微囊藻毒素研究进展.pdf

微囊藻毒素研究进展微囊藻毒素研究进展 王雪艳1，聂晶晶21大连海事大学环境科学与工程学院（116026） 2云南农业大学资环学院（650201） E-mail：wangxyan摘摘 要：要：微囊藻毒素(Microcystins，MCYSTs，MCs)为富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素，从毒理学、环境科学、生物学及化学等方面对 MCs 巳的研究已有较多报道。本文综述了 MCs 的具体的概念、对生物的影响，并对关于 MCs 在产生机理、分离检测方法和水处理过程中的去除方法等方面的研究进展，并对目前研究的不足提出了几点意见。 关键词：关键词：微囊藻毒素，水华，毒素，藻类植物 1. 前前 言言 日趋严重的水体富营氧化使水华(Water bloom)发生已成为全球性的环境问题。 我国多数淡水湖泊中形成水花的优势藻种， 主要为有毒的蓝藻， 这些毒藻可产生具有明显肝毒性的肽类物质，称为微囊藻毒素(Microcystins，MCYST)。近年来，由于饮用藻毒素污染的水体，而导致家禽、野生动物中毒，甚至死亡的事件频繁发生，藻类毒素对人体健康的危害已引起了人们的关注。 我国的一些饮用水水源也已受到了有毒藻类的严重污染。 本文就微囊藻毒素对生物危害、采集、检测及去除微囊藻的方法作了简单的介绍，着重在于微囊藻毒素的产生与环境的关系的介绍。 2. 微囊藻毒素（微囊藻毒素（MCYST） 2.1 微囊藻毒素微囊藻毒素 淡水藻类中，毒性最强、污染最广、最严重的是蓝藻门。目前已肯定的有毒藻类有铜锈微囊藻、水华鱼腥藻、水华束丝藻、阿氏颤藻、泡沫节球藻及念珠藻等。这些藻类不只产生一种毒素，如环境发生变化，一种藻类可产生几种毒素。它是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈致癌剂1。虽然在 1878 年Francis就最早报道了泡沫节球藻会对动物产生毒害作用，但人们对藻类分子结构的认识还不满 40 年。1959 年Bishop首次分离出藻毒素后，不断有相关报道发表。美国、日本、澳大利亚、印度、加拿大、芬兰等lO多个国家都曾报道了其湖泊、水库中有毒水华的形成，并分离出有毒藻株2。我国的东湖、巢湖、太湖、滇池、淀山湖、黄浦江等饮用水水源及各种湖泊在夏秋季节藻类水华严重，每年长达 78 个月，而天然水体蓝藻水华 80是产毒的3。从加拿大、日本、芬兰、美国、中国等地对湖水、河水、水库水、井水及自来水等水样的检测结果看，有的水体中微囊藻毒素检出率高达 60 一 87，源水中微囊藻毒素浓度从130ngml一2ugml不等， 经加氯处理后的浓度也有0 090 6ugL不等4。由此可见淡水水源受到微囊藻毒素污染的严重状况。 2.2 微囊藻毒素对生物的影响微囊藻毒素对生物的影响 MCYSTs主要以肝脏为靶器官5-6。动物经灌喂或腹腔注射后，破坏细胞内的蛋白磷酸化平衡，改变多种酶活性，引起肝脏病变，造成一系列的生理紊乱。中毒症状主要表现为虚 - 1 - 弱、呼吸沉重、皮肤变白、呕吐、腹泻、毛立和嗜睡等。Mcelhiney等7发现MCLR的存在可对茄属植物(Solanum)的生长和豆类植物(Phaseolus vulgaris)根的发育产生不良影响。Singh等8研究了MC对藻类、微生物和真菌生长的效应，发现在初始 50 mgL的MC可完全抑制灰色念珠藻和鱼腥藻的生长并使藻细胞溶解，观察到了MC对二氧化碳的吸收和光合作用的不良影响，同时推断出铜绿微囊藻通过MC的杀藻作用是保持其在自然条件下保持为优势藻种的重要原因。 2.3 微囊藻毒素的结构微囊藻毒素的结构 Louw认为，微囊藻毒素是一种具有强烈慢性肝脏中毒特征的生物碱。Hughes等（1958）发现并分离得到铜绿微囊藻NRC-1 有毒品系。Bishop等（1959）对铜绿微囊藻NRC-1 品系的毒性作全面研究， 发现这种微囊藻毒素是由 7 种氨基酸组成的小分子环状多肽， 为单环结构：D-丙氨酸-L-X-赤-甲基-D-异谷氨酸-Mdha。 其中Mdha是一种特殊氨基酸； Adda为 3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯-4，6-二烯酸；X和Y为两种可变L氨基酸（图 1）9。目前已鉴定约有 65 个微囊藻毒素变式， 其中多数毒性较高， 如MCYST-LR、 MCYST-RR和MCYST-YR 3. 微囊藻毒素的产生微囊藻毒素的产生 微囊藻毒素是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞破裂后释放出来并表现出毒性。由于它有很小的体积(分子量1000左右)、环状结构及其氨基酸的特殊结构，一般认为它不在核糖体内合成， 而是由肽合成酶复合体合成的生物活性小肽， 类似于在一些杆菌和真菌中小肽的合成。这些小肽大多是抗生素、免疫抑制物和一些对动物和植物有毒的物质。关于微囊藻毒 - 2 - 素产生的机理有很多假设，但目前为止尚无令人满意的结果。有两种考虑的可能性：一是环境因子影响，另一是遗传差异。 微囊藻毒素受光照、温度、营养盐等多种环境因素的影响，其中光照可能起着非常重要的作用。目前比较一致的研究结果显示，光强对微囊藻毒素有显著影响，而适于藻细胞生长的温度并不适于毒素的形成。宋立荣等8对滇池水华铜锈微囊藻和绿色微囊藻的实验室研究中发现，两种微囊藻在低细胞浓度时，对光强的耐受力差，在低光强下(15Em-2S-1叫)毒素产量较高；研究还表明，光强对毒素的影响效果受到培养温度的调节，而在同一光强下，温度的变化对毒素含量影响甚微。 Utkilen等11-12的研究也表明光能是毒素产生的一个重要制约因子， 温度在高光强下对毒素的产生几乎没有影响， 只有低光强下温度才影响毒素的产生低温条件（8200C）10微囊藻毒性强，但这并不是微囊藻适宜生长的温度。有研究表明13，微囊藻细胞的腺苷酸能荷控制毒素的产生， 因此， 任何影响腺苷酸能荷的因素都会调节毒素的产生，其中光照、营养盐的作用最大。在营养盐中，以磷的作用较明显，碳、氮的影响不大；微量元素中铁、锌的影响极明显,在BG11培养基中降低铁和锌的浓度，产量显著提高，而Al、Cd、Cr、Cu、Mn、Ni和Sn等对其产量无明显影响。 生物遗传主要受DNA控制。持毒素遗传决定论者认为，微囊藻有毒株(toxic strains)和无毒株(nontoxic strains)的毒性是由遗传决定的14。对微囊藻的遗传结构的研究表明，微囊藻毒素的合成是由毒素肽合成酶基因多基因控制，并由肽合成酶复合体合成(非核糖体合成的多肽)。Otsuka15等研究了有毒和无毒微囊藻(Microcystis)之间的关系。他们检测了Microcystis的47个藻株的16S到23S核糖体DNA内转录间隔序列。结果表明，Microcystis可被划分为三群：第一藻群包括有毒和无毒藻株；第二群只有有毒藻株；第三群只有无毒藻株。三个藻群之间的差别与表现型或藻胆色素成分之间的差别并无必然联系， 且同一种基因型可能有超过一种的表现型。通过对MAeruginosaPCC7806的DNA序列顺序分析研究发现，这种产毒的微囊藻含有具同源性的肽合成酶基因保守序列，其中至少含有两个多肽合成酶基因， 而微囊藻无毒株不具有这些基因。 Ding研究了上海淀山湖水华爆发时蓝绿藻提取物的遗传毒性14；Meibner于1996年发现微囊藻有毒和无毒藻株多肽合成酶基因的同源DNA序列。这些研究表明其毒素的产生受遗传因子影响。 综合因素，由于光照、温度为自然因素，人为不易控制，因而防止水体“水华”发生，只有从削减营养物负荷人手。根据对限制因子的研究，磷的控制为主要手段；另外，由于氮多来源于面源径流， 且水体有复氮效应， 因此国外对湖泊富营养化的防止， 不管磷是限制因素，还是氮为限制因素的湖泊，均以控制磷的输人为主来考虑。 蓝藻的生长和毒素合成不是仅受某一因素影响，而是多种物理、化学、生物因素共同作用的结果， 而且各种产毒藻之间还存在一定的种群差异， 今后值得进一步对多因素联合作用以及对其它产毒藻种进行研究。 4. 微囊藻毒素的检测方法及去除方法微囊藻毒素的检测方法及去除方法 4.1 目前藻毒素的检测方法目前藻毒素的检测方法 主要有生物测试法、化学分析法、免疫检测法、生物化学分析法及酶学方法等。 - 3 - 4.1.1 生物测试法生物测试法 毒理评价常用方法是采取对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性， 能较为粗略地判断提取物是否有毒性，具有操作简单，结果直观、快速等优点，但无法准确定量分析。有研究采用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价，也有采用细菌进行毒性试验和生物分析等 16-18。Fladmark等 19利用藻毒素诱导沙门氏菌和大鼠的原发性肝细胞死亡的能力为参数检测MCLR， 表明悬浮培养液中的沙门氏菌肝细胞为检测较广范围的肝毒素提供了迅速灵敏的系统。 4.1.2 化学分析法化学分析法 包括高效液相色谱法（HPLC）、(HPLC)与二极管阵列检测器(DAD)或电化学检测器联用、HPLC-UV、HPLC-MS、PLC、CE-MS、毛细管电泳（CE）、薄层色谱法（TLC）及气相色谱法（GC）等，对藻毒素可进行精确的定性、定量检测。 4.1.3 生物化学分析法生物化学分析法 主要包括酶联分析法（ELISA）、蛋白磷酸酶抑制分析法（PPIA）、免疫检测法、比色法蛋白磷酸酶抑制分析等，此类方法工作原理简单易行、分析速度快、灵敏度较高，但不能对毒素起到良好的鉴别作用，有时会出现假阳性反应。Chu等人于1989年制备了MCLR的多克隆抗体。1995年Satosh等制成6种MCLR的单克隆抗体，日本MBC公司据此单克隆抗体制成试剂盒。用ELISA方法可检测到00510 ngmL的MCs20。徐立红等21以放射性(采用32P标记的底物)蛋白磷酸酶抑制法研究了自中国武汉的东湖和一个养鱼塘采集的水样中MCs总量的季节变异性。此方法具有高度的可靠性和可重复性，检出限为20 ngL，有可能是目前检测MCYSTs的最灵敏的分析方法。Wong等22探索了利用比色法筛选水体中的MCs。试验中，以p一硝基苯酚为底物，监测黄色产物p一硝基酚的生成速率以表示蛋白磷酸酶2A的活性。结果表明，比色法蛋白磷酸酶抑制分析是一种简便，便宜的筛选水体中具有肿瘤促进特性的MCs的工具。此法的检出限与放射性分析(32P标记蛋白磷酸酶抑制试验)的检出限相仿。 上述方法有利有弊，具体实践中要灵活运用、取长补短。 4.2 去除藻毒素的方法去除藻毒素的方法 MCs通常存在于细胞内，只有细胞死亡并溶解后才释放到周围环境中。因此，在水处理过程中去除完整的蓝藻细胞及其细胞内化合物， 将有助于减少处理水中的有毒有味细胞代谢物的浓度。目前去除MCs的方法包括絮凝、吸附、化学降解、光降解及生物降解等。 Chow等23研究了传统的凝结絮凝一沉降一过滤的水处理方法对铜锈微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞的影响。结果表明，以硫酸铝絮凝去除Maeruginosa细胞，不对细胞膜的完整性造成破坏，也不影响细胞代谢物的释放，大部分细胞都能被完整地去除，处理后的水体中未发现MCs浓度增加。 在应用各种吸附材料吸附MC研究方面，Pendleton24发现木基活性炭因含有微孔和中孔比仅含微孔的椰壳基活性炭吸附的MCLR量大， 且吸附量主要因pH的变化而发生明显的变化，在pH为25时吸附量最大。Morris25研究了天然粘土对MC的吸附作用，发现含高岭土 - 4 - 和蒙脱土的细颗粒粘土材料可以去除81的MCLR。Miller等26发现具有高有机碳含量和高粘土含量的土壤可以最有效地吸附和降解MC，并认为降解是去除MC的一个限制性步骤。 MCs化学及物理性质极稳定，只有在苛性条件(如6N盐酸)下对其进行化学处理，才能彻底地化学降解。在蒸馏水中，自然光及荧光都不能破坏MCs，因此直接光降解无法消除自然水体中的MCs。研究还表明，微生物降解MCs通常要经历几天的时滞，降解速度才能达到较快水平。这可能是由于能降解MCs的微生物的初始数量较少，或初始微生物的代谢活性发生了改变。 在MC光降解研究中，Welker等27-28以腐植质作为光敏剂，在日光照射下初始10 ugL MC浓度下，半衰期需要105h。结果表明，3种MCs变型(LR，YR，RR)的浓度在腐殖质存在的条件下显著减少；而在纯水中，在自然光照下，这3种毒素的浓度则保持恒定。不同浓度的腐殖质对降解效率没有影响。 这可能是由于腐殖质起到了光敏剂的作用： 腐殖质能吸收波长范围较广(从290 nm到可见光)的阳光， 并形成高反应性分子(如羟基自由基、 单线态氧或过氧化氢)，这些高反应性物质就能激发惰性污染物发生光化学反应。Robertson等29研究了二氧化钛光催化降解MCLR的作用，并研究了影响此过程的因素。结果表明，MCLR的降解是由羟基自由基攻击毒素中的Adda基团引发的。在Feitz等30的研究中发现，二氧化钛光催化降解MCLR的过程依赖于pH的变化，毒素降解的最大起始速率出现在pH35时，在较高pH下，毒素的降解出现明显的迟滞。这可能是因为在较低pH时，毒素吸附到二氧化钛表面，并被在氧化过程中产生的较长寿命的有机自由基(羟基自由基)所降解；而在较高pH下， 毒素吸附到二氧化钛的过程变得微弱， 有机自由基分散到溶液中， 经历一段时间的迟滞，才开始氧化在溶解相中的毒素。 虽然微生物降解是去除MC的一条非常有前途的方法，但MC的环状结构和间隔双键具有相当的稳定性，一般的多肽分解酶不能对MC进行分解31，只有一些特殊的微生物菌种具备对MC的降解能力，这也是MC在天然水体中能够存在很长时间的一个重要原因。吕锡武等32采用序批式生物膜反应器对3种MC进行降解的实验显示，混合菌对MC有一定的降解能力， 对MC的降解好氧条件好于厌氧条件， 但在3 d内MC的去除量都低于400 ugL。 Takenaka和Watanabe33发现从天然水体中分离出的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)对MCLR有降解能力，在初始50 mgL高初始浓度下，20 d的除去率为90以上，并发现铜绿假单胞菌所分泌的碱性蛋白酶(alkaline protease)主要负责催化降解MCLR至(2S，3S，8s)一3一amino一2，6，8-trimethyl一10-phenyldeca一4E，6Edienoic acid。Park等34发现了一株具备对Mc有降解能力的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)，对MCRR和LR的最大降解速率分别达到每天130和54mgl。，这是目前世界上报道的最大MC生物降解速率。澳大利亚学者Bourne等35研究了鞘氨醇单胞菌对MCLR的降解途径，发现环状MCLR首先被开环变成线型的MCLR(NH2AddaGlumethyldehydroal-anineAlaLeupmethylaspartateArgOH)，然后再进一步降解成四肽化合物(NH2AddaGlumethyldehydroalanineAlaOH)，并证明了这2种中间代谢产物抑制50鸡脑蛋白磷酸酶活性的浓度都远远高于MCLR，这说明中间代谢产物的毒性明显低于MCLR本身。Brourne等36的更进一步研究显示，在鞘氨醇单胞菌降解MCLR过程中， 至少有3种微囊藻毒素酶(microcystinase)参与了MCLR的催 - 5 - 化降解反应， 并将对应的基因进行了克隆和分子特点识别。 尽管还有其它学者在纯菌种和混合菌对MC的可降解性进行了研究37-41，但在如何提高微生物降解MC比活性研究方面还有待于进一步加强。吕锡武等27采用序批式生物膜反应器，对MViridis及藻毒素RR、YR和LR进行了生物降解试验研究。结果表明，好氧生物处理对供试有毒蓝藻及其藻毒素的降解远比缺氧生物处理工艺有效；在好氧条件下，草履虫对有毒藻类和藻毒素降解起重要作用。 5. 存在的问题存在的问题 微囊藻是当今世界关注的热点问题，也是世界各国共同面临的一个环境科学难题。人们对微囊藻毒素研究拥有多年历史， 取得了许多有价值的成果但也存在很多问题。 如微囊藻毒素进入机体后的动力学问题？微囊藻毒素的产生机理及功能问题？藻类的生长与毒素产生、释放之间的关系问题？微囊藻控制途径问题？微囊藻毒素的产生与去除问题？浮游生物与产毒蓝藻种类间的相关问题？微囊藻与湖泊富营养化生物多样性的关系问题？当有毒微囊藻产生的毒素达到一定浓度时， 其种内、 种间关系如何？利用藻毒素如何能建立水华预警方面等等。 - 6 - 参考文献参考文献 1 Carmichael W W，et a1EPA600R一92079,US EPA Document，1992，1141 2 Carmichnel W W，et a1AIgaJ toxins and waterbased diseaseJCRC Critical Rew Environment Control,1985,(15)：275313 3何家菀有毒铜绿微囊藻对鱼和蚤的毒性J水生生物学报，1997，9(1)：49 4Tomoharus，et a1Two(2) 一dehydrobutyrine containing mirocystins from a hepatotoxic bloom of oscillatofia agazdhii from soulseatloch scotland JJ Nat Prod，1998，61：851853 5 Batista TSousa GD，Suput S， et al。Microcystin-LR causes the collapse of actin filaments in primary human hepatocytes。 Aquatic Toxicol，2003，65：8591 6雷腊梅，宋立荣.微囊藻毒素LR对小鼠的急性毒性研究.第一军医大学学报，2005，25(5) ：565-566 7 Mcelhiney J， Lawton L A， Leifert C Investigations into the inhibitory effects of microcystins on plant growth and the toxicity of plant tissues following exposureToxicon，2001，39(9)：14111420 8Singh D P，Tyagi M B，Kumar A，et a1Antialgal activity of a hepatotoxinproducing cyanobacterium，Microcystis aeruginosaWorld Jof MicrobiolBiotech，2001，17：1522 9吴静等藻毒素与健康效应的研究进展J上海环境科学，1999，18(7)：331334 10宋立荣等滇池水华蓝藻铜锈微囊藻和绿色微囊藻的生长生理特性及毒素分析水生生物学报，1999，23(5):402408 11Utkilen H and Gjorne N Emerge the dominating controlling factor for microcystin production in Microcystis aeruginosa，Compilation of abstracts4th International Conference On Toxic Cyanobacteria,1998,63 12Bickel H Lyck S and Utkilen HDose the energetic state of microcystis cells affect the microcystin content? 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