一株产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及酶学性质.pdf

Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程 2012年第7期 凝乳酶 （EC4.4.1.4 ） 是酶法干酪和酶法干酪素生 产中的关键性酶， 又称天冬氨酸蛋白酶， 其主要的生 物学功能是切断-酪蛋白的Phe 105-Met 106肽键， 导致牛奶凝结1。凝乳酶来源广泛， 主要有动物源凝 乳酶、 植物源凝乳酶以及微生物源凝乳酶。 动物源凝 乳酶是干酪生产过程中使用最多的凝乳酶，但随着 世界干酪产量逐年上升，每年屠宰大量的犊牛已经 无法满足工业生产干酪的需求；植物源凝乳酶蛋白 水解活力太强， 且受时间、 地点等因素限制2-3； 由于 微生物生长不受地域和气候的影响， 发酵容易控制， 且来源广泛， 价格便宜， 微生物源凝乳酶最有可能成 为小牛凝乳酶替代品。国内外已进行了大量关于凝 乳酶的研究，到目前为止研究发现产凝乳酶的微生 物主要包括链霉菌属 （Streptomyces） 、 小单胞菌属 （Micromonospora ） 、 马杜拉放线菌属 （Actinomadura ） 、 张卫兵1，2，3，甘伯中1，2，3，*，梁琪1，2，3，米兰1，2，3，张炎1，2，3 （1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070； 2.甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃兰州730070； 3.甘肃省干酪素工程技术研究中心，甘肃兰州730000） 摘要：采用酪蛋白培养基，从甘南牦牛放牧区分离筛选产凝乳酶细菌。 通过形态学、生理生化特征和16S rDNA序列 同源分析对菌株进行鉴定，并对该菌株所产凝乳酶的特性进行了研究。 从牧区采集的56个样品中共筛选得到6株产凝乳 酶细菌，复筛得到一株凝乳活力高、蛋白水解力低的菌株GN4.1，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）， 在麸皮培养基中发酵48h，凝乳活力可达1011.56SU/mL，蛋白水解力为14.61U/mL。凝乳酶的最适作用温度为60，65 加热10min后凝乳活力丧失；最适作用pH为5.5，在pH3.58.5内稳定性较好。 预期该菌株所产凝乳酶有用于乳品加工 业的潜力。 关键词：解淀粉芽孢杆菌，凝乳酶，酶学性质 Study on isolation，identification of Bacillus amyloliquefaciens producing chymosin and enzyme properties ZHANG Wei-bing1，2，3，GAN Bo-zhong1，2，3，*，LIANG Qi1，2，3，MI Lan1，2，3，ZHANG Yan1，2，3 （1.College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China； 2.Gansu Provincial Key Laboratory of Functional Dairy， Lanzhou 730070， China； 3.Gansu Casein Engineering Technical Research Center， Lanzhou 730000， China ） Abstract： The casein culture medium was used to isolate milk-clotting enzyme producing bacteria from soil of yak grazing district in Gannan County. Strain identification was carried out based on the morphology，physiology， biochemical test and 16S rDNA sequences analysis，and the property of the milk-clotting enzyme produced by the strain was studied. Six bacteria producing milk -clotting enzyme were screened out. Furthermore，one bacterium GN4.1 had the highest milk-clotting enzyme activity and the lowest protein hydrolyzed enzyme activity，identified as Bacillus amyloliquefaciens. The milk-clotting enzyme activity and the protein hydrolyzed enzyme activity of GN 4.1 was 1011.56SU/mL and 14.61U/mL after fermentation for 48h，respectively. The optimal reaction condition for milk-clotting enzyme was at 60，pH5.5. The activity was stable at pH ranging from 3.5 to 8.5 but totally lost after heating at 65 for 10min. The milk-clotting enzyme produced by strain GN 4.1 might have the potential applicatin in dairy industry. Key words： Bacillus amyloliquefaciens； milk-clotting enzyme； enzyme properties 中图分类号：TS201.3文献标识码：A文 章 编 号：1002-0306（2012）07-0172-06 收稿日期：20110714*通讯联系人 作者简介：张卫兵（1974-），男，副教授，博士，研究方向：应用微生物学。 基金项目：国家863计划（2011AA100903）；甘肃省科技重大专项项目 （0702NKDA034）；甘肃农业大学创新基金（GAU-CX1107）。 一株产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌的 筛选、 鉴定及酶学性质 172 生 物 工 程 Vol.33,No.07,2012 2012年第7期 根霉 （Rhizopus ） 、 微小毛霉 （Mucor pusillus ） 、 总状毛 霉 （Mucor racemosu ） 、 易脆毛霉 （Mucorfuagilis ） 、 米黑 毛霉 （ Mucornichei ） 、 寄生内座壳菌 （ Endothiaparasitisa ） 、 粟疫菌 （Endothia parasitica ） 等， 不同来源的凝乳酶酶 学性质差异很大4-6。利用高效优良的产凝乳酶微生 物， 通过发酵法生产凝乳酶是目前最有前途的发展方 向。 国内外关于产凝乳酶真菌和放线菌的报道很多， 但 关于产凝乳酶细菌的报道仅有枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis ） 和地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis ） ， 由 于凝乳活力不高而不能达到发酵生产的要求7-10。因 此，筛选高效优良的产凝乳酶细菌，发挥细菌体积 小、 繁殖快、 产物易于提取分离的优点， 对微生物凝 乳酶的研发和应用十分必要。本研究拟从甘肃甘南 牦牛牧区采集的土壤样品中分离筛选产凝乳酶细 菌， 根据形态学、 生理生化特征和16S rDNA同源性分 析对菌株进行鉴定， 并对其凝乳活力、 蛋白水解活力 和酶学性质进行研究，以期为细菌凝乳酶开发和利 用奠定基础。 1材料与方法 1.1实验材料 样品甘肃甘南合作市、 夏河县、 碌曲县和玛曲 县等地牧区牧场、 牛舍、 饮水区和挤奶区的土壤样品 56个，土壤采样时用无菌刮铲采集离地面10cm左右 的土样， 放在玻璃瓶中于4保存备用； 培养基牛 肉膏蛋白胨固体和液体培养基参照文献11配制； 酪 蛋白液体培养基蛋白胨0.25%， 葡萄糖1%， 酵母膏 0.1%， 干酪素1.0%， 脱脂牛乳5%， pH7.0； 酪蛋白固体 培养基酪蛋白液体培养基中加入2%的琼脂； 麸皮 培养基将10g麸皮加入100mL自来水， 煮沸10min， 过 滤后用自来水补足100mL， pH自然。 1.2实验方法 1.2.1菌种初筛称1g样品，进行梯度稀释后吸取 1mL涂布于酪蛋白培养基平板上， 37下培养48h， 选 择沉淀圈与水解圈比值大的单菌落，在牛肉膏蛋白 胨平板进一步划线分离，分纯后编号接入斜面种子 培养基， 以备复筛和鉴定。 1.2.2菌种复筛将初筛所得菌种分别接种于麸皮 培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基和酪蛋白液体培 养基中， 37， 140r/min摇床培养48h后，取发酵液测 定凝乳酶和蛋白水解活力。 1.2.3菌株的鉴定 1.2.3.1形态学特征牛肉膏蛋白胨培养基平板 37恒温培养24h， 观察菌落形态。将菌体进行芽孢 染色， 革兰氏染色后于高倍显微镜下观察菌体形态。 1.2.3.2生理生化特征测定参考 常见细菌系统鉴 定手册 12和 微生物学实验13测定菌株的生理生化 特征。 1.2.3.316S rDNA序列测定及系统发育分析将菌 体于10L灭菌水中99变性10min， 离心取上清液作 为模板， 采用通用引物。 上游： 5 -ATGGATCCGAGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3 。 下游： 5 -TATCTGCAGTGGTGTGACGGGCGGTG T-3 。 使用16S rDNA Bacterial Identification PCR仪， 进行PCR扩增目的片段。反应体系共50L， 94预变 性 5min， 94 变 性 1min， 55 退 火 1min， 72 延 伸 1.5min， 30个循环， 72保温5min。 取5L进行1%琼脂 糖凝胶电泳， 然后切胶回收目的片断进行DNA测序。 测序由大连宝生物公司完成，将测定的16S rDNA序 列在NCBI使用Blast与GenBank中核酸序列数据库进 行比对分析，从GenBank数据库中获得与菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据， 使用ClustalX 1.8对 齐后利用软件MEGA4.0构建系统发育树。 1.2.4酶活力的测定 1.2.4.1凝乳酶活力测定采用Arima方法6。 将发酵 液在4000r/min， 4下离心10min， 取上清液测定凝乳 酶活力。 取5mL 100g/L的脱脂乳， 在35下保温5min， 加入0.5mL粗酶液， 迅速混合均匀， 准确记录从加入 酶液到乳凝固的时间 （s ） 。 把40min凝固1mL 100g/L脱 脂乳的酶量定义为一个索氏单位 （SU ） 。 酶活力= 2400 t （s ） 5 0.5 D 其中： t为凝乳时间， D为稀释倍数。 1.2.4.2蛋白水解力测定将发酵液于4000r/min， 4下离心10min， 取上清液测定其蛋白分解活力。取 15100mm试管3支， 编号1、 2、 3， 每管内加入粗酶液 1mL， 置于40水浴中预热2min， 再各加入经同样预 热的酪蛋白1mL， 精确保温10min。时间到后， 立即再 各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL， 以终止反应。继续置 于水浴中保温20min， 使残余蛋白质沉淀后过滤。然 后另取15150mm试管3支， 编号1、 2、 3， 每管内加入 滤液1mL， 再加0.4mol/L碳酸钠5mL， 已稀释的福林试 剂1mL，摇匀后40保温发色20min后进行光密度 （OD660） 测定。空白实验也取试管3支， 编号1、 2、 3， 测 定方法同上， 在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸 2mL， 使酶失活， 再加入酪蛋白。 蛋白酶活力=OD660K 4 T 式中： K为每度OD660所相当的酪氨酸量， 4为4mL 反应液取出1mL测定 （即4倍 ） ， T为反应时间10min。 1.2.5生长曲线和产酶曲线 1.2.5.1生长曲线将菌种接入麸皮培养基中培养， 接种量为3%， 37振荡培养， 分别在培养0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22h测定菌体OD600值， 绘制生长 曲线。 1.2.5.2产酶曲线将菌种接入麸皮培养基中培养， 接种量为3%， 振荡培养37， 分别在培养0、 6、 12、 18、 24、 30、 36、 42、 48、 54、 60h测定发酵液的凝乳酶活力 和蛋白水解力， 并绘制产酶曲线。 1.2.6酶学性质的研究 1.2.6.1酶的最适作用温度分别在25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75下测定发酵液的凝乳活 力， 以最高酶活为对照， 记为100%。 1.2.6.2酶的热稳定性分别在35、 45、 55、 65下保 温10、 20、 30、 40、 50、 60min，冷却后在35测定发酵 液的剩余凝乳活力， 以最高酶活为对照， 记为100%。 173 Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程 2012年第7期 1.2.6.3酶的最适作用pH用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH将100g/L的脱脂乳调节到不同pH， 在酶最适宜 的凝乳温度下测定发酵液的凝乳活力，以最高酶活 为对照， 记为100%。 1.2.6.4酶的pH稳定性用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L 氢氧化钠将酶液调节到不同pH，在室温下放置24h， 再将酶液调回到最适pH，在酶最适温度下测定发酵 液的凝乳活力， 以最高酶活为对照， 记为100%。 2结果与分析 2.1菌种筛选 将样品梯度稀释后涂布于酪蛋白平板培养基 上，由于菌株产生凝乳酶作用于培养基中的酪蛋白 而产生白色沉淀圈。 一般情况下， 沉淀圈越大越厚说 明菌株产凝乳酶活力越高，蛋白活力高的菌株则会 分解培养基中酪蛋白而产生透明圈。 经过初筛， 从56 个样品中共分离得到6个产生沉淀圈的菌株，其菌 落、 沉淀圈和透明圈形态见图1。将这些菌株分别在 三种发酵培养基中培养48h， 凝乳酶和蛋白水解活力 的测定结果如表1所示。 由表1可以看出， 在6株菌中， 菌株GN 4.1在麸皮 培养基中发酵时， 凝乳活力最高可达1011.56SU/mL， 此时蛋白水解活力为14.61U/mL， 酶活比值最大。 2.2菌种鉴定 2.2.1形态学特征菌株GN 4.1在酪蛋白平板上菌 落边缘不整齐且粘稠湿润， 微白色不透明， 不光滑， 有皱褶， 中间隆起。显微镜镜检菌株为长杆状， 有芽 孢， 呈椭圆形， 中生。 液体静置培养表面形成菌膜。 菌 株GN 4.1革兰氏染色照片及扫描电镜照片见图2。 2.2.2生理生化特征菌株GN 4.1的部分生理生化 实验结果见表2， 参照 常见细菌系统鉴定手册 12， 初步确定其为芽孢杆菌属。 2.2.316S rDNA序列测定及系统发育分析采用芽 孢杆菌16S rDNA特异保守序列引物对菌株GN 4.1进 行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和分 析， 序列长度为1518bp。与已报道芽孢杆菌属的16S rDNA序列进行比较后， 从中选出部分菌株， 根据其 16S rDNA序列，利用MEGA 4.0软件构建其进化树， 如图3所示。 图3表明菌株GN 4.1与解淀粉芽孢杆菌BCRC11601 和解淀粉芽孢杆菌LCEP-1为同一簇，相似性在99% 以上，结合形态学和生理生化特征，最终确定菌株 GN 4.1为解淀粉芽孢杆菌属，命名为解淀粉芽孢杆 图1不同菌株在酪蛋白平板的菌落形态 Fig.1Colony morphology of different strains on the solid casein medium GN 1.1GN 3.3GN 3.1 GN 3GN 2 GN 4.1 表1不同菌株在不同培养基中的产酶活力 Table 1Enzyme activities of different strains in different fermentation medium 菌株 凝乳酶活力 （SU/mL ）蛋白水解活力 （U/mL ） 麸皮 培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 酪蛋白 培养基 麸皮 培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 酪蛋白 培养基 GN 4.1 1011.5626.8516.4314.615.924.36 GN 3.126.6515.2326.6528.3218.128.08 GN 1.118.2539.4561.7851.69 GN 322.3536.65 GN 216.5115.8510.4831.89 GN 3.350.4719.478.5817.549.386.06 注： ： 检测不出。 图2菌株GN4.1革兰氏染色照片 （ 1000 ） 及扫描电镜照片 （ 3000 ） Fig.2Gram stain （1000 ）and electron micrograph （3000 ）of strain GN 4.1 表2菌株GN 4.1部分生理生化特征 Table 2Partly biochemical and physiological characteristics of the strain GN 4.1 实验项目结果实验项目结果 葡萄糖发酵实验+纤维素分解实验- 麦芽糖发酵实验+明胶液化实验+ 蔗糖发酵实验+丙二酸盐实验+ 乳糖发酵实验-硫化氢实验- 木糖发酵实验-脲酶实验+ 阿拉伯糖发酵实验-硝酸盐还原实验+ 甘露醇发酵实验-苯丙氨酸脱氨酶实验+ V.P.实验+氨基酸脱羧酶实验+ 甲基红实验-2%氯化钠生长实验+ 柠檬酸盐利用实验+吲哚实验- 过氧化氢酶实验+酪氨酸水解实验+ 淀粉水解实验+酪素水解实验+ 注： +： 阳性； -： 阴性。 图3菌株GN 4.1与相关菌株系统进化树 Fig.3Phylogenetic tree showing relationship between GN 4.1 and related strains BacillusamyloliquefaciensBCRC11601 Bacillus amyloliquefaciens LCEP-1 GN 4.1 Bacillus subtilis CKT2 BacilluslicheniformisstrainMML2501 Bacillus pumilus HR10 Bacillus acidicola TSAS-1 Bacillus mycoides strain DFC1 Bacillus anthracis strain B14 Bacillus firmus strain RKS468- Bacillus megaterium strain VITSN02 Bacillus simplex strain 817 99 98 97 100 50 87 87 0.005 100 174 生 物 工 程 Vol.33,No.07,2012 2012年第7期 菌GN 4.1。 2.3生长曲线和产酶曲线 由图4可以看出， 菌株GN 4.1在液体培养基中0 6h生长速率缓慢，这个时期为迟缓期； 612h生长速 率最快， 这一阶段即为指数生长期； 1220h菌体量随 时间延长基本保持平衡， 这一阶段为稳定期。 由产酶 曲线 （图5 ） 可以看出， 菌株GN 4.1在迟缓期内不产 酶， 12h后凝乳酶活力迅速增加， 在发酵48h时凝乳酶 活力达到最高， 随后凝乳酶活力略有降低； 随着凝乳 酶产量的增加， 蛋白水解力也逐渐增大， 两者变化趋 势基本相同， 蛋白水解力在42h时达到最大， 随后逐 渐降低。 2.4酶学性质 2.4.1酶的最适作用温度图6显示了不同反应温 度下发酵液的凝乳活力。 结果表明， 凝乳酶活力在反 应温度为60时最高。以60时的酶活为标准， 55 时相对酶活性下降至81%， 70时相对酶活性仅为 20%， 反应温度提高到75时， 凝乳活力丧失。 2.4.2酶的热稳定性发酵液在不同温度水浴处理 后， 测得的凝乳活力见图7。结果表明， 在35条件下 处理时酶活力变化不大， 加热60min后， 剩余酶活性 为75.70%。 在55条件下处理时酶活力下降较快， 加 热40min后， 剩余酶活性为8.40%， 加热50min后， 酶活丧 失。在65条件下处理时酶活力下降更快， 加热10min 后， 剩余酶活性为6.50%， 加热20min后， 酶活丧失。 2.4.3酶的最适作用pH不同pH下测定的凝乳酶 活力结果见图8。结果表明， 在pH3.58.0的范围内， 均有一定的凝乳活力，其中pH为5.5时凝乳活力最 高。 以pH5.5时的酶活为标准， 在pH4.06.5的范围内， 凝乳活力下降不多，相对活力均在74%以上。在 pH4.06.5的范围外，凝乳活力下降较多， pH为3.5时 相对活力仅为9%， pH为8.0时相对活力仅为6%。 2.4.4酶的pH稳定性凝乳酶在不同pH条件下酶 活稳定性结果见图9。结果表明， 该酶pH3.58.5内相 对稳定， pH小于3.5或pH大于8.5时酶活性下降较快， 在pH3.0处理时， 剩余酶活约为10%， 在pH9.0处理时， 剩余酶活仅为9%。 3结论与讨论 3.1结论 本实验通过酪蛋白培养基，从甘南牧区采集的 图4菌株GN 4.1生长曲线 Fig.4Growth curve of strain GN 4.1 0246810121416182022 光密度值 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 时间 （h ） 图5菌株的产酶变化曲线 Fig.5Enzyme activity changes in fermentation process 0612 18 24 30 36 42 48 54 60 凝乳酶活力 （SU/mL ） 1200 1000 800 600 400 200 0 时间 （h ） 凝乳酶活力 蛋白水解力 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 蛋白水解力 （U/mL ） 图6不同温度对凝乳酶活力的影响 Fig.6Effect of temperature on milk-clotting activity 30354045505560657075 相对酶活 （% ） 120 100 80 60 40 20 0 温度 （ ） 图7凝乳酶的热稳定性 Fig.7Thermo-stability of milk-clotting enzyme 0102030405060 相对酶活 （% ） 120 100 80 60 40 20 0 35 45 55 65 时间 （min ） 图8不同pH对凝乳酶活力的影响 Fig.8Effect of different pH on enzyme activity 3.544.555.566.577.58 相对酶活 （% ） 120 100 80 60 40 20 0 pH 图9凝乳酶的pH稳定性 Fig.9pH stability of milk-clotting enzyme 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 相对酶活 （% ） 120 100 80 60 40 20 0 pH 175 Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程 2012年第7期 土壤样品中共筛选得到6株产生沉淀圈的细菌； 采用 麸皮培养基、 牛肉膏蛋白胨培养基和酪蛋白培养基复 筛得到一株凝乳活力高、 蛋白水解力低的菌株GN 4.1， 菌株GN 4.1用麸皮培养基发酵48h时， 凝乳活力最高 可达1011.56SU/mL， 此时蛋白水解活力为14.61U/mL。 通过形态学特征、生理生化特征结合16S rDNA序列 分析， 菌株GN 4.1被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens ） 。 酶学性质的研究结果表明该菌产 生的凝乳酶的最适作用温度为60，最适作用pH为 5.5， 65加热10min后凝乳活力丧失， 在pH3.58.5内 稳定性较好。总体来看， 菌株GN 4.1不仅发酵产酶周 期短， 而且具有能利用廉价原料-麸皮、 凝乳酶活力 高、 蛋白水解力弱等特点， 该菌株所产凝乳酶热稳定 性和pH稳定性较好、 可操作性强， 有用于乳品工业加 工的潜力。该菌株也是国内外首次分离到的产凝乳 酶的解淀粉芽孢杆菌属菌株。 3.2讨论 随着世界奶酪产业不断发展，每年需要大量的 凝乳酶。动物凝乳酶的缺乏使得微生物凝乳酶替代 品的研究和开发成为热点。本研究从甘肃甘南牦牛 放牧区采集了大量土壤样品，进行产凝乳酶微生物 的分离。 甘南牧区是甘肃省主要的畜牧业基地， 地处 青藏高原东北边缘， 大部分地区在3000m以上， 四季 温差大， 紫外线强度大。当地特殊的地理、 气候和人 文环境为微生物群落的多样化和繁衍进化提供了条 件，这里必然蕴藏着具有独特酶类和特殊的代谢途 径的微生物。本研究从牦牛牧区采集的大量土壤样 品中共分离得到6个产生沉淀圈的菌株， 复筛后得到 一株高产凝乳酶细菌GN 4.1， 形态学特征、 生理生化 特征和16S rDNA序列同源分析结果表明它是一株解 淀粉芽孢杆菌。目前关于解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens ） 在食品工业上应用的报道主要集 中在其能产生-淀粉酶、 甲基转移酶、 抗菌脂肽、 豆 豉溶栓酶等14-17， 对于产凝乳酶尚未见报道， 菌株GN 4.1的发现丰富了凝乳酶产生菌的资源库。 在实际生产中， 缩短发酵周期， 设备的利用率就 会大大提高。菌株GN 4.1的生长曲线显示其对数生 长期在培养612h， 而在发酵过程中其产酶高峰期却 在发酵12h以后， 且随着发酵时间的增加产酶活力也 不断增加， 到48h达到最高， 比目前已报道的产凝乳 酶真菌米黑毛霉 （Mucor mihei ） 和微小毛霉 （Mucor pusillus ） 发酵周期短18-20； 与已报道的产凝乳酶细菌 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis ） 相比， 菌株GN 4.1不仅发酵产 酶周期短， 而且具有能利用廉价原料-麸皮、 凝乳酶 活力高、 蛋白水解力弱等特点7-10。在后续实验中可 对其培养基和培养条件进一步优化，以提高其凝乳 活力， 降低蛋白水解力。 酶学性质与酶能否工业化应用有很大关系， 不 同菌株来源的凝乳酶的酶学性质有很大差异。pH和 温度是影响凝乳糖酶活性的重要因子，过高或过低 会改变凝乳酶蛋白的构象，甚至会导致凝乳酶变性 失活； 当pH改变不剧烈时， 凝乳酶虽尚未变性， 但活 力会受到一定影响，从而影响酶制剂在生产中的使 用效果。根据国际乳业联合会 （International Dairy Federation， IDF ） 要求21， 生产用凝乳酶需具备下列特 征： 凝乳活性与蛋白水解活性比值 （C/P ） 高； 凝乳活 性对pH的依赖性较小；在干酪加工中应用的温度和 pH条件下活性稳定； 在乳清加工中的热稳定性较低； 贮藏期间稳定性好。菌株GN 4.1凝乳酶的最适作用 温度与微小毛霉凝乳酶同为60，均高于小牛皱胃 酶。热稳定性与微小毛霉凝乳酶类似， 65加热 10min后凝乳活力丧失； 凝乳酶的最适作用pH为5.5， 与微小毛霉凝乳酶接近，略低于小牛皱胃酶；菌株 GN 4.1凝乳酶的在pH3.58.5范围内稳定性良好， 说 明它适宜的pH范围比小牛皱胃酶和微小毛霉凝乳酶 要宽22-23。关于菌株所产凝乳酶的其它酶学性质、 凝 乳酶的氨基酸序列、活性位点和结构预测等有待于 进一步研究。 参考文献 1郭本恒.干酪M.北京：化学工业出版社，2004. 2张红梅，刘仲滨.凝乳酶的研究进展J.同济大学学报：医 学版，2004，25（3）：254-256. 3曾剑超.国内凝乳酶及其代替品的研发进展J.中国牛业科 学，2008，34（2）：48-49. 4周俊清，林亲录，赵谋明.微生物源凝乳酶的研究进展J.中 国食品添加剂，2004（2）：6-9. 5郭光远，姜成林，马俊.微生物凝乳酶的研究J.微生物学 通报，1988，15（5）：207-210. 6 K Arima，I Shinjiro，T Gakuzo. Milk-clotting enzymes from microorgainism，Part I，Screening test and identification of potent fungusJ. Agric Biol Chem，1967，31（5）：540-545. 7宋曦，甘伯中，贺晓玲，等.天祝县牦牛牧区土壤中产凝乳 酶细菌筛选及鉴定J.食品科学，2009，30（11）：158-162. 8胡永金，石振兴，朱仁俊，等.一株产凝乳酶细菌的分离与 鉴定J.中国酿造，2010（5）：81-83. 9刘河涛.一株产凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选、 鉴定及其酶 活性质的研究D.兰州：兰州大学，2008. 10 C Shieh，L Thi，I Shih. Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis nattoJ. Biochemical Engineering Journal，2009，43（1）：85-91. 11刘慧.现代食品微生物学实验技术M.北京：中国轻工业 出版社，2006. 12东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册M.北京：科学 出版社，2001. 13沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验M.第三版.北京：高 等教育出版社，1999. 14刘洋，沈微，石贵阳，等.解淀粉芽孢杆菌BamHI甲基转移酶基 因克隆、功能鉴定与序列分析J.生物技术通报，2009（11）：65-68. 15史永昶，姜涌明，樊飚，等.蛋白酶对解淀粉芽孢杆菌-淀 粉酶活力的影响J.微生物学通报，1995，22（1）：23-25. 16孙力军，陆兆新，别小妹，等.培养基对解淀粉芽孢杆菌ES-2菌 株产抗菌脂肽的影响J.中国农业科学，2008，41（10）：3389-3398. 17彭勇，张义正.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） DC-4产豆豉溶栓酶发酵条件的优化J.食品与发酵工业，2002， （下转第180页） 176 Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程 2012年第7期 28（4）：19-23. 18 J Escobar，S Barenett. Synthesis of acid protease from Mucor miehei integration of production and recoveryJ. Process Biochemistry，1995，30（8）：695-700. 19 K Arima，J Yu，S Iwasaki. Milk-clotting enzyme from Muor pusillus var. lindtJ. The Acidic Proteases，1972，30：446-459. 20 G Somkuti，F Babel. Conditions influencing the synthesis of acid protease by Mucor pusillus LindtJ. Applied Microbiology， 1967：1309-1312. 21 T Guinee. Rennet coagulation and coagulants in cheese manufactureJ. Journal of the Society of Dairy Technology，1992， 45（4）：94-104. 22卢蓉蓉，黄艳艳.皱胃酶酶学性质的研究J.食品科技，2002 （5）：254-256. 23矫庆华，钱世钧，孟广震.微小毛霉凝乳酶的生物合成和 性质的研究J.微生物学报，1992，32（1）：30-35. 2.4.2用固定化酸性脲酶酶膜处理过的黄酒中EC含 量变化用固定化酸性脲酶酶膜处理未煎过的黄 酒， 85下煎酒30min， 考察EC含量的变化。 由表6可知，固定化酸性脲酶酶膜处理前后， 黄 酒中尿素去除率为54.8%， EC含量降低率为55.6%。 说明固定化酸性脲酶酶膜不仅能分解产生EC的前提 物质尿素， 从而使煎酒后产生的尿素EC含量降低， 而 且自身可能还对EC具有一定的吸附作用。 2.4.3固定化处理后黄酒风味分析处理前的黄酒 中含有51种风味物质，其中9种酸类， 11种醇类， 7种 醛类， 24种酯类；处理后的黄酒中含有52种风味物 质， 其中9种酸类， 11种醇类， 10种醛类， 22种酯类。 从 色谱分析图中可知， 用固定化酸性脲酶酶膜处理后， 醛类物质增加三种， 分别是2-甲基-2-丁烯醛、 壬醛、 5-甲基呋喃醛； 减少的两种酯类为： 对羟基苯甲酸丁 酯、 油酸乙酯。变化的几种物质均含量极少， 且不是 影响黄酒风味的主要物质。此外液相色谱处理过程 中也略有误差， 由此可知， 固定化酶膜反应器处理之 后， 对黄酒的风味物质没有太大影响， 故而用此方法 固定化酸性脲酶处理黄酒是一种很好的选择。 3结论 向黄酒中添加酸性脲酶可以降低尿素含量， 但 游离酸性脲酶在酒中反应后酶难以分离回收， 无法重 复使用。 本实验将酸性脲酶固定于壳聚糖-明胶膜上， 且在膜中加入保护剂，一方面使酶活收率由66.40% 提高到82.25%； 另一方面大大提高了酶的利用次数， 存储周期增长。 此外， 将酶膜以卷轴膜形式做成反应器， 在黄酒 生产中应用， 只需在煎酒之前将原酒