低。另外，硫酸 化大蒜多糖在C2( 1 0 31 0 61 0 5 1 0 6) 、C 1( 6 01 0 6左 右) 的位移也有减少，可能是- 2 , 1 果糖糖苷键发生有一 定程度水解所致。但考虑到大蒜多糖硫酸化的后期处理 过程中使用了截留分子量为 1 2 0 0 0的透析袋进行处理， 可见硫酸化大蒜多糖并未完全水解。 因此，综合考虑 13C N M R ，硫酸根的取代度、红 外光谱等多方面的资料，可以得出结论，采用三氧化 硫 -吡啶法对大蒜多糖硫酸化是相当成功的。其最优化 的工艺参数，产品的生物活性及其在食品与保健食品等 方面的应用工作有待进一步研究。 1 0 4 . 3 4 7 1 0 3 . 7 8 9 1 0 3 . 6 3 0 1 0 2 . 6 3 0 6 0 . 7 2 9 6 0 . 8 9 9 6 8 . 6 0 5 7 4 . 3 2 9 7 6 . 0 5 5 7 7 . 7 2 1 7 9 . 3 7 5 8 1 . 2 1 3 6 8 . 0 8 7 2 0 . 3 2 0 2 0 0 1 8 0 1 6 0 1 4 0 1 2 0 1 0 08 06 0 4 02 0 1 0 6 B 3结 论 从新鲜大蒜中用水提取、过滤、去蛋白、DEAE 纤维素层析、冷冻干燥获得了纯大蒜多糖，三氧化硫 - 吡啶法对其进行硫酸酯化，得到了硫酸化产物含硫量为 1 8 . 1 9 % ，硫的取代度为2 . 1 9 ，红外光谱和核磁共振碳谱 分析结果表明，硫酸基取代主要发生在果糖残基的 C - 3 和 C - 5位上。 参考文献： 1 方积年. 硫酸化多糖的研究进展 J . 中国药学杂志, 1 9 9 3 , 2 8 : 3 9 3 - 3 9 5 . 2 何智健, 陈建伟, 李祥. 多糖的硫酸酯化研究探要 J . 中医药学刊, 2 0 0 3 , 2 1 ( 1 2 ) : 2 0 8 7 - 2 0 8 8 . 3 黄雪松. 大蒜多糖的提取分离与分析 J . 食品科学, 2 0 0 5 , 2 5 ( 9 ) : 4 8 - 5 1 . 4 黄雪松, 欧仕益, 唐书泽, 等. 联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法: 中国, C N 1 5 5 6 1 0 2 P . 2 0 0 4 - 1 2 - 2 2 . 5 王文玲, 黄雪松, 曾莉莎. 大蒜多糖的研究综述 J . 广州食品工业科 技, 2 0 0 4 , 2 0 ( 4 ) : 1 4 0 - 1 4 6 . 6 魏经建, 邵树军, 王天元. 硫酸酯化多糖化学及临床应用研究进展 J . 中国生化药物杂志, 1 9 9 9 , 2 0 ( 5 ) : 2 6 0 - 2 6 2 . 7 张雅君, 梁忠岩, 赵伟, 等. 党参水溶性多糖的分离、 纯化及组成 分析 J . 中国药学杂志, 2 0 0 5 , 4 0 ( 1 4 ) : 1 1 0 7 - 1 1 0 9 . 8 史宝军, 许正宏, 敖宗华, 等. 硫酸酯化灰树花多糖的制备与分析 J . 无锡轻工大学学报, 2 0 0 3 , 2 2 ( 2 ) : 7 5 - 7 8 . 9 中国科学院上海有机化学研究所. 果聚糖硫酸酯合成方法及其应用: 中国, 9 9 1 1 3 4 4 4 P . 1 9 9 9 - 0 1 - 2 9 . A . 大蒜多糖；B . 硫酸化大蒜多糖。 图3 大蒜多糖和硫酸化大蒜多糖的13CNMR Fig.3 13CNMRs of garlic polysaccharide and sulfated garlic polysaccharide 1 . 2 1 . 0 0 . 8 0 . 6 0 . 4 0 . 2 0 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 A 透过率( % ) 波数( c m 1) B A . 未硫酸化的大蒜多糖的红外光谱；B . 硫酸化大蒜糖的红外光谱。 图2 大蒜多糖和硫酸化大蒜多糖的红外光谱比较 Fig.2 The infrared ray spectrums of garlic polysaccharide and sulfated garlic polysaccharide 8 1 7 . 3 1 1 2 5 6 . 1 2 C2C5C3C4C1+ C6 1 0 51 0 09 5 9 0 8 5 8 0 7 5 7 0 6 5 8 1 . 8 6 9 1 0 6 7 9 . 7 6 5 7 7 . 1 9 1 7 6 . 3 3 3 7 4 . 4 8 8 6 1 . 4 2 6 6 0 . 7 7 8 1 0 4 . 0 4 4 1 0 3 . 9 1 4 1 0 3 . 0 2 4 A 6 2 . 0 7 9 2007, Vol. 28, No. 02食品科学工艺技术94 玉米交联微孔淀粉制备工艺的研究 徐 忠，刘明丽 ( 哈尔滨商业大学食品工程学院， 黑龙江 哈尔滨 1 5 0 0 7 6 ) 摘 要：研究了制备玉米交联微孔淀粉的工艺条件，以交联微孔淀粉的吸水、吸油率作为考察指标，通过单因 素和正交试验，考察温度、时间、酶用量、酶配比、淀粉乳浓度、pH值对交联微孔淀粉吸水、吸油率的影 响，结果确定最佳酶解工艺条件为：温度 5 0 ，时间 2 4 h ，酶量 2 . 3 % ，淀粉乳浓度1 8 % ，p H值 5 . 0 ，酶配比 1 : 8 ，所得交联微孔淀粉的吸水、吸油率分别为1 6 3 . 2 1 % 、1 3 4 . 2 0 % 。 关键词：交联微孔淀粉；吸水率；吸油率 S t u d y o n P r e p a r a t i o n o f C r o s s l i n k e d P o r o u s C o r n s t a r c h X U Z h o n g ，L I U M i n g - l i ( C o l l e g e o f F o o d E n g i n e e r i n g , H a r b i n U n i v e r s i t y o f C o m m e r c e , H a r b i n 1 5 0 0 7 6 , C h i n a ) A b s t r a c t ： T h e p r e p a r a t i o n o f c r o s s l i n k e d p o r o u s c o r n s t a r c h w a s s t u d i e d a n d w a t e r a d s o r p t i o n a n d o i l a d s o r p t i o n w e r e i n v e s t i g a t e d . S o m e f a c t o r s , s u c h a s r e a c t i o n t e m p e r a t u r e , r e a c t i o n t i m e , e n z y m e a d d i t i o n , e n z y m e c o m b i n a t i o n , b u t t o m s u b - s t a n c e c o n c e r t r a t i o n a n d r e a c t i o n p H w e r e s t u d i e d a s t h e m a i n f a c t o r s f o r w a t e r a d s o r p t i o n a n d o i l a d s o r p t i o n c a p a c i t y . T h e s i n g l e e l e m e n t a n d o r t h o g o n a l t e s t s h o w e d t h e o p t i m u m e n z y m e r e a c t i o n c o n d i t i o n a r e a s f o l l o w s : r e a c t i o n t e m p e r a t u r e 5 0 , r e a c t i o n t i m e 2 4 h , e n z y m e a d d i t i o n 2 . 3 % , b u t t o m s u b s t a n c e c o n c e r t r a t i o n 1 8 % , p H 5 . 0 a n d e n z y m e c o m b i n a t i o n 1 : 8 . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e c a p a c i t y o f w a t e r a d s o r p t i o n i s 1 6 3 . 2 1 % , a n d t h e c a p a c i t y o f o i l a d s o r p t i o n i s 1 3 4 . 2 0 % . K e y w o r d s： c r o s s l i n k e d p o r o u s c o r n s t a r c h ； c a p a c i t y o f w a t e r a d s o r p t i o n； c a p a c i t y o f o i l a d s o r p t i o n 中图分类号 ： T S 2 3 5 . 1 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 2 - 6 6 3 0 ( 2 0 0 7 ) 0 2 - 0 0 9 4