影响分光光度法检测藻类叶绿素a的因素.pdf

收稿日期: 2006- 08- 10 基金项目: 辽宁省水利厅项目( 05- 08- 37) 作者简介: 赵玉华( 1959- ), 女, 教授, 主要从事水处理理论与技术研究. 文章编号:1671- 2021(2007) 03- 0482- 03 影响分光光度法检测藻类叶绿素 a 的因素 赵玉华, 刘 畅, 薛 飞, 傅金祥 ( 沈阳建筑大学市政与环境工程学院, 辽宁 沈阳 110168) 摘 要: 目的 为检测藻类叶绿素 a 提供可借鉴的依据. 方法 采用玻璃离心管与塑料离心管, 待 测液样在分光光度计中稳定不同时间, 在叶绿素 a 提取过程中对液样加以冷藏的方法, 进行对 比试验. 结果 塑料离心管测得的水样叶绿素 a 值, 比用玻璃离心管测得的值平均高 30. 1%. 液 样在分光光度计中稳定时间 0 5 min 内, 叶绿素 a 值随稳定时间延长而提高, 5 min 以后提高 速度减缓. 冷藏时间在 6 h 以内, 叶绿素 a 值平均增加 1. 92 Lg#( L#h) - 1, 6 h 以后, 叶绿素 a 值 增加速度减缓. 结论 塑料材料对叶绿素 a 值测定有干扰作用, 采用塑料离心管测得的水样叶 绿素 a 值偏高, 建议用玻璃离心管. 待测液样在分光光度计中的稳定时间对藻类叶绿素 a 值的 测定有影响, 如果稳定时间过短, 会使测定结果偏低. 适合的稳定时间为 10 20 min, 在叶绿 素a 提取过程中, 将液样适当进行冷藏, 可使叶绿素a 充分溶解于溶液中, 适合的冷藏时间为 6 8 h, 供分光光度法检测藻类叶绿素 a 参考. 关键词: 藻类; 叶绿素 a; 分光光度法检测; 离心管材料 中图分类号: X832 文献标识码:A 水中藻类过量繁殖会使水透光性差, 影响水 生物生长繁殖1. 产生藻毒素, 危害生物及人类 健康 2- 4. 水中藻类的检测通常采用叶绿素 a 法 和显微计数法 5- 8. 国家环境保护局公布的5水 和废水监测分析方法6中规定, 叶绿素 a 的检测采 用分光光度法9. 在试验过程中发现, 规定的操 作过程与步骤不尽详细, 使得试验结果会产生一 定的误差. 比如, 水样离心所用的离心管材料、 测 定吸光度时待测液样在分光光度计中的稳定时间 等, 都未做说明. 因而, 笔者进行了离心管材料、 待 测液样稳定时间和叶绿素 a 提取过程中加以冷藏 的对比试验, 为藻类叶绿素 a 的检测提供可借鉴 的依据. 1 试验方法 111 试验仪器设备 抽滤装置( 2XZ- 0. 5 型旋片真空泵, 过滤器, 直径 35 mm、 0. 45 L m 微孔滤膜( 混合纤维) , 小研 钵( 配套研杵) , 台式离心机, 冰箱, 9 100 可见光 分光光度计. 112 试验用水 试验用原水取自沈阳建筑大学人工湖. 该湖 于2003 年注入地下水, 其作用除用做校园景观 外, 还兼养鱼类. 由于湖水流动性较差, 光照充足, 以及投放鱼食等营养物质, 造成藻类繁殖, 主要以 蓝藻为主, 湖面水呈绿色, 处于富营养化状态. 夏 季最高水温在 26 e 左右, 浊度 4. 0 6. 0 NTU, 高锰酸盐指数的质量浓度 8. 22 9. 45 mg#L- 1, pH 值 6. 55 左右. 113 水样采集 因为藻类基本接近水面的浅层水中生长繁 殖 1, 而且受光照条件和水温影响, 因而, 每天在 同一时间, 同一地点, 同一液面深度下采集原水水 样. 114 叶绿素 a测定过程 水样用滤膜过滤后, 将滤膜放在匀浆器或小 20 07 年 0 5月 第23卷 第 3 期 沈 阳 建 筑 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) Journal of Shenyang Jianzhu University (Natural Science) May 2007 Vol123,No13 研钵内, 加 90%的丙酮溶液 2 3 mL, 充分研磨, 提取叶绿素 a, 并将浆液移入离心管中, 放入冰箱 冷藏一定时间, 以使叶绿素 a 充分提取出来, 温度 保持在 4 e . 提取完毕后, 以 3 500 r/ min 转速离 心分离 10 min. 重复提取过程( 不需再冷藏) 和离 心过程 1 次. 将浆液移入比色皿内, 放入分光光度 计稳定一定时间, 分别在 750 nm、 663 nm、 645 nm、 630 nm 波长下测提取液的吸光度. 用下式计 算叶绿素 a 值. Q ( 叶绿素 a) = 11. 64( OD663- OD750) - 2. 16 ( OD645- OD750) + 0. 1( OD630- OD750) 式中, OD 为吸光度. 在叶绿素 a 测定过程中, 还需要注意以下几 点. ( 1) 在将离心管放入离心器中进行离心时, 要 注意离心管对称放置, 譬如: 1- 3- 5, 2- 4- 6. 否 则, 会引起离心不均匀, 同时会对离心器产生一定 的破坏. ( 2) 在进行水样抽滤时, 需注意抽滤压力不高 于相当 150 mm 汞柱的压力, 否则, 过大的压力会 破坏藻细胞, 从而带来叶绿素 a 测值的失真10. 并且抽滤要在一个避光性好的室内操做, 并尽快 完成, 避免将叶绿素暴露在不必要的光中. 2 试验结果讨论 211 离心管材料的影响 分别采用塑料离心管和玻璃离心管, 对水样 提取液进行离心分离, 以探讨离心管材料对测定 结果的影响. 测得的叶绿素 a 值如图 1 所示. 从图 中可以看出, 采用塑料离心管测得的水样叶绿素 a值, 始终高于同样条件下采用玻璃离心管测得 的叶绿素 a 值, 误差在 21. 0% 43. 6% 之间, 平 均误差 30. 1%. 说明塑料离心管与提取液中的成 分发生了某种化学反应, 严重干扰了叶绿素 a 值 的测定结果. 因为丙酮对塑料具有腐蚀性, 因此, 在离心分离过程中, 含有丙酮的提取液溶入了离 心管材料成分, 使测定结果偏高. 212 稳定时间的影响 将盛有待测溶液的比色皿放入分光光度计 中, 在不同的稳定时间下读取吸光度, 以确定适合 的稳定时间. 测得的水样叶绿素 a 值见图 1. 从图 1中可以看出, 叶绿素 a 随着稳定时间的延长而 增大. 在 0 5 min 时段, 叶绿素 a 值变化幅度较 大, 相差 49. 4%; 5 25 min 时段, 叶绿素 a 值变 化幅度减小, 差值在 5% 以下, 逐渐趋于稳定. 但 由于丙酮具有挥发性, 如果稳定时间过长, 一旦被 检测液的液面高度低于比色皿高度的 2/ 3, 也会 使测定结果准确度下降. 图 1 叶绿纱 a 值与离心管材料和稳定时间关系 213 冷藏时间的影响 在叶绿素 a 提取过程中, 采用不同冷藏时间 进行对比, 以使叶绿素 a 能完全从藻细胞中分离 出来, 进入溶液中. 将过滤后的滤膜加丙酮溶解, 然后将水样转移到离心管中, 外部罩上避光物放 入冰箱内, 开始计时, 到将离心管从冰箱中取出的 时刻结束, 这段时间定义为冷藏时间. 温度保持在 4 e . 不同冷藏时间条件下测得的叶绿素 a 值见 图2. 在冷藏时间为 0 6 h 时段, 随着冷藏时间的 延长, 叶绿素 a 值提高很快, 从 15. 27 L g#L- 1增 至 24. 85 L g # L - 1, 增 加 67. 7%, 平均 增 加 1. 92 Lg#( L#h) - 1; 在 6 24 h 时段, 增长趋势变 缓, 增加 7. 44%, 平均增加 0. 10 L g#( L#h) - 1, 叶 绿素 a 值基本趋于稳定. 图 2 叶绿素 a 值与冷藏时间的关系 3 结 论 ( 1) 由于塑料材料对叶绿素 a 值测定有干扰 作用, 采用塑料离心管测得的水样叶绿素 a 值偏 高, 建议采用玻璃离心管进行含水藻类叶绿素 a 值测定的离心操作. 第 23 卷赵玉华等: 影响分光光度法检测藻类叶绿素 a 的因素 483 ( 2) 待测液样在分光光度计中的稳定时间对 藻类叶绿素 a 值的测定有影响, 如果稳定时间过 短, 会使测定结果偏低. 建议稳定时间至少 5 min, 适合的稳定时间为 10 20 min. ( 3) 在叶绿素 a 提取过程中, 将液样适当进行 冷藏, 可使叶绿素 a 充分溶解于溶液中, 随着冷藏 时间的延长, 测定的藻类叶绿素 a 值增加. 适合的 冷藏时间为 6 8 h. 参考文献: 1 黄萌. 富营养化对水生生态系统的污染生态效应 J. 科技情报开发与经济, 2006, 16( 20) : 137- 138. 2 Paerl H W, Fulton RS 3rd, Moisander P H, et al. Harmful freshwater algal blooms, with an emphasis on cyanobacteria J . Scientific World Journal, 2001, 4 ( 1) : 76- 113. 3 Duy T N, Lam P K S, Shaw G R, et al. Toxicology and risk assessment of fresh - water cyanobacterial ( blue- green algae) toxins in water J . Rev Environ Contam Toxicol, 2000(163): 113- 186. 4 Zhang M M, Pan U, Yan H, et al. A method to ex- tract algae toxin of microcystin- LR J. Environ Sci. ( China) , 2004, 16(4) : 694- 696. 5 Gregor J, Marsalek B. Freshwaterphytoplankton quantification by chlorophyll- a: a comparative study of in vitro, in vivo and in situ methodsJ. Water Re - search, 2004, 38(3): 517- 522. 6 Pinto A, Von Sperling E, Moreora R. Chlorophyll- a determination via continuous measurement of plank- ton fluorescence: methodology developmentJ. Water Research, 2001, 35(16) : 3977- 3981. 7 贺小芮, 周俊杰. 倒置显微镜计数法检测浮游藻类 J . 中国给水排水, 2004, 20(11) : 98- 100. 8 韩桂春, 谷丰, 张忠臣. 淡水中叶绿素 a 测定方法的 探讨 J . 中国环境检测, 2005, 21(1): 55- 57. 9 国家环境保护局, 5水和废水监测分析方法6编委 会. 水和废水监测分析方法M . 北京: 中国环境科 学出版社, 2002. 10 张新, 刘洪林, 王素芬. 分光光度法测定叶绿素 a 含 量的方法探讨 J . 山东水利, 2002(3): 39- 40. Test of Factors Influencing Chlorophyl- l a in Water Algal by Spectrophotometry ZHA O Yuhua, LIU Chang, X UE Fei, FU Jinxiang ( School of Municipal and Environmental Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang 110168, China) Abstract: In the paper chlorophyl- l a in water algal is measured by spectrophotometry. Glass centrifuge tube and plastic centrifuge tube are used for separateing algal from water. The fluid sample is deepfrozen in re - frigeratory under 4e for different time during separating chlorophyl- l a from algal.After the fluid sample is put in spectrophotometer for different time, which is called stabilization time, the absorbency of the sample is taken. The test result indicates that chlorophyl- l a of fluid sample measured through plastic centrifuge tube is averagely higher by 30. 1% than glass tube because of plastic disturbance. If stabilizing for less than 5 minutes chlorophyl- l a of