米曲霉多蛋白酶代谢动力学初步研究.pdf

第 9卷第 1 期 2 0 0 9 年 2月 中 国 食 品 学 报 J o u rna l o f C h i n e s e I n s t i t u t e of F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y Vo I _ 9 No 1 F e b2 0 0 9 米 曲霉多蛋 白酶代谢动力学初步研究 杨远帆 倪 辉 胡 阳 黄高凌 肖安风 李利君 黄志勇 蔡慧农 ( 集 美大学生物工程学院 厦门 3 6 1 0 2 1 ) 摘要 目的： 利用米曲霉能分泌 多种蛋 白酶的特性 。 研究该茵培 养液水解鱼粉的动力学。方法： 采用 F o l i n法测 定不 同时间培养液的蛋 白酶活力，甲醛滴定法测定不 同时间培 养液 的氨基 态氮，S D S P A G E凝胶 电泳测定水 解产物的大小及培养液中产物的相 对分子质量。 结果 ： 米 曲霉在 以鱼蛋 白为唯 一氮源的培养基 中能够产生多种 蛋 白酶， 且随时间和底物的不同， 蛋白酶的活力与种类都不同。结论 ： 米 曲霉是一种产 多种蛋白酶 的菌种。 关键词 米曲霉 蛋白酶 动力学 鱼蛋 白 文章 编 号1 0 0 9 7 8 4 8 ( 2 0 0 9) 0 1 0 0 4 6 0 6 近 年来 用蛋 白酶处 理低值 蛋 白， 生 产具有 新 功能特性的肽 ， 提高低值蛋白的附加值 ， 成为低值 蛋 白质开发利用的一个新热点 】 1 。但是 ， 用商品蛋 白酶水解 低值 蛋 白存在 水解不 彻底 、原 料利 用不 完全、 产物得率低等问题。 其主要原因是现有的商 品蛋 白酶多 为单一 品种 的 内切蛋 白酶 ，一般 只有 少数几个 酶切 位点 ， 故 水解得率 低圆 。如果用 几种 商品蛋 白酶分段水解低值蛋 白质 ， 不仅工艺复杂 、 成本 高 ，而且 由于试验 人员 对不 同蛋 白酶 的特点 了解不 透彻 ， 选择 蛋 白酶 的随意性 强 ， 各 蛋 白酶作 用位点 之 间的互补 性差 也很 难得 到理 想 的结果 。 相对 于商 品蛋 白酶 ，新 鲜 的微生 物培 养物 中可 能 含有 多 种蛋 白酶 f3 1 ， 这 些蛋 白酶来 源 相 同 ， 相 互 之 间 的协调性 好 ，可从 某一蛋 白酶 生产 菌株 的新 鲜 培养物中开发出一种新型的复合蛋白酶I 4 1 。 将这种 复合蛋白酶用于低值蛋白的水解 ，有可能提高水 解得率 。 降低生产成本。 米 曲霉 ( A s p e r g i l l u s o r y z a e ) 是 美 国 食 品 与 药 物 管理 局 和美 国饲 料公 司协 会 于 1 9 8 9年公 布 的 4 O余种安全微生物菌种之一 ， 在食品和饲料工业 中有着广泛的应用嘲 。 米曲霉是常用的生产菌株的 蛋 白酶之一同 ， 具 有分 泌多种 蛋 白酶 的作 用 7 1 ， 可 用 收 搞 日期 ：2 0 0 8 0 2 2 8 基 金 项 目 ：福 建 省 资 助省 属 高 校项 目( No 2 0 0 7 F 5 0 7 5 ) 作者简介：倪辉 ， 男 ， 1 9 7 3年 出生 ， 副教授 通讯作者：蔡慧农 来 开发 具有新 型 功能特 性 的复合 蛋 白酶 。本文 以 低 值 鱼蛋 白为原 料 ， 液 态培 养 米 曲霉 8 】 ， 研 究 米 曲 霉 的蛋 白酶分 泌规 律及 是否 产生 具有 不 同功能特 性 的蛋 白酶 ，为 利用米 曲霉 生产 新 型蛋 白酶提供 参 考 。 1 材料与方法 1 1 试 验材 料 1 1 1 菌种米 曲霉 ：由集 美大 学生 物工 程学 院 发 酵实 验室提 供 。 1 1 2主要试 剂碱性 蛋 白酶 、 复合 蛋 白酶 ， 诺 维 信公 司 ； S D S 、 T r i s 、 T r i c i n e 、过 硫 酸 铵 、 T E ME D、 溴 酚兰 、 丙烯 酰胺 、 双丙 烯酰 胺 、 巯 基 乙醇 、 考 马斯亮 兰 R 一 2 5 0 生 工 生 物工 程 有 限公 司 ； 甲醛 ， 广东 汕 头市 西陇化工 厂 。 除 S D S为化学 纯外 ， 其它均 为分 析纯试 剂 。 1 1 3 培 养 基孢 子培 养 基 ： 麸皮 5 0 、 水 5 0 ， 灭菌后使用 。 液体培养基 ： 鱼粉 ( 鳕鱼粉 、 罗非 鱼粉 、 鲢鱼 粉 ) 6 g L 、 可溶性 淀粉 1 g L 、 牛 肉膏 0 1 g L 、 N a C 1 5 g L 、 葡萄糖 0 5 g L 。 1 _ 2仪器 B i o P R O F I L E凝 胶成像 系统 ，法 国 V i l b e r L o u r m a t ： D Y C Z 一 2 4 D双垂直电泳槽 ，北京六一仪 器 厂 ： 7 2 0 0紫 外一 可见 分 光光 度计 ， 上海 第 三分 析 仪 器 厂 ： T G L 一 1 6 G型 高速 离心 机 ，上海 安 亨科 学 仪器厂 ： P H S 一 2 C精密酸度计 ， 上海雷磁仪器厂。 第9 卷 第 1 期 米曲霉多蛋白酶代谢动力学初步研 究 4 7 1 。 3试 验方 法 1 3 1 蛋 白酶 活 力 的测 定 采 用 F o l i n 一 酚 试 剂 法9 1 。 在 5 0 o C 、 p H 7 5条件下， 水解酪蛋白每分钟产 生 1 g酪氨酸为 1 个酶活力单位 ， 酶活力计算公 式 ： = ( A- A 0 ) x Kx N x V t ( 1 ) 式 中 ： 酶 活 力 ( U mL ) ； A 样 品液 光 吸收 值 ； A 厂对 照液 光 吸 收值 ； K 标 准 曲线 上 光 吸收 为 l时 的 酪 氨 酸 质 量 ( g ) ； _样 品 液的稀释倍数 ； 酶促反应管的总体积( mL ) ， 本试 验 V = 6 m L ； 卜酶 促 反 应 时 间 ( rai n ) ， 本试 验 t = l Omi n 。 1 3 2 酶解产物及培养液中产物相对分子质量的 测定采 用 S D S P A G E凝胶 电泳法 1 0 - 1 1】 测定 。 1 3 3 样 品的制备酶解 后 的样 品制 备 ： 取 2m L 0 5 酪蛋 白溶液 于 1 0 mL离 心管 中 ， 在 5 0水 浴 中预热 5 m i n ， 加入 预 热 的培 养液 ( 粗 酶 液 ) l m L ， 5 0反应 1 0 m i n ， 离心 ， 取上清液 6 0 L， 与缓冲 液 1 ： l 混匀 ， 1 0 0 o C 加热 3 5 m i n ，冷却后冷冻保 藏 ， 同时制备对 照液。 培养液 的样 品制 备 ： 将 培养液 离心 ， 取 上清 液 6 0 L ，与上 样 缓 冲 液 1 ： l混 匀 ， 1 0 0加 热 3 5 ra i n ， 冷却后冷冻保藏 ， 同时制备对照液。 1 _ 3 4 培养液 中氨基 态氮 的测 定 采用 甲醛滴 定 法 3 1 测定氨基酸态氦含量， 计算公式： = ( V 1 一 2 ) x C x l 4 O 0 8 V 3 ( 2 ) 式 中 ： 样 品 中氨 基 氮 的 含 量 ( g m L ) ； 样 品加 入 甲醛稀 释后 消耗 N a O H标 准溶 液 的体积( mL ) ； V 厂试剂空白加入甲醛稀释后消耗 N a O H标准溶液的体积( m L ) ； V 厂_ 羊 品体积( mL ) ； C N a O H 标准 溶 液浓 度 ( m o l L ) ； 1 4 0 0 8 氮 的摩尔质量 ( g m o 1 ) 。 1 3 5 培养液 中总氮 的测定 采 用微量 凯 氏定氮 法测定总氮 含量 ， 计算公 式 ： = 一B) x Nx l 4 0 0 8 x V1 V 2 ( 3 ) 式 中： 每毫升样品的含氮量( g m L ) ； 滴定样品所消耗盐酸体积( mL ) ； B 滴定 空白所消耗盐酸体积( mL ) ； 盐酸浓度( m o l m L ) ； V 。 消化 并 定 容后 的溶 液含 l m L样 品 的 体积 ( m L ) ； 广消化并定容后的溶液测定用的 体积( m L ) ； 1 4 0 0 8 氮的摩尔质量( g too 1 ) 。 2结果与讨论 2 。 1 米 曲霉分解 鳕鱼粉 的蛋 白酶动 力学 以鳕鱼粉为米曲霉生长的唯一氮源， 于 2 8、 1 6 0 r ra i n摇床培养。 每 1 2 h取样 1 次。结果显示 ， 米 曲霉分解鳕鱼粉 的蛋白酶活力在 2 6 h和 6 0 h 时有活力峰值 ， 分别为 5 2 g ( m L m i n ) 和 1 5 ( m L ra i n ) ( 见图 1 ) 。 培养液水解酪蛋 白产物在 1 2 h时分布较广 。 米曲霉可能处于分泌蛋白酶阶段 ， 产生多种蛋白酶。不同的蛋白酶水解蛋白质的产 物的相对分子质量不同， 在 2 4h和 3 6h时产物分 子较小 。米曲霉主要分泌将蛋 白质水解成小肽的 蛋 白酶 ； 6 0 9 6 h的产 物 相对 分 子 质量 较 2 4 h和 3 6 h的大 说 明产生 了不 同的蛋 白酶 ( 见 图 2 ) 。水 解 鱼 蛋 白时 产物 相 对 分 子 质 量 较 大且 条 带 较 薄 ( 见 图 3 ) ，可 能是 因为蛋 白质 不 同 ，水解 程 度不 同， 使产物也不相同。 时间 T h 图 1 米 曲霉鳕鱼粉培养液中的蛋 白酶活力随时间变化 图 Fi g 1 Ch a n g e o f t he p r o t e a s e a c t i v i t y i n c o d p o wd e r h y d r o l y s e d b y As p e r g i l l u s o r y z a e o v e r t i me c o u r s e s M 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2 8 4 9 6 图 2米 曲霉鳕鱼粉培养液水解酪蛋白产物电泳图 Fi g 2 El e e t mp h o r e s i s c ha r t o f t h e h y d r o l y s a t e o f c a s ei n h y d ml y s e d b y As p e r g i l l u s o r y z a e i n c o d p o w d e r c u l t u r e b r o t h 加 m O 一 口 - 1 叫) 、 R妲溢皿阿 4 8 中 国 食 品 学 报 2 0 0 9 年第1 期 M l 2 2 4 3 6 48 6 0 7 2 8 4 9 6 图 3米 曲霉鳕 鱼粉培养液中水解产物的电泳图 F i g 3 E l e c t r o p h o r e s i s c h a r t o f t h e h y d r o l y s a t e i n c o d po wd e r c ul t u r e b r o t h o f As pe r gi l l u s o r y z a e 2 2米 曲霉分解 罗非 鱼粉 的蛋 白酶 动力学 以罗非鱼粉为米曲霉生长的唯一氮源 于 2 8 o C、 1 6 0 r m i n摇床培养 ， 每 2 4 h取样 1 次。结果显 示，在第 1 3天时米曲霉蛋白酶活力及培养液中 上清 液 氨基 酸态 氮 随 时间 的增 加 而不 断 升 高 ， 第 3天后略有下降并保持在一个小范围内波动 ( 见 图 4 、 图 5 ) 。其 原 因是罗 非鱼蛋 白处 于不 溶状 态 ， 米曲霉将不溶的蛋 白质变成可溶的蛋白质，然后 将其分解利用 ，这样培养液中氨基酸态氮的浓度 较低。为了保证培养液中有足够的氨基酸态氮满 足生长 ， 米曲霉必须保持充足的蛋 白酶量和活力， 以不断地 分解 罗非鱼蛋 白。 由图 6可知 ， 第 1天时 蛋 白质 开始被 分解 。产 物相对 分子 质量较 小且 分 布较广 ， 此时可 能产 生多 种酶 ； 第 2天产物 相对 分 子 质量变 小 ，且基本 维 持在 同一个 水平 ，即 1 4 4 k D 以下 。图 7中培养 2 d后 出 现条 带 ， 且 相对 分 子质量一直处于同一个水平。结合米曲霉蛋 白酶 活力和培养液 中上清氨基酸态氮的变化 曲线 ， 可 以看 出 ， 此时 主要分 泌具 有底物 特异 性 的蛋 白酶 ， 该酶的分解产物更利于吸收利用 。 满足生长需要。 综上所述 ， 在分解罗非鱼粉液态培养过程中， 起始阶段米曲霉分泌多种蛋白酶，之后受底物的 影响， 主要分泌具有底物特异性的蛋 白酶。 在整个 培养 过程 中 鱼 粉不 断溶解 。 米 曲霉分 泌蛋 白酶来 分解 、 吸收利 用它们 ， 处 于一个 动态平衡 状态 。 量 手 望 赡 溢 皿 图 4米 曲霉 罗非 鱼 粉培 养液 中蛋 白酶 活 力 随 时 间变 化 图 F i g 4 Ch a n g e o f t h e p r o t e a s e a c t i v i t y i n J a v a t i l a p i a p o w d e r h y d r o l y s e d b y A s p e r g i l l u s o r y z a e o v e r t i me c o u r s e s 0 l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 时 间 T h 图 5米曲霉罗非鱼粉培 养液上清液氨基态氮含量 随 时 间 变化 图 F i g 5 Cha n g e o f t h e a mi n o n i t r o g e n i n s up e r n a t a n t o f J a v a t i l a p i a p o w d e r c u l t u r e b r o t h b y A s pe l l u s o r y z a e o v e r t i m e -c o ur s e s l l 6 O k D 6 6 - 2 k D 4 5 O k D 3 5 0 k D 2 5 0 k D l 8 4 k D 1 4 4 k D M O 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 图 6米 曲霉 罗 非 鱼粉 培 养 液 中水 解 酪 蛋 白产 物 电 泳 圈 Fi g 6 El e c t r o ph o r e s i s c ha r t o f t h e hy d r o l y s a t e o f c a s e i n i n J a v a t i l a p i a p o w d e r c u l t u r e b r o t h h y d r o l y s e d b y As p e r g i l l u s o r y z a e O O O O O O O O 嘟姐 醐 第 9 卷 第 1 期 米 曲霉 多蛋 白酶代 谢动 力学初步研 究 4 9 1 l 6 6 4 5 3 5 2 5 l 8 1 4 图 7米 曲霉罗非鱼粉培养液中产物电泳图 F i g 7 E l e c t r o p h o r e s i s c h a r t o f h y d r o l y s a t e i n J a v a t i l a p i a p o w d e r c u l t u r e b r o t h w i t h A s po r y z a e 2 3米 曲霉分解鲢 鱼粉的蛋 白酶动 力学 以鲢鱼粉为米 曲霉生长的唯一氮源 ，于 2 8 、 1 6 0 r m i n摇床培养 ， 每 2 4 h取样 1 次至 1 6 d ， 测定结 果分别如 图 8 一 图 1 1 所示 。 由图 8 图 1 1可 知 ，以鲢 鱼粉 为唯一 氮源培 养米 曲霉 ，蛋 白酶活 力 、培养液 中上清液 氨基酸 态氮 和在培养 过程 中 水解 产物 、培养 液 中蛋 白质及 肽类 物质 的相对分 子质量与用罗非鱼粉为氮源的结果相似。综合分 析 ， 在米曲霉的培养过程中， 鱼粉是米曲霉分泌的 蛋 白酶的作用底 物 ，蛋 白质 的分解产 物又 是米 曲 霉生 长的唯一 氮源 ：鱼粉 中的蛋 白质和肽 一直处 鲁 昌 望 蜒 髓 正 跚 于不断分解和被吸收的状态 ；米曲霉则根据培养 液中蛋白质的存在状态不断地调控其所分泌的蛋 白酶种类及含量 ，使之能高效地将蛋 白质水解为 可 吸收 利 用 的小 分 子 含 氮 物 ( 3肽 、 2肽 或 氨 基 酸) 。培养起始阶段 ， 蛋 白质诱导米曲霉分泌蛋白 酶 ， 分解 出大量 的可利 用 的小 肽或 氨基酸 ； 当这些 肽及氨基酸被吸收完以后 ， 由于生长的需要 ， 米曲 霉会诱导其他的蛋白酶 ，使剩余的底物特异地水 解 。 因而 ， 在培 养过程 中 ， 蛋 白酶 的种类及 含量是 不断 变化 的。 6 时间 T h 图 8米曲霉鲢鱼粉培养液中的蛋 白酶活力随时间变化圈 F i g 8 C h a n g e o f the p r o t e a s e a c t i v i t y i n s h y e r s e e d p o wd e r h y d r o l y s e d b y As p e r g i l l u s o r y z a e o v e r t i me c o u r s e s 5 4 3 2l O 9 8 76 5 4 32lO1 lllll O OOOOO O O 0 O 5 0 中 国 食 品 学 报 2 0 0 9 年第1 期 l 1 6 0 k D 6 6 2 k D 4 5 Ok D 3 5 O k D 2 5 O k D l 8 4 k D 1 4 4 k D l l 6 O k D 6 6 2 kD 4 5 Ok D 3 5 Ok D 2 5 Ok D l 8 4k D 1 4 4 k D 吕 删 缸 ：回 】 脯 时 间 T d 图 9米曲霉鲢鱼粉培养液上清液氨基态氮含量随时间变化图 F i g 9 Cha n g e o f t he a mi n o n i t r o g en c o nt e n t i n s u pe r na t a nt o f s i l v e r s e e d p o wde r c u l t u r e b r o t h by As po r y z a e o v e r t he t i me c o u r s e s M O l 2 3 4 5 6 7 M 8 9 1 0 l 1 l 2 1 3 1 4 1 5 图 1 0米 曲 霉鲢 鱼 粉 培 养 液水 解 酪 蛋 白产 物 电泳 图 Fi g 1 0 El e c t r o ph o r e s i s c ha r t o f t h e hy d r o l y s a t e o f c a s e i n i n s i l v e r s e e d p o wd e r c ul t u r e b r o t h h y d r o l y s e d b y A s p o r y z a e M 0 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 图 1 1 米 曲霉鲢鱼粉培养液 中产物电泳 图 F i g 1 1 T h e e l e c t r o p h o r e t i c c h a r t o f h y d r o l y s a t e i n s i l v e r s e e d p o wd e r c u l t u r e b rot h h y d ml y s e d b y A s p o r y z a e 第9 卷 第 1 期 米曲霉 多蛋 白酶代谢动 力 学初 步研 究 5 1 3 结论 ( 1 ) 米 曲霉是 一种产 多种蛋 白酶 的菌种 。 ( 2 ) 米 曲霉 产生 的蛋 白酶 的种 类及 酶 量 随培 养时 间的不 同而 不 同。 ( 3 ) 以不同的蛋 白质为氮源培养米曲霉， 其蛋 白酶的特性、 种类及其随时间的变化规律不同。 参考 文献 1 崔霞， 周艳明， 牛森， 等 酶法水解苦荞蛋 白制备可溶性生物活性肽最佳条件的研究棚 粮食与食品工业 ， 2 0 0 6 ， ( 1 ) ： 3 9 41 2 王娟丽， 王以强 ， 李奠础 ， 等 微生物生产弹性蛋 白酶现状研究f J 1 山西化工 ， 2 0 0 5 ， ( 1 1 ) ： 3 4 - 3 5 3 张桂欣米曲霉的分离I J 1中国调味品 ，1 9 9 9 ， ( 1 1 ) ： 2 4 2 5 4 赵龙飞， 徐亚军 米曲霉 的应用研究进展 J 】 C h i n a B r e w i n g ，2 0 0 6 ， ( 3 ) ： 8 - 1 0 5 邓靖 ， 林亲录， 赵谋 明， 等 米 曲霉 M 3产蛋白酶特性研究f J 1 中国调味品， 2 0 0 5 ， ( 1 ) ： 1 6 2 0 6 邓靖 ， 林亲录， 赵谋 明， 等 米 曲霉 M3中性蛋白酶的提取及酶学特性研究 J 1 中国食品添加剂 ， 2 0 0 5 ， ( 2 ) ： 2 1 2 4 7 王淑豪 ， 宋正孝 ， 马忠海 ， 等 米啦霉 3 0 4 2的液体培养特性及其产氨基酰化酶的特性研究【 J 】 食品科学 ， 2 0 0 0 ， ( 7 ) ： 9 1 2 8 郭杰炎 ， 蔡武城微生物酶 M I 北京 ： 科学出版社 ， 1 9 8 6 9 1 2 ， 1 0 5 1 3 7 9 沈萍 ， 范秀容， 李广武 ， 等 微生物学实验【 M】 北京： 高等教育出版社 ， 2 0 0 3 4 4 4 6 1 0 Va z q u e z J A ， G o n z a l e z M P， Mu r a d o MAP e p t o n e f r o m a n t o h y d rol y s e d fi s h v i s c e r a f o r n i s i n a n d p e d i o c i n p r o d u c t i o n J 1 E 1 S e v i e r ，Ams t e r d a m，Ne t h e r l a n d s ， 2 0 0 4， 1 1 2 ( 9) ： 2 9 9 3 1 1 1 1 胡稳奇 ， 张志光米曲霉 A 一 9 0 0 5产生酸性蛋 白酶的适宜条件f J 1 湖南师范大学 自然科学学报 ， 1 9 9 4 ， 1 7 ( 2 ) ： 6 9 7 2 1 2 集美大学生化组 生物化学实验【 M 1 厦门： 集美大学生物工程学 院， 2 0 0 1 6 O 一 6 1 1 3 余冰宾 ， 段明星， 等生物化学试验指导【 M】 北京： 清华大学出版社 ， 2 0 0 4 1 3 6 1 3 8 ， 1 5 1 1 5 6 1 4 汪家政 ， 范明 ， 等 蛋 白质技术手册 MI 北京 ： 科学出版社 ， 2 0 0 0 7 7 1 0 0 P r i ma r y S t u d y o n t h e M e t a b o l i c Ki n e t i c s o f M u l t i - p r o t e i n a s e i n As p e r g i l l u s Or y z a e Y a n g Y u a n f a n N i H u i H u Y a n g H u a n g G a o l i n g X i a o A n f e n g L i L i j U B H u a n g Z h i y o n g C a i H u i n o n g ( B i o e n g i n e e r i n g o f J i m e i U n i v e r s i t y ，X i a m e n 3 6 1 0 2 1 ) Ab s t r a c t A s p e r g i l l u s o o z a e i s a k i n d o f g o o d s p i r i t f u n g i T h e me t a b o l i c k i n e t i c s o f Mu l t i - e n z y me o f A s p e r g i l l u s o r y z a e b a t c h c u l t u r e d w i t h fi s h p r o t e i n a s n i t rog e n s o u r c e wa s s t u d i e d i n t h i s p a p e r I n t h e s t u d i e s ， F o l i n me t h o d w a s a d o p t e d t o me a s u r e e n z y me a c t i v i t y ， f o