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收稿日期:2005211218;修订日期:2006202218 基金项目:国家自然科学基金资助项目,项目编号:30371121 作者简介:林小植(1980 ) , 男,广东揭西县人;硕士生,水生生物学专业,主要从事鱼类营养学研究,E2mail :xiaozhilinok 通讯作者:谢小军,E2mail :xjxie 饲料碳水化合物水平对南方鲇幼鱼餐后糖酵解酶活性及血糖浓度的影响 林小植 罗毅平 谢小军 (西南师范大学生命科学学院,重庆 400715) 摘要:配制含0 %、15 %和30 %糊化玉米淀粉的等能饲料分别作为对照、 中水平和高水平碳水化合物(CHO)饲料,以 体重为50.50.6g的南方鲇幼鱼为实验对象,在水温27.50.5 的条件下以对照饲料驯化15d后,分别测定了以 三种饲料投喂的南方鲇在餐后3、6、12、24和48h的己糖激酶(HK)、 葡萄糖激酶(GK)和磷酸果糖激酶(PFK2 1) 的活 性和血糖水平。结果发现,中、 高水平CHO组HK活性在餐后24h时显著高于对照组(P 5mg/L ,光制为14L :10D。实验鱼经过15d的驯化 后开始实验。 113 实验操作程序 将经过驯化15d后的实验鱼 禁食48h ,先取5尾作为摄食前对照,测定各项指 标。其余实验鱼随机分成三组,分别以对照饲料、 中 CHO饲料和高CHO饲料投喂一次。南方鲇具有对 食物团整体吞食的习性,将饲料准确称量并捏成一 团后再进行投喂,避免了摄食后存在残饵。投喂后 15min检查摄食情况,选取已摄食的实验鱼作为取 样对象,分别在3、6、12、24和48h取样测定,每组每 次取样5尾。 采血方法参照Ackerman等17的工作。根据本 实验室已有的研究资料,在1min内完成断尾取血不 会造成鱼体血液指标发生变化,据此本研究中取血 操作均在30s内完成。 114 饲料的化学成分分析和肝脏各项指标的测定 饲料的生化分析样品均在70 烘干,求得干物质含 量,然后进行生化分析测定18。 己糖激酶(HK)和葡萄糖激酶(GK)的活性采用 K irchner等19的方法测定:取0. 5g肝脏,在4 条件 下,加入10倍体积缓冲液匀浆,于10000r/ min离心 30min ,取 上 清 液, 30下 在 酶 标 仪( SPECTRA MAX190 ,Molecular Devices)340nm波长30min内完成 测定。 磷酸果糖激酶(PFK2 1) 的活性采用Meton等9 的方法测定,在4 条件下取0. 5g肝脏加入10倍体 积缓冲液匀浆,20000r/ min离心30min ,取上清液, 30 下,波长340nm测定。 组织上清液蛋白质含量用牛血清蛋白为标准蛋 白,采用Bradford20的方法测定。 酶的活性表示为:在30条件下,每毫克蛋白 每分钟水解1mol底物为一个活力单位(U)。 肝指数=肝脏重/体重 100 % 3期林小植等:饲料碳水化合物水平对南方鲇幼鱼餐后糖酵解酶活性及血糖浓度的影响305 肝糖原采用蒽酮试剂法21测定。血清葡萄糖 浓度采用葡萄糖氧化酶法12测定。 115 数据统计与分析方法 采用Excel (2003)和 SPSS(11. 5)软件进行数据的整理及统计分析。 2 结果 211 糖酵解酶活性的变化(表 2) HK:在实验鱼摄食后的48h过程中对照组和中 表2 摄食不同水平碳水化合物饲料后南方鲇的己糖激酶、 葡萄糖激酶和磷酸果糖激酶的活性 Tab.2 Specific activities of hepatic enzymes of GK、HKand PFK21 in the southern catfish after feeding three different CHO level diets 饲料Diet 时间Time(h) 036122448 HK活性 Specific activity of HK(U) Control0.5370.058b0.8840.081a0.7190.051ab0.9100.073a0.7510.080ab y0.8170.158a Middle CHO0.5370.058b0.9380.211a0.8660.045a0.8910.096a1.0730.089a x0.7510.088a High CHO0.5370.058b0.6650.109ab0.7690.100ab0.8780.142a0.8230.084a xy0.8480.057a GK活性 Specific activity of GK(U) Control0.1260.050 Middle CHO0.1360.0860.1170.0660.1720.084 High CHO0.1480.0840.2220.0970.2380.1700.1720.1680.0320.019 PFK21活性 Specific activity of PFK2 1(U) Control0.1330.0430.1570.0370.1460.0270.1730.0250.1140.0140.1800.019 Middle CHO0.1330.0430.1410.0260.1670.0280.1370.0200.1590.0350.1640.020 High CHO0.1330.0430.1880.0510.2060.0470.1590.0250.2000.0370.1870.042 数据用平均值 标准误差表示(meanS. E,n=5) ;a ,b ,c ,d:相同行中带不同上标字母的表示差异显著(P 0. 05)。比较各组各时间点的HK和GK活 性发现,前者活性远大于后者。 PFK21 :鱼体的PFK21活性在各组间,以及同组 内摄食后各时间点间均无显著差异(P 0. 05)。 212 肝指数、 肝糖原和血糖的变化(表 3) 肝指数:对照组和中水平CHO组鱼体的肝指数 表3 摄食不同水平碳水化合物饲料后南方鲇肝指数、 血糖浓度和肝糖原含量的变化 Tab.3 The variations of hepatosomatic indexes、serum glucose and liver glycogen in the southern catfish after feeding three different CHO level diets 饲料Diet 时间Time(h) 036122448 肝指数 Hepatosomatic indexes( %) Control1.440.101.500.061.340.051.420.051.450.081.320.03y Middle CHO1.440.10b1.530.04ab1.460.11ab1.540.03ab1.540.06ab1.720.14a x High CHO1.440.10ab1.400.09ab1.260.05b1.590.07a1.620.07a1.590.07a xy 306 水 生 生 物 学 报30卷 续表 饲料Diet 时间Time(h) 036122448 肝糖原含量 Liver glycogen concentrations(mg/ g) Control62.708.75a42.624.47ab36.753.24by48.575.22aby47.789.98aby33.037.21by Middle CHO62.708.75b53.873.64b59.639.04bx65.793.46bx87.183.66ax85.445.48ax High CHO62.708.75cd46.508.27d49.607.97cdxy68.292.89bcx87.742.58abx97.089.70ax 血糖浓度 Serum glucose concentrations(mg/ mL) Control0.530.02a0.410.04b0.390.02by0.390.02by0.410.04bz0.470.04ab Middle CHO0.530.02bc0.430.01c0.610.06bx0.840.06ax0.570.03by0.510.05bc High CHO0.530.02c0.440.03c0.630.03bcx0.910.14ax0.800.07abx0.500.04c 数据用平均值 标准误差表示(meanS. E,n=5) ;a ,b ,c ,d:相同行中带不同上标字母的表示差异显著(P0.05) ;x,y,z:相同列中带不同上 标字母的表示差异显著(P0.05)。 The data were expressed as meanS. E,n= 5;a ,b ,c ,d:different superscripts in each row indicate significant differences among dietary treatments (P 0.05) ;x,y,z:different superscripts in each column indicate significant differences among dietary treatments (P0.05) 在摄食后48h内均无显著变化;高水平CHO组6h 的肝脂数显著低于该组在12、24和48h的值。 肝糖原:对照组肝糖原含量在摄食后48h内均 无显著变化;中水平CHO组在24h和48h的肝糖原 含量显著高于其余各时间点;高水平CHO组肝糖原 含量表现出从摄食后3h至48h显著上升的趋势。 血糖:对照组0h时血糖水平显著高于3、6、12 和 24h( P 0. 05) ,与48h无显著差异;中水平CHO 和高水平CHO组摄食后血糖均呈现先升高,12h时 达峰值,然后逐渐降低的趋势,中水平CHO组在12h 时的血糖显著高于该组其余各时点;高水平CHO组 12h时的血糖与24h时差异不显著,均显著高于其 余各时间点(P 0. 05)。比较摄食后相同时间点各 组间血糖发现,在6、12和24h ,中水平CHO和高水 平CHO组的血糖均显著高于对照组(P 0. 05) ,而 在其余时间点,三组间差异不显著。 3 讨论 311 饲料中CHO对葡萄糖磷酸化的影响 HK和GK均催化葡萄糖转化为葡萄糖- 6 -磷 酸,从而完成葡萄糖进入糖酵解过程的第一步生化 反应,它们的活性对维持动物体血糖动态平衡,增加 对糖的利用有重要意义12 ,22。 早期研究认为鱼体缺乏可诱导的GK8;但 Panserat等11 ,12和Caseras等10 ,23对 虹 鳟(On2 corhynchus mykiss)、 乌颊海鲷(Sparus aurata)和鲤 (Cyprinus carpio)的研究发现:饲料中添加CHO可诱 导鱼体产生GK。本研究测定了南方鲇肝脏中GK 活性(表2) ,发现随着CHO水平的增加,可测出的 GK活性的持续时间增加,对照组仅在3h时能测出 较低GK活性,中水平CHO组在3、6和12h能测出 GK活性,高水平CHO组在3到48h间均能测出GK 活性;高水平CHO组在24h的GK活性为对照组在 3h的活性的2倍以上。随CHO的摄入水平增加,南 方鲇适应性地增强了GK的活性,因此,本文的实验 结果支持Panserat等和Caseras等的观点。 在已有的关于CHO饲料诱导GK产生的研究 中,均以含CHO饲料将实验鱼驯养了较长时期,因 此认为诱导鱼体产生糖代谢酶需要20d以上的时 间24 ,25。但Panserat等发现鱼体摄食含CHO饲料 24h后的GK表达下降到了摄食前水平,认为GK仅 与摄食周期有关,由此推论鱼类摄食一次CHO饲料 即能诱导出GK,不必进行长期的驯养,但没有进一 步的实验验证。本研究发现各组南方鲇摄食后3h 均能迅速地产生 GK( 表2) ,从而在这种鱼上验证了 Panserat的推论,鱼体GK的表达可能是一种快速的 应激反应。 比较表2和表3的结果可以发现,中水平CHO 组血糖从摄食后3h升高,至12h达峰值,而GK活性 也随之升高至峰值,然后血糖显著降低至摄食前水 平,而GK活性随之消失;高水平CHO组血糖从摄食 后3h升高,至12h时达峰值后继续维持在较高水 平,直到48h才降低至摄食前水平,相应地GK活性 也随之在12h时达最高值,在24h时还维持在较高 水平,而到48h时则也降低至极低的水平。已有的 研究也发现GK活性的峰值随血糖峰值出现而出 现,GK主要在血糖水平较高时起催化作用11 ,26,当 血糖下降到摄食前水平时, GK也降到摄食前水 3期林小植等:饲料碳水化合物水平对南方鲇幼鱼餐后糖酵解酶活性及血糖浓度的影响307 平10 ,12。因此作者认为,GK活性是受进入体液的 食物糖分所诱导而激活,当血糖维持在基础水平以 上(本研究中,中水平CHO组612h ,高水平CHO 组6 24h) 时,GK活性较高,当血糖降至摄食前的 基础水平时,GK活性也降至极低水平而难以测出。 由表2可以看出,HK的活性在摄食后一直保持 较高水平,随时间变化不明显,并且其促进鱼体的葡 萄糖磷酸化的效应总量大大高于GK的作用。尽管 饲料CHO诱导了鱼体GK活性的增加,但各组的GK 活性仍远低于HK,仅为HK活性的0 %29 %(表 2) 。综上所述,可以得出两个结论(1)南方鲇体内葡 萄糖的磷酸化过程主要由HK催化,而其活性相对 稳定 ;(2) 食物中CHO水平的升高可以诱导GK活力 的上升而使葡萄糖磷酸化作用加速,但加速的效力 有限,最大增幅不超过30 %。该种鱼糖代谢的这两 个特征应当是肉食性鱼类只能有限地利用食物中的 CHO ,而在高水平CHO条件下,会产生高血糖特征 的重要原因。 312 饲料中CHO水平对鱼体肝糖原积累的影响 葡萄糖- 6 -磷酸也是肝糖原合成的前体底物, 许多研究发现鱼类摄食CHO后会导致肝糖原含量 增加8 ,27 ,28。本研究中,摄食不含CHO(对照组)的 实验鱼的肝糖原水平呈现下降趋势,而摄食中、 高水 平CHO饲料的实验鱼在24h后肝糖原含量均增加 至显著高于对照组水平(表 3) 。而我们同时还观测 到鱼体在摄食后其GK活性增强而PFK21活性无明 显升高(表2) ,因而可导致葡萄糖- 6 -磷酸的生成 量大于消耗量,促使其转化为糖原在肝脏中不断 累积。 在糖酵解途径中,经GK和HK磷酸化产生的葡 萄糖- 6 -磷酸转化为果糖- 6 -磷酸后,进一步被 PFK21催化为果糖1 ,6二磷酸继续进行酵解过程。 已有的研究发现,PFK21非常保守,其活性不受食物 CHO的诱导29,本研究中,南方鲇摄食后048h过 程中,高水平CHO组和中水平CHO组的PFK21活 性与对照组均无显著差异,PFK21活性不能随饲料 CHO水平及鱼体血糖水平的升高而升高,且远低于 HK+ GK活性,因此可以认为PFK21限制了南方鲇 摄食CHO后糖酵解速率的提高,从而成为鱼体在摄 入高CHO水平饲料后形成高血糖积累的又一机制, 这可能是对南方鲇利用CHO的另一个重要限制性 因素。 313 鱼体血糖峰值的出现时间 有关鱼类血糖的研究表明,摄食CHO饲料后血 糖浓度会升高,达到某个峰值,然后下降到初始水 平;峰值的高低与饲料中CHO水平在一定范围内呈 正相关关系,CHO水平越高,峰值越高26。本研究 中实验鱼体的血糖峰值与其饲料CHO水平也存在 这种正相关关系(表 3) 。 鱼类的食性、CHO的构型和剂量会影响摄食 CHO后 鱼 体 血 糖 峰 值 出 现 的 时 间 和 持 续 时 间6 ,8 ,26,许多鱼类摄食CHO饲料后,血糖峰值出 现的时间在28h1 ,3 ,30。本实验室曾对经过CHO 饲料驯养8周的南方鲇进行了餐后血糖浓度研究, 结果发现血糖峰值出现在餐后6h时16;而本研究 中未经过含CHO饲料驯养的南方鲇,初次摄食 CHO饲料后血糖峰值出现在12h时(表3) ,这表 明:在一定的CHO水平饲料条件下,随着驯养时间 越长,鱼体血糖峰值出现的时间将会提前。本研 究还发现,高水平CHO组血糖达峰值后下降明显 慢于中水平CHO组,到24h时,高水平CHO组的 血糖与峰值相比仍未显著降低,而中水平CHO组 已显著降低(P 0. 05) ,即饲料CHO水平越高,血 糖达峰值后维持高水平的时间越长。鱼类餐后血 糖的峰值水平应当对于相关实验处理的反应更为 敏感,因而前述讨论所提出的南方鲇血糖峰值出 现时间的变化规律,可以为确定血液取样时间提 供依据:建议在检测该种鱼餐后血糖时,将取样时 间定为餐后12h为宜。 参考文献: 1 Hutchins C G, Rawles SD , GatlinD M. Effectsof dietary carbo2 hydrate kind and level on growth , body composition and glycemic re2 sponse of juvenile sunshine bass J .Aquaculture ,1998 ,161:187 199 2 Shiau S Y. Utilizationof carbohydrates in warmwater fish2with partic2 ular reference to tilapia ,Oreochromis niloticusO. aureusJ . Aquaculture ,1997 ,151:7996 3 Lee S M, Lee J H. Effect of dietary glucose , dextrin and starch on growth and body composition of juvenile starry flounderPlatichthys stellatusJ .Fisheries Science ,2004 ,70:5358 4 Page G I , Hayworth KM, Wade R R ,et al. Non2specific immunity parameters and the formation of advanced glycosylation end2products (AGE) in rainbow trout ,Oncorhynchus mykiss(Walbaum) ,fed high levels of dietary carbohydrates J .Aquaculture Research ,1999 , 30(4) :287297 5 Nordrum S, Bakke2McKellep A M, Krogdahl A ,et al. 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