辅酶Q10前体脂质体的研制及其特性研究.pdf

讲 究 探 i 寸 F o 129， N o 01， 2 008 祝青哲 ， 夏书芹 ， 许时婴 ( 江南大学食品学院，江苏无锡 2 1 4 1 2 2 ) 摘要 ： 为提 高辅酶 Q 脂质体 的稳定性 ， 采用冷冻干燥法制备辅酶 Q 前体脂 质体。选择 蔗糖 、 海 藻糖 、 甘露 醇、 乳糖 等作冻干保护剂 ， 研 究复水前后辅酶 Q 。 脂质体 的形 态、 粒径分布和 包封 率 ， 并研 究 了辅酶 Q。 。 前体脂质 体红外光谱 性 质 ， 比较冷冻干燥保护剂种类及用量对辅酶 Q 。 脂质体的保护作 用。优 选保护 剂为海藻糖 ， 与卵磷脂质 量比为 4 ： l ， 辅 酶 Q 前体脂质体水合重建后平均粒径为5 0 8 n m， 包封率达 7 5 。红外光谱分析表明海藻糖与磷脂 P= 0基团之间形 成氢键作用最强 关键词 ： 辅酶 Q ， 前体脂质体 ， 冷 冻干燥 法， 冷冻保 护剂 ， 红外光谱 St u d y o n p r e p a r a t io n a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f c o e n z y me Q1 0 p r o l i p o s ome s ZHU Qi n g z h e XI A S h u- q i n XU S h i y i n g ( S c h o o l o t F o o d S e i e n e e a n d T e c h n o l o g y， J i a n g n a n U n i v e r s i t y， Wu x i 2 1 4 1 2 2， C h i n a ) Ab s t r a c t ：T o e n h a n c e t h e s t a bil i t y o f c o e n z y me Q1 0 l i p o s o me s， f r e e z ed r y i n g me t h o d wa s u s e d t o p r e p a r e c o e n z y me Qff l p r o li p o s ome s Su c r o s e ，t r e h a lo s e， ma n n i t o l a n d l a c t o s e we r e s e l e c t e d a s c r y o pr o t e c t a n t T h e p a r t i c le mo r ph o l o g y， t h e s iz e r a n g e a n d e n c a ps u l a t i o n e f f i c i e n c y o f c o e n z y me Ql 0 l i p o s o me s be f o r e f r e e z e d r yin g a n d a f t e r h y dr a t e d we r e s t u di e dT h e we i g h t r a t io s o f t h e o p t i miz e d f o r mu la t ion we r e t r e h a l o s e ： e gg l e c it h i n=4： 1 Af t e r c o e n z y me Q】 0 p r o l i p o s o me s wa s h y d r a t e d， t h e a v e r a g e d i a me t e r o f r e h y d r a t i o n li p o s o me s wa s 5 0 8 n m， a n d t h e e n c a p s u l a t i o n e f f i c i e n c y wa s ab o u t 7 5 T h e a n a l y s i s o f F T I R s p e c t r u m s h o we d t h a t t h e h y d r og e n b o n d b e t we e n t r e h a l o s e a n d l i pid h e a dg r ou p s f o r m e d i n t h e d r y s t a t e K e y wo r d s： Co Q1 o ；p r o l i p o s o me s；f r e e z e d r y i n g；c r y o p r o t e c t a n t ；F T I R 中图分类号 ： T S 2 0 I 2 5 文献标识码 ： A 文 章 编 号 ： 1 0 0 2 0 3 0 6 ( 2 0 0 8 ) 0 1 0 1 l 3 - 0 4 辅 酶 Q 。 ( C o Q 。 ) 是 天 然 抗 氧 化 剂 和 细 胞 代 激 活剂 。美 国 F DA 早征 8 0年 代 已批 准辅 酶 Q 。 可 作 为膳食 补 充齐 Ij 。采 用脂 质体 包埋 的辅 酶 Q 。 具 l有 很 好 的水溶 性 ， 更 利 于 人 体 吸收 ， 存 保 健 食 品领 域 也 将 有 广 阔 的 应 用 前 景 。 普 通 脂 质 体 以 液 体 形 式 存 在 存 过 程 巾 易 发 牛 聚 集 沉 降 、 磷 脂 氧 化 分 解 、 包 封 物 渗 漏 等 问 题 ， 导 致 脂 质 体 不 稳 定 。 前 体 脂 质 体 由 P a y n e等 首次 提 出 ， 将 构 成 脂 质 休 的 膜 材 、 药 物 及 l殳撑 剂 用 适 当 方 制 成 颗 粒 状 、 冻 于 状 等 一 r 燥 形 式 ， 用 前 加 水 水 化 后 即 可 形 成 脂 质 体 。 1 9 7 8 年 V a n l e b e r g h e等 首次 报道 采用 冷 冻 f ： 燥 法 提 高脂 质 体 的 贮 存 稳 定 性 。 目 前 ， 该 法 已 成 为 较 有 前 途 的 改 善 脂 质 体 制 剂 长 期 稳 定 性 的 方 法 之 一 一 。 文 采 用 冷 冻 干燥 法研 制辅 酶 Q 川前 体脂 质 体 ， 选 择 合适 的保 护 剂 以 提 高 其 复 水 稳 定 性 ， 并 研 究 有 关 性 质 ， 探 讨 保 护 剂 对脂 质体 的作 用机 制 。 收稿 日期 ： 2 0 0 7 0 9 0 3 通讯联 系人 作者简介： 祝 青哲( 】 9 8 3 一 ) ， 女， 在读硕 士研 究生 ， 研究方 向： 功 能性食 品 配料与添加剂 。 基金项目： 8 6 3计划重点项 目( 2 0 0 7 A A 1 0 0 4 0 3 ) 。 1 材料 与方法 1 1 材料与设备 辅 酶 Q 9 8 0 1 01 0 ， 日清制 药 ； 蛋 黄 磷 脂 ( EP C) 生 化 试 剂 ， 华 东 ! J I lj 范 大 学 化 J 二 厂 ； 吐 温 8 0 ( T w e e n 8 0) 化 学 纯 ， 围 药 ( 集 团 ) 上 海 化 学 试 剂 公 刊 ； 海 藻 糖 ( t r e h a l o s e ， T r e) 食 品 级 ， 日本 林 原 株 氏 会 社 ； 乳 糖分 析 纯 一 海 恒 信 化 学 试 剂 有 限 公 司 ； 胆 固 醇 ( C h o 1 )、 蔗 糖 、 目 露 醇 、 葡 萄 糖 、 I l I 梨 醇 等均 为 分 析 纯 ， 【蒌 I 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 。 u Vl l 0 0型紫外 一可 见 分 光 光 度计 北 京 瑞 利 分 析 仪 器 公司 ；V CX 5 0 型 超 声 处 理 器 美 国 S ON I C S &MA T ER I AL S公 司 ；F r e e Z o n e 6 升 立 式 冻 下 机L a b c o n e o公 司 ； Na n o Z S 9 0 型 粒 径 分 析 仪英 国 Ma l v e r n公 司 ； Ne x u s傅 叶 红 外 光 谱 仪 美 国 Ni c o l e t 公 司 ； C S P M4 0 0 0扫 描 探 针 显 微 镜广 州 本 原 纳 米 仪 器 有 限 公 司 。 1 2 实 验方 法 1 2 1 辅 酶 前 体脂 质体 的制备 1 2 1 1 采用 乙醇注入 一 超声法 制备液态辅酶 Q 脂质 体按 配 方 称 取 磷 脂 、 胆 醇 、 T w e e n 8 0及 辅 酶 Q 比 例 为 E P L ： C o Ql0 ： C h o l ： T w e e n 8 0=2 5 ： 1 2 2 ： 0 4： 1 8 ( g g )， 维普资讯 食品 ， 盐 斜妓 S c o n c e a n d T e c h n o l o g y of F o o d I n d u s t r y E P L的 浓 度 为 1 2 5 ( g mL)， 加 入 2 mL无 水 乙 醇 ， 于 5 5 水 浴 至 溶 ， 用 注 射 器 快 速 将 其 注 入 2 0 mL水 化 介 质 ， 取适 量 保护 剂用 p H7 4， 0 0 1 mo l L磷 酸 缓 冲液 溶解 ， 搅拌 水 化 3 0 mi n， 旋 转 蒸 发 除 去 乙 醇 ( 5 5 o C， 真 空 度 0 1 MP a ) ， 迅 速 冷 却 ， 冰 浴 超 声 处 理 4 mi n( 脉 冲 1 s 1 s )， 冷 冻 离 心 3 0 mi n( 1 1 0 0 0 X g， 4 ) 后 充 人 N， 密封 ， 置 于 冰箱 冷 藏 保存 。空 白脂 质 体 的制 备 则 称 取等量 脂 质溶 于 乙醇 ， 其余 步 骤 与辅 酶 Q。 。 脂 质 体 的 制 备 相 同 。 1 2 1 2冷 冻干燥 工艺取 1 mL辅 酶 Q。 。 脂 质 体分装 于 安 瓿 瓶 中 ，一7 0 预 冻 2 4 h， 冷 冻 干 燥 (一 3 0 o C 2 0 h，一 1 0o C l O h，一 4 o C 5 h， 2 5 o C 3 h，真 空 度 0 1 MP a )， 压 盖 封 口 ， 即得 辅 酶 Q， 。 前 体 脂 质体 ， 冻 干 后 的 样 品 置 干 燥 器 中 ， 于 室 温 避 光 密 闭 保 存 。 1 2 1 3 复 水 取 1瓶 辅 酶 Q。 。 前 体 脂 质 体 ， 加 入 1 mL去 离 子 水 充 分 混 匀 ， 即得 辅 酶 Q。 。 脂 质 体 。 1 2 2辅 酶 Q 。 脂 质体 包 封 率 的 测 定 辅 酶 Q 含 量 的测 定 ： 采用 T we e n 8 0增 溶 一紫外 分 光 光 度 法 ； 游 离 辅 酶 Q。 。 含 量 的 测 定 ： 采 用 正 戊 烷 洗 涤 一紫 外 分 光 光 度 法 。 ( )= x 1 0 0 1 2 3辅 酶 Q。 脂 质体 粒径 的测 定采用 配有 He Ne 激 光 器 ( 入= 6 3 3 n m) 的 Na n o Z S 9 0粒 径 分 析 仪 ， 散 射 角 为 9 0 。 。将待 测样 品装 入 聚苯 乙烯 比色 l l I 中 ( 折 光 指 数 1 3 3)， 2 50 1 下 保 温 3 mi n， 测 定 ， 记 录 平 均 粒 径 ( D z ) 和粒 径分 布情 况 ( 多分散 指数 P DI ) 。 1 2 4辅酶 Q 。 前 体 脂 质 体傅 里 叶 红外 光 谱 ( F T I R) 分析取 出少许 辅 酶 Q 前 体 脂 质体 样 品 ， 与 干燥 的 KB r 混 合 。研 磨 至 细 粉 状 ， 充 分 混 合 后 置 人 锭 剂 成 型 器 中进 行 压 片 ； 将 压 片 放 人 红 外 光 谱 仪 样 品 槽 中 ， 测 定 红 外 吸 收 光 谱 ， 波 数 范 围 为 4 0 0 4 0 0 0 e m。 1 2 5 复水前 后辅 酶 Q 。 脂 质体 的形 态观 察采用 原 子力显微镜观 察复水前后辅 酶 Q。 。 脂质 体的外观形 貌 。 将 辅酶 Q 。 脂 质体 用磷 酸缓 冲液稀 释 5 0倍 ， 少 量样 品 滴 在新解理 的云母表 面并铺 展 ， 用滤纸 吸走 多余 液体 ， 室 温 下 放 置 约 2 0 mi n， 置 于 原 子 力 显 微 镜 的 扫 描 探 头 ( S i 探针 ) 下 ， 以动 态轻 敲方式 扫描 ( 频率 3 0 0 k Hz )， 在 室温 ( 2 0 2 2 ) 和大气环境下进 行观测 。 2 结果与讨论 2 1 冻干保护剂的选择 本 文 比 较 了 常 用 的 几 种 冻 干 保 护 剂 蔗 糖 、 海 藻 糖 、 甘 露 醇 、 乳 糖 、 葡 萄 糖 及 山 梨 醇 ， 根 据 所 得 冻 干 产 品的外 观 、 复 水后 辅 酶 Q， 。 脂 质 体 的包 封 率 和粒 径 筛 选 适 宜 的 冻 干 保 护 剂 。研 究 结 果 表 明 ， 当保 护 剂 ： E P C=4 ： 1 ( g g ) 时 ， 蔗糖 、 海 藻糖 、 甘 露 醇作 为 冻干 保 护 剂 的辅 酶 Q，。 脂 质 体 冻 干 后 能 形 成 有 一 定 硬 度 的 饼状 物 ， 复水 时具 有 良好 分 散性 ； 其 中乳 糖作 为 冻 干 保 护 剂 的 脂 质 体 冻 干 后 有 拉 丝 现 象 出 现 ； 采 用 葡 萄 糖 和 山梨 醇作 为 冻干 保护 剂 的脂 质 体 冻干 后 出现 明 显 的干缩 聚集 现象 。 冻干保 护 剂对脂 质 体水 合 重 建 后 的粒 径 及 包 封 率 的 影 响 见 图 1， 以 蔗 糖 、 海 藻 糖 、 甘 露 醇 为 冻 干 保 护 讲 究 摆 讨 剂 时 ， 重 建后 脂质 体 的平均 粒 径在 5 0 0 n m 左 右 ， 辅酶 Q。 。 包 封 率 在 7 0 以 上 。 其 中 甘 露 醇 为 保 护 剂 的 辅 酶 Q。 。 脂 质 体粒 径 最 小 ， 粒 子 分 散 范 围 也 较 小 ； 海 藻 糖为保 护 剂 的辅 酶 Q，。 脂 质 体 包 封 率 最 高 。结 果 表 明 ， 蔗糖 、 海 藻 糖及 甘 露 醇对 辅 酶 Q。 脂 质 体 的冻 干 保 护 作 用 相 近 ， 乳 糖 次 之 ， 葡 萄 糖 及 山 梨 醇 效 果 较 差 。 6 O O i , 0 0 4 【 ) ( 】 3 O O 干前 水后 蔗糖海 藻糖甘露醇乳糖 愿糖海藻糖 甘露醇孕 L 糖 保护剂种类 保护剂种类 ( a ) ( b ) 图 1 保护剂的种类对辅酶 Q 脂质体冷冻干燥效果的影响 二糖 是研 究 最 多也 是 最 有 效 的冻 干 保 护 剂 ， 其 中 海 藻 糖 为 非 还 原 性 二 糖 ， 可 在 无 水 条 件 下 保 护 生 物 膜 功能 ， 使 脂 质 体 在 完全 脱 水 时保 持 完 整 形 态 。 甘 露醇 的低 共 熔 温 度 较 高 ， 可 有 效 保 持 样 品冻 干 过 程 中的形状 。但 在本 研 究 中发现 贮 存 过 程 中甘 露 醇 作 为 冻 干 保 护 剂 的 脂 质 体 发 生 一 定 程 度 的 皱 缩 ， 原 因 可 能 是 其 在 室 温 贮 存 过 程 中 产 生 的 反 玻 璃 化 转 变 ， 其长 期稳 定性 有待 研究 。 2 - 2 不同浓度的保护剂对辅酶 Q伯脂质体包封率 的 影 响 能够 在冻 干过 程 中稳 定 脂 质体 所 需 的保 护 剂 与 磷 脂 的 比 例 取 决 于 脂 质 体 的 配 方 和 所 选 保 护 剂 的 种 类 。 因 此 ， 在 前 述 实 验 的 基 础 上 ， 选 用 蔗 糖 、 海 藻 糖 、 甘露 醇作 为 冻 干保 护 剂 进 一 步 研 究 保 护 剂 用 量 对 辅 酶 Q 。 脂 质 体 冷 冻 干 燥 的影 响 。选 择 保 护 剂 与 蛋 黄 磷脂 的质 量 比为 1 ： 1、 2 ： 1、 4： 1 、 8 ： 1 ， 测 定 复 水 后 辅 酶 Q， 。 脂 质体 的包 封率 ， 结果 见 图 2。 1 0 0 8 0 叠6 0 4 0 圈 2 0 0 1 ：1 2 ：1 4 ：l 8 ：l 比例 图2 保护剂用量对辅酶 Q 。 脂质体包封率的影响 图 2表 明 ， 当 蔗 糖 、 海 藻 糖 与 磷 脂 比 为 4： 1 ， 辅 酶 Q， 。 脂质 体 包封 率最 高 ， 进 一 步提 高糖 的浓 度 ， 包 封率 无 明显 提 高 ； 而 甘露 醇 与 磷 脂 比为 2： 1时 ， 包封 率 就 有 明 显 的 提 高 。 也 有 研 究 表 明 对 于 冻 干 前 样 品 溶 液 ， 糖 浓 度 过 大 冻 干 过 程 会 变 为 极 为 缓 慢 ， 冻 干 时 间 较长 ， 因此 具 有 合 适 的保 护 剂 的浓 度 才 能 达 到 较 好 的 冻 干 效 果 。 2 3辅酶 Q 。 前体脂质体的 F T I R分析 在 前体 脂 质 体 中 ， 磷 脂 头 部 基